CC BY
34
УДК 615.849.19:577.352.2:615.831.03
M. A. Kortava, N. A. Oborotova , G. A. Meerovich2,1. G. Meerovich1, A. P. Polozkova1, E. V. Ignatyeva1, L. M. Borisova1, M. P. Kiseleva1, Z. S. Smirnova1, A. Yu. Baryshnikov1
VALUE OF ABSORPTION COEFFICIENT FOR THE EFFECT OF TWO DRUG FORMS OF rHOTOSENSE ON TREATMENT OF BREAST ADENOCARCINOMA СА 755
!N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow Natural Sciences Center of A. M. Prokhorov General Physics Institute RAS, Moscow
ABSTRACT
The aim of this paper is to examine the effect of sterically stabilized liposomal form and solution of the photosense in response to alteration of wavelengths of a laser irradiation on photodynamic therapy of mice with breast adenocarcinoma Са 755.The effectiveness of photodynamic therapy was examined at wavelengths 671, 678, 687 nm. The results obtained indicate that the best therapeutic effect was at 671 and 687 nm despite the fact that the maximun absorption was estimated at 678 nm.
Key words: absorption spectrum, wavelength, laser irradiation, sterically stabilized liposomes, photodynamic therapy.
М. А. Кортава1, Н. А. Оборотова1, Г. А. Меерович2, И. Г. Меерович1, А. П. Полозкова1, Е. В. Игнатьева1, Л. М. Борисова1, М. П. Киселева1, З. С. Смирнова1, А. Ю. Барышников1
ЗНАЧЕНИЕ КОЭФФИЦИЕНТА ПОГЛОЩЕНИЯ ДЛЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ПРИ ЛЕЧЕНИИ АДЕНОКАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ СА 755 У МЫШЕЙ ДВУМЯ ЛЕКАРСТВЕННЫМИ ФОРМАМИ ФОТОСЕНСА
1ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва 2ЦЕНИ ИОФ им. А. М. Прохорова РАН, Москва
РЕЗЮМЕ
Работа посвящена оценке эффективности стерически стабилизированной лекарственной липосомаль-ной формы (ССЛЛФФ) и раствора фотосенса в фотодинамической терапии у мышей с подкожно перевитой аденокарциномой молочной железы Са 755 в зависимости от длины волны (671; 678 и 687 нм) лазерного облучения.
Установлено, что наилучший терапевтический эффект на аденокарциноме молочной железы Са 755 наблюдается при лазерном облучении с длиной волны 671 нм и 687 нм.
Ключевые слова: спектр поглощения, длина волны, лазерное облучение, стерически стабилизированные липосомы, фотодинамическая терапия.
ВВЕДЕНИЕ
Наряду со свойствами и дозой лекарственного препарата - фотосенсибилизатора, важнейшее влияние на механизмы и эффективность фотодинамической терапии (ФДТ) оказывают характеристики лазерного излучения. В ряде отечественных работ изучалось влияние плотности мощности и дозы
возбуждающего света, а также временного интервала между введением производных фталоцианина и облучением на механизмы повреждения опухоли Эрлиха [3; 7].
За рубежом изучение фотодинамического действия дисульфированного фталоцианина алюминия (А182Рс) на мышах с фибросаркомой МБ2 и пигмен-
тированной меланомой В16 показало, что важную роль играет выбор длины волны терапевтического излучения в пределах спектрального контура поглощения фотосенсибилизатора [5].
В ФГУП «ГНЦ «НИОПИК» для ФДТ и флюоресцентной диагностики рака разработан препарат на основе фталоцианинов - фотосенс (Р.№ 000199-2001).0н обладает интенсивной полосой поглощения в красной области спектра с максимумом в водном растворе Х=676 нм. Высокая противоопухолевая активность фотосенса при применении его в виде водного раствора сопровождается высокой кожной фоточувствительностью, обусловленной длительным удерживанием препарата в коже.
Важным направлением повышения эффективности ФДТ, снижения токсичности и побочных эффектов метода является повышение избирательности действия фотосенсибилизаторов путем разработки новых видов транспортных систем доставки препарата к терапевтическим мишеням.
В ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН разработана липосомальная лекарственная форма фотосенса, позволившая снизить терапевтическую дозу препарата в 4 раза и уменьшить уровень накопления фотосенса в коже [4]. Однако фармакокинетические исследования показали, что эта липосомальная форма быстро инактивируется РЭС. Поэтому продолжается совершенствование липосомальной лекарственной формы фото-сенса путем ее пространственной стабилизации, затрудняющей захват препарата макрофагами РЭС [1].
Целью настоящей работы являлась оценка противоопухолевой эффективности стерически стабилизированной лекарственной липосомальной формы фото-сенса (ССЛЛФФ) и раствора фотосенса в зависимости от длины волны лазерного облучения при проведении фотодинамической терапии у мышей с подкожно перевитой аденокарциномой молочной железы Са 755.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Фотосенс синтезировали в ФГУП «ГНЦ «НИО-ПИК». Липосомы получали путем диспергирования 1%-ным раствором фотосенса тонкой липидной пленки, образованной упариванием в вакууме на роторном испарителе хлороформного раствора липидов. Дисперсию многослойных липосом измельчали на экструдере «Avanti Mini-Extruder», последовательно пропуская дисперсию через фильтры «Nucleopore» с размерами пор 0,4; 0,2 и 0,1 мкм. Средний размер липосом измеряли на приборе Submicron Particle Sizer NIC0MP-380. Для очистки липосомальной дисперсии от не включенного в липосомы фотосенса использовали метод колоночной хроматографии (гель-фильтрацию) [1; 6]. В качестве сорбента использовали Sephadex G-50 s^erRne.
Эффективность ФДТ оценивали на мышах с подкожно перевитой аденокарциномой молочной железы Са 755. Опухоли перевивали мышам-гибридам 1-го поколения BDF j подкожно в область бедра в виде суспензии по 0,1 мл, содержащей 500 тыс. опухолевых
клеток в среде 199. Фотосенсибилизаторы (водный раствор фотосенса и/или ССЛЛФФ) вводили мышам однократно внутривенно на 5-й день после перевивки опухоли в дозе 2 мг/кг. При этом объем опухолевого узла, определяемый по формуле:
V = а х Ь х с,
где а, Ь, с - линейные размеры опухоли, составлял
0,6-0,8 см3. Облучение проводили через 5 ч после введения препаратов лазером ЛФТ-630/670-01-БИОСПЕК через кожные покровы при длинах волн 671нм; 678 нм и 687 нм, мощность облучения 100 мВт/см2, время облучения 15 мин. Поглощение фото-сенса в опухолях исследуемых мышей оценивали методом диффузного рассеяния [3].
Эффективность ФДТ определяли по торможению роста опухоли (ТРО, %) в разные сроки наблюдения.
Торможение роста опухоли вычисляли по формуле:
ТРО (%) = (Ук - Vо) / Vк х 100,
где:
ТРО - торможение роста опухолей;
Ук - средний объем опухолей в контрольной группе;
Уо - средний объем опухолей в опытной группе.
Опытные группы формировали из 5-6 мышей, а контрольную - из 8-10 особей.
Статистическую обработку полученных результатов проводили по методу Стьюдента. Разницу считали достоверной при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведенного исследования обнаружено, что, в отличие от дисульфированного фтало-цианина алюминия (А^2Рс) с максимумом спектрального поглощения 672 нм [5], для фотосенса максимум спектрального поглощения в биологической ткани наблюдается при несколько больших значениях длины волны (около 678 нм) (см. рисунок).
Абсолютные значения коэффициента поглощения для фотосенса в максимуме оказались достаточно высокими (примерно 0,7 см-1). Столь высокое поглощение фотосенсибилизатора может привести к заметной неоднородности распределения фотодинамического эффекта на разную глубину освещаемой лазером поверхности, оказывая заметное влияние на эффективность использования энергии светового облучения и как следствие - на эффективность ФДТ [2].
Для опыта использовали 7 групп мышей с аденокарциномой молочной железы Са 755, по 3 группы для введения ССЛЛФФ и раствора фотосенса в дозе 2 мг/кг. 7-я группа животных была контрольной. Опухоли мышей облучали лазером с одинаковой плотностью мощности излучения (100 мВт/см2), но с разными длинами волн (671; 678 и 687 нм соответственно).
Обнаружено, что в группах, в которых опухоли облучались при длине волны 671нм и 687 нм, незави-
симо от вида лекарственной формы, ТРО было выше, чем в группах, облучение в которых осуществлялось при длине волны 678 нм, соответствующей максимуму поглощения фотосенса. Так, наилучший терапевтический эффект на 10-й день после лечения с ССЛЛФФ наблюдался при лазерном облучении с длиной волны 671 нм и 687 нм (ТРО = 50 % и 47 %), а при длине волны 678 нм ТРО составило только 23 % (табл. 1).
[2] модель, согласно которой на опухолях большой толщины (средняя толщина используемых в этом опыте опухолей составляла 9 мм) сильное поглощение фотосенсибилизатора в верхних слоях опухоли, прилегающих к коже, приводит к тому, что энергия облучения нижних, наиболее удаленных от облучаемой поверхности слоев оказывается недостаточной, из-за чего там продолжается рост опухоли, и терапевтический эффект снижается.
Таблица 1
Эффективность ФДТ с ССЛЛФФ при разной длине волны лазерного облучения
Воздействие Дни после проведения ФДТ
7 10
Объем опухоли, мм3 ТРО, % Объем опухоли, мм3 ТРО, %
Контроль, мм3 16093±260,9 - 20425±1504,3 -
ССЛЛФФ (2 мг/кг), длина волны 671 нм 4327±964,5* 73 10133±2708,8* 50
ССЛЛФФ (2 мг/кг), длина волны 678 нм 6804±457,0* 58 15633±949,6* 23
ССЛЛФФ (2 мг/кг), длина волны 687 нм 5431±169,5* 66 11081±760,5* 47
р<0,05 по отношению к контрольной группе
Такая же картина наблюдалась и с раствором фо-тосенса, где терапевтический эффект при облучении с длиной волны 671нм и 687 нм (ТРО = 63 % и 34 % соответственно) превосходил эффект облучения с длиной волны 678 нм (ТРО = 23 %) (табл. 2).
Причины наблюдаемого явления не ясны и требуют дальнейшего изучения. Однако для объяснения вполне может быть использована и предложенная в
Поскольку спектральный максимум поглощения фотосенса во всех группах наблюдался при 678 нм, а на длине волны 671 и 687 нм поглощение было меньшим (см. рисунок), соответственно экранировка нижних слоев опухолей верхними при облучении на этих длинах волн оказалась менее значительной, что и обеспечило более эффективное терапевтическое воздействие на всю опухоль и более высокие значения ТРО.
Таблица 2
Эффективность ФДТ с водным раствором фотосенса при разной длине волны лазерного облучения
Воздействие Дни после проведения ФДТ
7 10
Объем опухоли, мм3 ТРО, % Объем опухоли, мм3 ТРО, %
Контроль, мм3 16093±260,9 - 20425±1504,3 -
Раствор фотосенса, длина волны 671 нм 5581±410,3* 79 7549±2308,5* 63
Раствор фотосенса, длина волны 678 нм 6383±2109,6 60 15718±1429,1* 23
Раствор фотосенса, длина волны 687 нм 3399±826,2* 65 13466±1205,6* 34
р<0,05 по отношению к контрольной группе
Длина волны, нм
Спектр поглощения раствора фотосенса в опухоли Са 755 через 3 ч после введения в дозе 2 мг/кг:
сплошной вертикальной линией отмечена длина волны 678 нм, пунктирами - 671 нми и 687 нм.
ВЫВОДЫ
Эффективность фотосенса (ССЛЛФФ и/или водного раствора) в ФДТ зависит от длины волны лазерного облучения: при длине волны 671 нм ТРО = 50 % и 63 % соответственно, при длине волны 687 нм ТРО = 47 % и 34 %, а при длине волны 678 нм эффективность снижается до 23 % как для ССЛЛФФ, так и для водного раствора фо-тосенса.
Наблюдаемая зависимость может быть объяснена экранированием сенсибилизированными слоями опухоли, расположенными ближе к облучаемой поверхности, ее более глубоких слоев.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кортава М. А., Рябова А. В., Игнатьева Е. В. и др. Изучение эффективности включения фотосенса в пространственно стабилизированные липосомы // РБЖ. - 2005. - Т. 4, № 4. - С.96-101.
2. Меерович И. Г., Меерович Г. А., Оборотова Н. А., Барышников А. Ю. Распределение света по глубине опухолевого очага и эффективность использования терапевтического излучения при фотодинамической терапии // РБЖ. - 2006. - Т. 5, № 3. - С. 93-7.
3. Меерович И. Г., Стратонников А. А., Рябова А. В. и др. Исследование оптического поглощения сенсибилизаторов в биологических тканях // РБЖ. -2004. - Т. 3, № 3. - С. 37-42.
4. Смирнова З. С., Кубасова И. Ю., Макарова О. А. и др. Доклиническое изучение эффективности липосо-мальной лекарственной формы фотосенса для фотодина-мической терапии // РБЖ. - 2003. - Т. 2, № 4. - С. 40-4.
5. Canti G., Lattuada D., Leroy E. et al. Action spectrum of phothoactivated phthalocyanine AlS2Pc in tumor bearing mice // Anti-Cancer Drugs. - 1992. - Vol. 3. - P. 139-42.
6. Gabrielle-Madelmont C., Lesieur S., Ollivon M. Characterization of loaded liposomes by size exclusion chromatography // J Biochem Biophys Methods. - 2003. - Vol. 56. - P. 189-217.
7. Gennady A. Meerovich, Alexander A. Stratonnikov, Victor B. Loshenov et al. Influence of parameters of laser irradiation on the mechanisms of tumours damage due to PDT // Procceding of SPIE. - 2001. - Vol. 4248. - P. 97-106.
Поступила 21.11.2006.
