CC BY
68
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ... 55
УДК 615.831:577.352.2
З.С. Смирнова1, Е.В. Санарова1, Л.М. Борисова1, М.П. Киселева1, НА. Оборотова1, О Л. Орлова1,
А .П. Полозкова1, Г А. Меерович2, ЕА. Лукьянец
ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ С ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМОЙ ТИОСЕНСА НА ПЕРЕВИВАЕМЫХ ОПУХОЛЯХ МЫШЕЙ
гРОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 2Институт общей физики им. А.М. Прохорова РАН, Москва 3ФГУП «ГНЦ «НИОПИК», Москва
Контактная информация:
Санарова Екатерина Викторовна, лаборант-исследователь лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО
адрес: 115478, Каширское ш., 24; тел. +7(495)324-0200 e-mail: sanarova8686@mail.ru
Статья поступила: 22.09.2011, принята к печати 25.10.2011
Резюме
Изучена противоопухолевая активность ФДТ с использованием ЛЛЛФ фотосенсибилизатора Тиосенса -ближнего инфракрасного диапазона на пяти перевиваемых опухолях мышей. Наиболее чувствительными опухолями к ФДТ с ЛЛЛФ Тиосенса являются: опухоль Эрлиха, солидный вариант лимфоцитарной лейкемии Р-388 и саркома 37, на которой высокое торможение роста опухоли сочетается с излечением 33,3 % животных.
Ключевые слова: фотодинамическая терапия, ЛЛЛФ фотосенсибилизатора Тиосенса, противоопухолевая активность.
Z.S. Smirnova1, E.V. Sanarova1, L.M. Borisova1, M.P. Kiseleva1, N.A. Oborotova1, O.L. Orlova1,
A.P. Polozkova1, G.A. Meerovich2, ЕА. Lukyanetz3
ANTITUMOR ACTIVITY OF PHOTODYNAMIC THERAPY
WITH LIPOSOMAL FORMULATION OF TIOSENS
ON THE TRANSPLANTABLE TUMORS ОF MICE
1N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
2A.M. Prokchorov General Physics Institute of Russian Academy of Sciences, Moscow
3State Research Center «NIOPIK», Moscow
Abstract
Studied antitumor activity of PDT with the use of FLDF of photosensitizer Tiosens - near-infrared range on the
5 transplantable tumors оf mice. The most sensitive tumors to PDT with FLDF of Tiosens are: tumor Ehrlich, a solid form leukemia P-388 and sarcoma 37, on which high inhibition of the tumor growth is combined with the recovery of 33,3 % of the animals.
Key words: photodynamic therapy, FLDF of photosensitizer Tiosens, antitumor activity.
Введение
Фотодинамическая терапия - метод лечения злокачественных опухолей, основанный на способности фотосенсибилизаторов селективно накапливаться в ткани опухоли и при локальном воздействии лазерного облучения определенной длины волны генерировать образование синглетного кислорода и активных радикалов, оказывающих повреждающее действие на опухолевые клетки [8; 10; 13]. Эффективность фотодинамического повреждения сенсибилизированной клетки определяется внутриклеточной концентрацией сенсибилизатора, его локализацией в клетке и фотохимической активностью (квантовым выходом генерации синглетного кислорода или свободных радикалов), дозой лазерного облучения. Кроме прямого цитотоксического воздействия на опухолевые клетки при ФДТ важную роль в противоопухолевом действии играют: нарушение кровоснабжения за счет повреждения и/или тромбоза кровеносных сосудов опухолевой ткани; цитокиновые реакции, связанные с повышенной продукцией фактора некроза опухоли, активацией макрофагов, лейкоцитов и лимфоцитов.
Одним из недостатков метода ФДТ с большинством ФС, созданных до настоящего времени, является кожная фототоксичность, связанная с длительным сохранением высокой концентрации ФС в коже, что требует соблюдения пациентом «темнового» режима в течение определенного времени. Этот недостаток дает основание для создания ФС, обладающих такими свойствами, как низкая темновая и световая токсичность, высокая селективность накопления в тканях новообразований, быстрое выведение из организма, высокий квантовый выход триплетного состояния с энергией не менее 94 кДж/моль для эффективного образования синглетного кислорода, интенсивный максимум поглощения света в области 700-900 нм, что обеспечивает более глубокое проникновение света и повреждение опухоли [2; 9]. Одним из ФС второго поколения, обладающих большинством из перечисленных свойств, является Тиосенс - тетра-3-фенилтиофталоцианин алюминия гидроксида, синтезированный в ФГУП «ГНЦ «НИОПИК» [6]. Как большинство фталоцианиновых ФС Тиосенс накапливается в основном в митохондриях [9; 14] опухолевых клеток и при облучении лазером с определенной длиной волны (717+4 нм) вызывает их повреждение.
Область поглощения света Тиосенсом позволяет говорить о большей глубине проникновения лазерного излучения в ткань опухоли по сравнению с другими фталоцианиновыми ФС, что делает его перспективным препаратом для ФДТ [7; 11]. Но применение данного препарата ограничено наличием гидрофобных свойств, которые не позволяют вводить его внутривенно.
Преодолеть это препятствие позволяет применение специальных систем доставки [12]. В качестве таких систем используют липосомы, которые не только позволяют преодолеть нерастворимость препарата в воде, но также способствуют сохранению его в мономерном фотодинамически активном состоянии, что увеличивает селективность накопления препарата в опухоли и снижает кожную чувствительность.
Материалы и методы
Работа выполнена на мышах-гибридах первого поколения ВОР1 (С57 В1/6 х ОБЛ/2), Р1 (С57 В1/6 х СВЛ) и беспородных мышах, самках и самцах, массой 20-25 г. Мышей получали из отдела лабораторных животных РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН и содержали на обычном рационе питания.
Тиосенс, представляющий собой тетра-3-фенилтиофталоцианина гидроксиалюминия, не растворимый в воде, синтезирован во ФГУП «ГНЦ «НИОПИК», ЛЛЛФ Тиосенса разработана в лаборатории разработки лекарственных форм РОНЦ им.
Н.Н. Блохина РАМН.
Исследования эффективности ФДТ с ЛЛЛФ Тиосенса проводили на опухоли Эрлиха, солидном варианте лимфоцитарной лейкемии Р-388, эпидер-моидной карциноме легкого Льюис, аденокарциноме молочной железы Са-755 и саркоме 37 [5]. Опухоль Эрлиха перевивали мышам-гибридам Рь Р-388
- мышам-гибридам ВОР1, саркому 37 - беспородным мышам внутримышечно в область голени асцитной жидкостью по 0,1 мл, содержащей 106 опухолевых клеток. ЬЬС и Са-755 перевивали мышам-гибридам ВОР1 внутримышечно в область голени по 0,2 мл, измельченной до гомогенной консистенции и разбавленной средой 199 до соотношения 1:10 опухолевой ткани.
На 4-6 день после перевивки, когда объем опухолевого узла составлял 700-900 мм3, флакон ЛЛЛФ Тиосенса разводили 5,8 мл воды для инъекций и вводили мышам однократно внутривенно в дозе 6 мг/кг.
Через 5 ч проводили облучение опухоли лазером «ЛФД-730-01-БИ0СПЕК» с длиной волны 720 нм и режимом облучения 400 мВт/см2 в течение 20 мин.
Критериями оценки противоопухолевой активности служили: торможение роста опухоли (ТРО, %) и увеличение продолжительности жизни (УПЖ, %) подопытных животных по сравнению с контрольными [3]. Торможение роста опухоли вычисляется по формуле:
7РО(%) = (Ук ~ Уо° X100, где Ук
Ук - средний объем опухолей в контрольной группе (мм3);
У о - средний объем опухолей в опытной группе (мм3).
Увеличение продолжительности жизни (УПЖ, %) вычисляется по формуле:
УПЖ% = (СПЖ - СПЖ x 100, где
СПЖк
СПЖк - средняя продолжительность жизни животных в контрольной группе (дни);
СПЖо - средняя продолжительность жизни животных в опытной группе (дни).
Минимальные критерии активности - торможение роста опухоли >50 %, увеличение продолжительности жизни >25 %.
Учитывая, что лечение мышей начинали через 5 ч после введения ЛЛЛФ Тиосенса и проводили в течение 20 минут, опытные группы формировали из 6 мышей, а контрольную группу - из 8-10 животных. Опыт повторялся трижды, а результаты эффективности представлены средние.
Статистическая значимость противоопухолевого эффекта ЛЛЛФ Тиосенса по отношению к контролю определялась по методу Фишера - Стьюдента. Различия между сравниваемыми группами считались статистически достоверными при р <0,05.
Получение липосомальных препаратов представляет собой сложный технологический процесс. На первом этапе получали однородную полупрозрачную липидную пленку путем растворения всех компонентов лекарственной формы: субстанции Тиосенса, яичного лецитина, холестерина и ПЭГ-2000-фосфатидилэтаноламина в хлороформе в круглодонной колбе с последующим отгоном растворителя при температуре фазового перехода липидов (+37 °С) на роторном испарителе BUCHI Rotavapor R-200 [4]. Далее образовавшуюся пленку сушили под вакуумом 30-50 мин и гидратировали деионизированной водой. Проводили предфильт-рацию полученной дисперсии мультиламеллярных везикул через фильтр с размером пор 1,2 мкм (размер липосом составил 605+10 нм). После этого измельчали на микрофлюидайзере в течение 8 мин (объем загрузки 300 мл). К полученной дисперсии приливали водный раствор криопротектора (сахароза), а для удаления не включившегося препарата и стерилизации проводили фильтрацию последовательно через фильтры с размером пор 0,45 и 0,22 мкм (размер липосом составил 120 + 20 нм). На всех стадиях проводили измерение размера везикул на наносайзере Nicomp 380 Submicron Particle Sizer. Количественное содержание Тиосенса в ЛЛЛФ определяли спектрофотометрически с использованием РСО при длине волны 717+4 нм. Для стабилизации водной липосомальной дисперсии проводили лиофильную сушку на установке Edwards Minifast.
Результаты и обсуждение
Данные представленные на рис. 1 показывают, что ФДТ с ЛЛЛФ Тиосенса проявляет достаточно высокий противоопухолевый эффект на опухоли Эрлиха. Статистически значимый противоопухолевый эффект, равный 56 % ТРО, выявляется уже на 7 день после лазерного облучения и длится до 27 дня (ТРО=70 %). Максимальный терапевтический эффект наблюдается на 14 день после лазерного облучения и составляет 76% ТРО. Эти данные свидетельствуют о длительном, в течение 20 дней, терапевтическом эффекте ФДТ с ЛЛЛФ Тиосенса на опухоли Эрлиха. Однако следует отметить, что статистически значимого увеличения продолжительности жизни опытных мышей по сравнению с контрольными животными ни в одном опыте не наблюдается.
Рис. 1. Терапевтическая эффективность ФДТ с ЛЛЛФ Тиосенса в дозе 6 мг/кг при предварительным введении за 5 ч до лазерного облучения при плотности мощности 400 мВт/см2 в течение 20 мин на опухоли Эрлиха. (*р<0,05 по отношению к контролю).
Рис. 2. Динамика торможения роста лимфоцитарной лейкемии Р-388 после ФДТ с ЛЛЛФ Тиосенса, введенной в дозе 6 мг/кг внутривенно за 5 ч до проведения лазерного облучения на 4 день опыта с параметрами облучения 400 мВт/см2 в течение 20 мин. (*р<0,05 по отношению к контролю).
Дни после облучения
Рис. 3. Динамика торможения роста LLC после ФДТ с ЛЛЛФ Тиосенса, введенной в дозе б мг/кг внутривенно за 5 ч до проведения лазерного облучения на б день опыта с параметрами облучения 400 мВт/см2 в течение 20 мин. (*p<0,05 по отношению к контролю).
58 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ...
Рис. 4. Динамика торможения роста Са-755 после ФДТ с ЛЛЛФ Тиосенса, введенной в дозе 6 мг/кг внутривенно за 5 ч до проведения лазерного облучения на 6 день опыта с параметрами облучения 400 мВт/см2 в течение 20 мин. (*р<0,05 по отношению к контролю).
Рис. 5. Динамика торможения роста саркомы 37 после ФДТ с ЛЛЛФ Тиосенса, введенной в дозе 6 мг/кг внутривенно за 5 ч до проведения лазерного облучения на 6 день опыта с параметрами облучения 400 мВт/см2 в течение 20 мин. (*р<0,05 по отношению к контролю).
При солидном варианте лимфоцитарной лейкемии Р-388 терапевтический эффект ФДТ с ЛЛЛФ Тиосенса проявляется уже на 3 день после лазерного облучения и составляет 70 % ТРО, а к 7 дню противоопухолевый эффект возрастает до 76 % ТРО (рис. 2). Быстрая генерализация опухолевого процесса у мышей с лимфоцитарной лейкемией Р-388 не позволяет нам выявить максимальный эффект по критерию торможения роста опухоли. Статистически значимого УПЖ на этой модели опухолевого роста также не наблюдается.
ФДТ с ЛЛЛФ Тиосенса вызывает умеренный, но длительный противоопухолевый эффект у мышей с ЬЬС (рис. 3).
Так на 7 день после лазерного облучения ТРО составляет 59 %, а на 23 день - 53 %. Максимальный терапевтический эффект наблюдается на 14 день после лазерного облучения и составляет 70 % ТРО.
ФДТ с ЛЛЛФ Тиосенса на Са-755 оказывает умеренный и кратковременный терапевтический эффект (рис. 4). Через 3 дня после проведения ФДТ противоопухолевый эффект составляет 74 %, который затем постепенно начинает снижаться, и статистически значимый терапевтический эффект равный 52 % ТРО наблюдается на 7 день после лазерного облучения. При изучении эффективности ФДТ с ЛЛЛФ Тиосенса на саркоме 37 показано, что, начиная с 4 дня после лазерного облучения, ТРО начинает постепенно расти с 32 % (рис. 5). На 8 день после ФДТ торможение роста саркомы 37 достигает статистически достоверных значений - 52 %, а максимальное ТРО наблюдается на 31 день и составляет 94 %. В связи с гибелью контрольных мышей далее проследить за динамикой торможения роста опухоли было не возможно. Однако в процессе наблюдения за мышами с саркомой 37 в опытной группе 2 из 6 мышей были излечены (33,3 %).
Ранее полученные результаты исследования уровня и селективности накопления липосомальной лекарственной формы Тиосенса определяются в основном размерами липосом [1]. Оптимальный размер составляет около 100+10 нм. Более крупные липосо-мы менее эффективно проникают через дефекты сосудов опухолей. Эти данные дают основание предполагать, что разная эффективность ФДТ с ЛЛЛФ Тиосенса на перевиваемых опухолях мышей зависит от количества функциональных микрососудов в опухоли.
Заключение
В результате проведенных исследований показано, что ФДТ с ЛЛЛФ Тиосенса проявляет противоопухолевую активность при всех изученных перевиваемых опухолях мышей. Однако следует отметить, что наиболее чувствительными опухолями к ФДТ с ЛЛЛФ Тиосенса являются: опухоль Эрлиха,
солидный вариант лимфоцитарной лейкемии Р-388 и саркома 37, на которой высокое торможение роста опухоли сочетается с излечением 33,3 % животных.
В клинике ЛЛЛФ Тиосенса планируется применять при ФДТ таких опухолевых заболеваний, как рак желудка, кожи, нижней губы, опухолей слизистой оболочки полости рта, языка, при внутри-кожных метастазах рака молочной железы и опухолях головного мозга.
В экспериментах на животных было показано, что комбинация фотодинамической терапии с другими методами лечения, например лучевой терапией, химиотерапией и иммунотерапией, значительно повышает эффективность лечения и увеличивает процент случаев излечения животных от опухолевого процесса.
Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства г. Москвы в рамках научнотехнической программы «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний».
Литература
1. Гуревич Д.Г., Меерович И.Г., Меерович ГА. и др. Влияние размеров липосом на уровень и селективность накопления Тиосенса в опухоли // Российский биотерапевтический журнал. - 2QQ7. - Т. б, № 2.
- С. 45-9.
2. Кубасова ИЮ, Вакуловская Е.Г., Ермакова К.В., Смирнова З.С. Флюоресцентная диагностика и фо-тодинамическая терапия при лечении злокачественных опухолей головного мозга // Российский био-терапевтический журнал. - 2QQ6. - Т. 5, № 4. - С. 54-б3.
3. Методические указания по изучению противоопухолевой активности фармакологических веществ. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - Под ред. Хабриева Р.У. - М.: Медицина, 2QQ5. - С. б37-52.
4. Санарова Е.В., Полозкова А.П., Оборотова НА. Лиофилизированная наноструктурированная лекарственная форма тиосенса // Всероссийский журнал научных публикаций. - 2Q11. - №8. - С. 74-б.
5. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США. - Под ред. З.П. Софьиной, А.Б. Сыркина (СССР), А. Голдина, А. Кляйна (США). - М.: Медицина, 1979. - С. 71-1Q7.
6. Ярцева И.В., Гатинская Л.Г., Дмитричева НА. и др. Количественное определение Тиосенса // Рос-
сийский биотерапевтический журнал. - 2QQ6. - Т. 5, № 1. - С. 33-4.
7. Allen C.M., Sharman W.M., Vanlier J.E. Current Status of phthalocyanines in the photodynamic therapy of
cancer // J Porphyrins Phthalocyan. - 2QQ1. - 5. - P. 1б1-9.
8. Allison R.R. Future FDT // Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. - 2QQ9. - б. - P. 231-4.
9. Allison R.R, Sibata C.H. Oncologic photodynamic therapy photosensitizers: A clinical review // Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. - 2Q1Q. - 7. - P. б1-75.
1Q. Hopper C. Photodynamic therapy: a clinical reality in the treatment of cancer // Lancet Oncol. - 2QQQ. - 1. -P. 212-9.
11. Miller J.P, Baron E.D., Scull H. et al. Photodynamic therapy with the phthalocyanine photosensitizer Pc 4: the case experience with preclinical mechanistic and early clinical - translation studies // Toxicol Appl Pharmacol. - 2QQ7. - 224(3). - P. 29Q-9.
12. Mishra B, Patel B.B., Tiwari S. Colloidal nanocarriers: are view on formulation technology, types and applications toward targeted drug delivery // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. - 2Q1Q.
- б. - P. 9-24.
13. Ortel B, Shea C.R., Calzavara-Pinton P. Molecular mechanisms of photodynamic therapy // Frontiers in Bioscience. - 2QQ9. - 14. - P. 4157-72.
14. Peng Q., Farrants G.W., Madslien K. et al. Subcellular localization, redistribution and photobleaching of sulfonated aluminium phthalocyanines in a human melanoma cell line // Int. J. Cancer. - 1991. - 49(2). - P. 29Q-5.
