CC BY
27
liiC. I II ¡Ii' ВДНЗУ «Украгнсъка жедична стожатологЬчна акадежШ»
Матерйали Всеукрашсько! науково-практично! конференцм
«1нновацшш технологи у експериментальнш медицин! та бюлогм» 6-7 травня 2010 року
УДК 616.379-008.64+617.586.
КРИТЕРМ 0Ц1НКИ ПЕРЕБ1ГУ РАН0В0Г0 ПРОЦЕСУ В ШК1Р11НТАКТНИХ ЩУР1В: В1Д МОРФОЛОГИ РАНИ ДО 1НТЕРПРЕТАЦМ MEXAHIBMIB ВАГОЕННЯ
Бартов Е.Ф., Сулаева О.М., Бартова М.Е., Кл{щенко 1.П.
Донецький нацюнальний медичний университет ¡м. М. Горького.
Робота присвячена визначенню адекватних морфометричних критерпв оцтки загоення ран на ocuoei селективного ix eidQopy eidnoeiduo до кожног фази ранового процесу. Платметр{ю ран та морфометричну оцтку 6ionmamie проводили в динамщ{ загоення ран штри diajnempoM 2 см. Найбшъш тформативними критер{ями оцтки судинног фази ранового процесу е зростання питомого обсягу ттерстицшног piduuu та альтерованих структур, що в{дбиваютъ ступть iiueMii краге. ЕЯддзеркаленням запалъног фази е зростання тдексу тфшътрацп, який eidbueae зростання taiimuH iMizpaumie в сполучнш тканит дерми. Розвиток грануляцш супроводжувався зростанням ПЩ ф{бробласт{в та ендотелюцит1в за умов зниження тфшътрацп та активаци прол{фераци в enidepMici. ЕЯдбиттям дозр{вання сполучног тканини було в{дношенням питомого обсягу волокон до питомог щшъност{ ф{бробласт{в.
Ключов1 слова: рани, загоення, морфометричы критерм
Вступ
Порушення загоення та формування хрожчних ран супроводжуе розвиток р1зних захворювань, провщними патогенетичними ланками яких е порушення ¡ннерваци та васкуляризаци, розвиток ¡мунного запалення, змша неспециф1чноТ резис-тентност1 оргажзму [3, 5]. Числены попередж дослщження щодо патогенезу хрожчних ран дозволили з'ясувати можливють порушення меха-Hi3MiB прол1фераци й апоптозу юптин, змшу фун-кцюнального стану лейкоцит1в, експреси моле-кулярних маркер1в процеав диференцшвання кератиноцит1в та формування грануляцшноТ тканини: I, III, IV, VII тип1в, ламшшу, ф1бронектину та тенасцину, та Тх регулятор1в - фактор1в росту i цитоюжв тощо [4, 6, 7]. Проте, до сьогодж, в лн тератур1 не окреслене коло морфолопчних критерий, як1 б дозволяли проводити ранню д1агнос-тику та прогнозування nepe6iry ранового процесу. Багато в чому ця проблема пов'язана з тим, що анал1з бюптат1в ран не враховуе два момен-ти: фазнють nepe6iry ранового процесу та зона-льну гетерогеннють в структурой оргажзаци шк1ри. Pi3Hi фази ранового процесу мають свое макроскоп1чне, м1кроскоп1чне вщбиття та специ-
ф1чн1 регулятори динам1чних вщносин р1зних клн тин, як1 не ттьки реал1зують кожну з фаз запа-льно-репаративного процесу, але й забезпечу-ють ix поступову змшу [5]. Анал1з морфогенети-чних змш в р1зних зонах шк1ри в норм1 можуть стати вщправним моментом в з'ясуванж провщ-них механ1зм1в порушення загоення ран за умов патологи. Це й визначило мету дано'Г роботи.
Maicpiaji i методи досладження
В робот1 проведено сп1вставлення плажметри-чних характеристик nepeöiry ранового процесу ¡з морфолопчними показниками структурного го-меостазу шк1ри 25 щур1в bIkom 10-12 Mic за 1, 3, 5, 7, 14 i 20 д1б пюля формування плоских пов-ношарових ран цшри д1аметром 2 см. I~lepe6ir ранового процесу оцшювали за термшами очищения рани, появи грануляцш, початку та завершения еп1тел1заци. Паралельно розраховували площу рановоТ поверхж. Бюпсшний матер1ал фн ксували в 10%-му розчиж формалшу на фосфатному буфер! (pH = 7,4). Морфометричний ана-л1з проводили з використанням програмного за-безпечення ImageTool version 3.0. i граф1чного редактора Adobe Photoshop CS4 Extended v.11.0.1. Морфометрично оцшювали питомий
* Робота э фрагментом НДР МОЗ УкраГни «МИжтканинш та м1жклтинш кооперацп в реал1заци репаративноГ регенераци opaaHie: залежнють eid peaKmueHocmi оргашзму» №0109U008714 МК 100101 (2010-2012 pp.)
Актуальт проблеми сучасно!" медицини
об'ем (ПО) альтерованих структур [1], судин, м1жюмтинного матриксу (волокон, аморфноТ ре-човини, трансудату), кл1тин, також визначали питому щтьнють (ПЩ) р1зних тишв кгмтин та баланс м1ж ними. За допомогою окуляр-м1крометру вим1рювали товщину ешдермюу, д1аметри судин, волосяних фол1кул1в. Контролем були фра-гменти ¡нтактноТ цшри. Отримаы результати об-робляли статистично у nporpaMi MedStat [2].
Результати та обговорення
Вивчення ран цшри показало, що за 1-3 доби рана покривалася струпом з дтянками гншних вогнищ, в краях ран спостер1галася запальна реакц1я. Площа ранового дефекту зменшува-лась на 17,3-21,4% (р<0,05) пор1вняно з почат-ковим показником. Грануляцшна тканина утво-рювалась за 5±1 д1б. За 7 дК5 площа грануляцш дор1внювала приблизно 25-50% площ1 рани, на-приKiнц1 1 тижня визначено значне скорочення площ1 рани - на 68,5% i 74,1% (р<0,01) вщповщ-но до показниш за 3 доби ранового процесу та початковоТ площ1 рани. Початок ештел1зацм рани з краТ'в спостер1гався за 6±1 д1б, а повна ештелн зац1я рановоТ поверхн1 - за 12±2 д1б. Морфолоп-чне дослщження виявило динам1чы змши в pi3-них репонах цшри, що вщбивали зональну гете-рогенн1сть вертикально'!' оргашзацм цшри та горизонтального град1енту зм1н в нш. За особливо-стями вертикально'!' оргашзацм та реакцм на мо-делювання ранового процесу було визначено шють функцюнальних зон цшри: 1) епщермо-дермальний репон; 2) зона поверхневого судин-ного сплетения, 3) волосяш фолкули; 4) м1жфо-лкулярний npocTip атчастого шару дерми; 5) зона глибокого судинного сплетения та 6) дтянка пподерми i м'яз1в.
Вивчення бюптат1в цшри за 1 добу визначило в першу чергу реакцш судин поверхневого та глибокого судинного сплетения. Так, у великих судинах вглибиш атчастого шару дерми мала м1сце вазодтятац1я судин, явища стазу, альте-рац1я ендотелш та набряк периваскулярного простору. Схож1 зм1ни були й на меж1 м1ж цшрою та скелетними м'язами, часто розповсюджую-чись на ендом1зш. Менш виразними були змши у зон1 поверхневого судинного сплетения марпна-льноТ' зони ран. Вони супроводжувалися розвит-ком набряку сосочкового шару дерми та дифу-зшною ¡нфтьтрац1ею переважно нейтрофтами, набряком колагенових та руйнуванням еластич-них волокон. Порушення м1кроциркуляцм у атча-стому Luapi дерми визначило розвиток в данш зон1 дистроф1чних та некробютичних змш залоз та волосяних фол1кул1в. ПО альтерацП' досягав 34-38%, i супроводжувався накопиченням ¡нтер-стицшноТ рщини, ПО якоТ' складав 22-28% у fli-лянках м1ж фолкулами атчастого шару. Протя-гом 2-3 д1б ранового процесу в LUKipi визначено зростання ПЩ лейкоцит1в i формування лейкоцитарного валу, який охоплював Bei шари дерми. У його склад1 переважали нейтрофти, мак-
рофаги \ л1мфоцити. Треба вщзначити збере-ження високого ПО судин в запальну фазу ранового процесу та ПО альтерацП' переважно еште-л1альних структур цшри, обумовленого вторин-ною деструкц1ею матриксу. ПО альтерованих структур дор1внював 17-25%, причому найбтьш уразливими до альтерацП' виявилися ештел1аль-ш структури кра'Гв рани, в яких визначалася ва-куол1зац1я та злущення кштин до базального шару, а також волосяш фолкули, що знаходи-лися в фаз1 катаген.
Принциповими були змши за 5 д1б ранового процесу. В цей термш судини глибокого сплетения набували ознак вщновлення будови ¡нти-ми та середньоТ оболонки, проте частина судин була у сташ дилятацм. В зош фасцП' та пподерми формувалися вузью ендотел1альш трубочки, що росли у напрямку дна рановоТ поверхш \ були асоцшоваш з активац1ею прол1ферацм ф1броб-ласпв. Схож1 процеси виявлялися в поверхне-вих шарах дерми крайовоТ зони - нов1 судини вн зуал1зувалися в горизонтально проекци \ супроводжувалися формуванням ланцюжюв ф1броб-ласпв \ дифузно розташованих л1мфоцит1в та макрофапв. Проте в крайовш зош рани збер1гав-ся лейкоцитарний вал. У його склад1 окр1м нейт-рофт1в, визначалися макрофаги, л1мфоцити, ф1бробласти. Найбтьш яскравим вщбиттям змн ни кл1тинних популяцш був ¡ндекс ¡нфтьтрацм, розрахований, як вщношення ПЩ лейкоцит1в до ПЩ ф1бробласпв. Якщо в норм1 цей показник дор1внював в атчастому шар1 дерми 0,17±0,02, то пщ час запалення за 1 добу вш зростав до 0,73±0,02, за 3 доби - до 5,2±0,8, а за 7 д1б знов зменшувався до 0,64±0,07, тим самим вщбива-ючи швелювання хвил1 ¡нфтьтрацм дерми та ак-тивацш репаративних процеав. Проте в епщер-м1а кра'1'в рани збер1галися ознаки вакуол1зацмта загибел1 кл1тин. За 7 д1б дно рани було утворено грануляцшною тканиною, в склад1 яко'Г спостер1-галась велика юльюсть ф1бробласпв та ендоте-л1оцит1в. ПО волокон залишався низьким, а показник зртосп сполучноТ тканини, розрахований за вщношенням ПО волокон до ПЩ (¿¡броблас-т1в, був майже в 10 раз1в нижним за норму. Еш-дерм1с мав товщину 25±4 мкм, р1вну базальну мембрану, скпадався головним чином з базального та остистого шар1в. За 14 д1б зареестрова-на повна ештел1зац1я раново'1 поверхн1 та ремо-делювання сполучноТ тканини дерми. В цей час визначено зниження ПЩ вах тип1в кл1тин, проте ¡ндекс ¡нфтьтрацм' знижувався майже дв1ч1, по-р1вняно з 7-ю добою (до 0,33±0,05) \ повертався до норми за 20 д1б. Демонстративною була також динамка показника зртосп сполучноТ тканини, що зростав за 2-й тиждень майже втрич1, й наближався до початкового р1вня до 20-Т' доби ранового процесу. Дозр1вання сполучноТ тканини дерми супроводжувалося обмеженням прол1фе-рацм та потовщенням ешдермюу до 55±5 мкм, в ньому визначався зернистий \ тонкий роговий шар.
Том 10, Выпуск 1
5
BiCHHK ВДНЗУ «Украгнсъка жедична стожатологЬчна акадежШ»
ми, що е джерелом неоанпогенезу, поверхнево-го судинного сплетения та епщермо-дермальноТ' межк Оцшка ПО ¡нтерстицшноТ' рщини i альтера-ци дозволяе визначити стушнь ¡шеми краТ'в рани та резистентнють еп1тел1альних структур до ушкодження. Найбтьш чутливим показником запальноТ' фази був ¡ндекс ¡нфтьтраци, що вщ-бивав баланс м1ж ¡м1грантами та резидентними кл1тинами сполучноТ' тканини. Про вщновлення структурного гомеостазу дерми може свщчити ПО волокон, проте бтьш ¡нформативним був коеф1ц1ент вщношення ПО волокон до ПЩ ф1б-робласпв, який вщбивав пщтримання ф1броге-незу за рахунок стимуляцП' секреторноТ' активно-
CTi кл1тин.
Л1тература
1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия / Г.Г. Автандилов. - М. Медицина, 1991. - 381 с.
2. Лях Ю.Е. Основы компьютерной биостатистики / Ю.Е. Лях, Г.В. Гурьянов, В.Н. Хоменко, О.А. Панченко. - Д. - 2006. - 211 с.
3. Agren M.S. The Extracellular Matrix in Wound Healing: A Closer Look at Therapeutics for Chronic Wounds / M.S.Agren, J.Inter, M Werthen // Lower Extr. Wounds. - 2007. - V. 6. - P.82-97.
4. Braiman-Wiksman L. Invited Review: Novel Insights into Wound Healing Sequence of Events / L.Braiman-Wiksman.// Toxicol. Pathol. - 2007,- V.35. - P.767-779.
5. Dinh T.L. A review of the mechanisms implicated in the pathogenesis of the diabetic foot / T.L.Dinh // Int. J. Low Extrem. Wounds. - 2005. - № 4. - P.154 -159.
6. Jarvinen T. Changes in the Vasculature of Injured Tissues / T.Jarvinen, A.H.Ruoslahti, E.Molecular//Am. J. Pathol. - 2007. -V.171. - P.702-711.
7. Yu B.D. Skin and hair: models for exploring organ regeneration / B.D.Yu, A.Mukhopadhyay, C.Wong // Hum. Mol. Genet. - 2008. -V.117. - P.54-59.
Отже, кожна фаза ранового процесу супрово-джуеться певними морфометричними змшами, правильний Bifl6ip та ¡нтерпретац1я яких вщдзер-калюе nepe6ir i наслщки морфогенетичних про-цеав пщ час ТТ реал1заци. Проведения матема-тичного анал1зу показало, що ПО альтерацп та ПО ¡нтерстицшноТ' рщини корелюють з виразню-тю лейкоцитарноТ' ¡нфтьтраци (Р|=0,812, г2=0,763), хоча ПО судин був слабко пов'язаний з динамкою ¡нших змш протягом ранового процесу. Поява грануляцш та швидкють скорочення площ1 рани зворотно корелювали з показником ¡нфтьтраци за 3 доби (ri =-0,721 i г2 =-0,852), проте зв'язки цих параметр1в з ПЩ ф1бробласпв (г3=0,564) та ПО кл1тин (г4=0,413) виявилися зна-чно нижними. У детермшаци TepMiHiB повного закриття ранового дефекту та товщини епщер-Micy на поверхн1 рани важливу роль вщ1гравало вщновлення структурного гомеостазу дерми, пов'язане 3i зростанням ПО волокон (г=0,733) та вщношення ПО волокон до ПЩ ф1бробласпв (1=0,912).
Висновки
Морфометричний анал1з ранового процесу повинен враховувати функцюнальы зони цшри. В анал1з1 судинноТ' та запальноТ фази найб1льш ¡н-формативним е дослщження атчастого шару дерми: збереженють еп1тел1альних структур -залоз та волосяних фол1кул1в та структура м1ж-фол1кулярного репону, тод1 як розвиток грануля-ц1й i еп1тел1зац1я потребують анал1з зон пподер-
Реферат
КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ ТЕЧЕНИЯ РАНЕВОГО ПРОЦЕССА В КОЖЕ ИНТАКТНЫХ КРЫС: ОТ МОРФОЛОГИИ К ИНТЕРПРЕТАЦИИ МЕХАНИЗМОВ ЗАЖИВЛЕНИЯ
Баринов Э.Ф., Сулаева О.Н., Баринова М.Э., Клищенко И.П. Ключевые слова: раны, заживление, морфометрические критерии.
В работе проведен отбор адекватных морфометрических критериев оценки заживления ран применительно к каждой фазе раневого процесса. Планиметрию ран и морфометрическую оценку биопта-тов кожи проводили в динамике заживления ран диаметром 2 см. Наиболее информативными критериями оценки результата сосудистой фазы раневого процесса являеются повышение удельного объема интерстициальной жидкости и альтерации структур кожи, отражающие степень ишемии краев раны. Отражением воспалительной фазы был индекс инфильтрации, демонстрирующий повышение плотности клеток иммигрантов в соединительной ткани дермы. Развитие грануляций сопровождалось ростом удельной плотности фибробластов и эндотелиоцитов при снижении инфильтрации и активации пролиферации в эпидермисе. Отражением созревания дермы было отношение удельного объема волокон к удельной плотности фибробластов.
Summary
CRITERIA FOR EVALUATION OF WOUND PROCESS IN INTACT RAT SKIN: FROM MORPHOLOGY TO INTERPRETATION OF HEALING MECHANISMS
Barinov E.F., Sulaeva O.N., Barinova M.E., Klischenko I.P. Keywords: wound, healing, granulation, inflammation, skin.
This work is devoted to the selection of the most suitable informative morphometric evaluation criteria of wound healing according to the phases of wound process. Measurement of wound area and skin tissue sampling estimation were performed in healing dynamics of the wounds about 2 cm in diameter. The most informative evaluation criteria of vascular phase results were considered to be the increase of interstitial fluid and alteration in skin structures reflecting the degree of wound edges ischemia. Inflammatory phase was presented by the infiltration index showing the increasing in density of immigrant cells in the dermal connective tissue. The development of granulation was accompanied with the rise of fibroblasts and endotheliocytes density, activation of cell proliferation in the epidermis. Remodeling of skin was accompanied by increased maturity of connective tissue, calculated as the ratio of the volume of fibers to fibroblasts density.
