CC BY
182
микробиология
© коллектив авторов, 2012
УДК 616.931-078
И. К. Мазурова1, О. Ю. Борисова1, И. А. Рудакова1, Н. Т. Гадуа1, Г. А. Ивашинникова1, Н. Я. Салова2, Ф. М. Абасова2, И. П. Требунских2, Л. А. Дмитриева2, в. А. Алешкин1
Контроль качества питательных сред при лабораторной бактериологической диагностике дифтерии
1ФБУН Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора, 2ФБУЗ ЦГиЭ в Москва
Проведено сравнительное исследование ростовых свойств девяти питательных сред для первичного посева патологического материала. Показано, что для успешной и правильной работы бактериологической лаборатории, осуществляющей бактериологические исследования на дифтерию, необходимым является постоянное проведение контроля качества питательных сред для первичного посева с оценкой ростовых свойств по нескольким критериям. К таким критериям относятся всхожесть выделенной культуры, итенсивность ее роста через 24 и 48 ч, оптимальный размер характерных по культураль-ным признакам колоний и ингибирующая активность в отношении сопутствующей микрофлоры.
Ключевые слова: возбудитель дифтерии, Corynebacterium diphtheriae, бактериологическая диагностика, питательные среды
I.K. Mazurova, O.Yu. Borisova, I.A. Rudakova, N.T. Gadua, G.A. Ivashinnikova, N.Ya. Salova, F.M. Abasova, I.P. Trebunskikh,
L.A. Dmitriyeva, V.A. Alyeshkin THE QUALITY CONTROL OF NUTRIENT MEDIUM IN LABORATORY BACTERIOLOGIC DIAGNOSTICS
OF DIPHTHERIA
The G.N. Gabritchevsky research institute of epidemiology and microbiology of Rospotrebnadzor, Moscow
The article deals with the results of studying the growth characteristics of nine nutrient mediums for primary plating of pathologic material. It is demonstrated that for successful and proper functioning of bacteriologic laboratory providing bacterial analysis for diphtheria the permanent quality control is needed to monitor the nutrient mediums for primary plating. The quality control is applied to evaluate the growth characteristics on such criteria as germination of isolated culture, intensity of its growth in 24 and 48 hours, optimal size of colonies characterized by their cultural characteristics, inhibiting activity concerning concurrent microflora.
Key words: diphtheria agent, corynebacterium diphtheriae, bacteriologic diagnostics, nutrient medium
Основным методом лабораторной диагностики дифтерии является бактериологическое исследование, которое проводится для выявления источников дифтерийной инфекции и наблюдения за распространением Corynebacterium diphthe-riae. Возбудителем дифтерийной инфекции являются токси-генные коринебактерии дифтерии - С. diphtheriae. Бактериологическое исследование на дифтерию осуществляется в нашей стране в соответствии с МУ 4.2.698-98 "Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции" и обладает достаточно высокой степенью эффективности [1]. Успех проведения исследования в значительной степени зависит от своевременного и правильного взятия патологического материала, качественной работы питательных сред и квалификации бактериологов. С учетом того что цель бактериологического исследования - это выдача в оптимально сжатые сроки окончательного ответа, важным этапом проведения исследования являются правильный посев патологического материала на среды для первичного посева и получение изолированных колоний уже в первые сутки роста. Среды для посева материала для определения токсигенных, биохимических и саха-ролитических свойств подлежат контролю [1]. Целью исследования явилось проведение контроля качества питательных сред для первичного посева патологического материала при лабораторной диагностике дифтерии.
Для корреспонденции:
Мазурова Изабелла Константиновна, д-р мед. наук, проф., зав. лаб.
диагн. дифтерийной инфекции
Адрес: 125212, Москва, ул. адм. Макарова, 100
Телефон: (495) 459-21-46
E-mail: mazurov@pro-box.ru
Материалы и методы. Исследование проводили в соответствии с МУ 4.2.698-98 "Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции" [1]. Использовали следующие коммерческие питательные среды: СПА ("Микроген", Махачкала), ГРМ-агар (3 серии), АГВ (2 серии) и коринебакагар (5 серий) (ФГУН ГНЦПМ пос. Оболенск, Московская обл.), основа кровяного агара Columbia agar (Pronadisa, Испания), Blood agar (HiMedia, Индия), Hoyle agar (Oxoid, США), среда Клау-берга II (4 серии - из двух лабораторий на основе СПА, ГРМ-агара, АГВ и основы кровяного агара). При приготовлении кровяно-теллуритовых сред в агаровые основы добавляли 10,0% дефибринированной крови крупного рогатого скота (НПО "Лейтран", Москва) и 1,5% теллурита калия; в кори-небакагар теллурит калия не добавляли. Среды Клауберга II готовили в лабораторных условиях по прописи с добавлением глицериновой смеси, "лаковой" крови и теллурита калия, согласно МУ 4.2.698-98 [1].
В качестве контрольного штамма использовали штамм С. diphtheriae № 665 (из коллекции ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора) и штамм Staphylococcus aureus № 25923 (из коллекции ГИСК им. Л. А. Тара-севича). Суточные культуры С. diphtheriae и S. aureus, выращенные на сывороточном агаре, смывали изотоническим раствором натрия хлорида. Мутность полученных суспензий соответствовала 10 ед. оптического стандарта мутности (ГИСК им. Л. А. Тарасевича). Из исходных взвесей культур готовили последовательные разведения в изотоническом растворе натрия хлорида. Все серии экспериментов проводили одновременно в троекратных повторах. Из двух последних разведений (6-го и 7-го) по 0,1 мл суспензии культуры С. diphtheriae засевали газоном на 3 чашки с каждой испытуемой средой. Аналогично производили посев стафилококка.
клиническая лабораторная диагностика, № 4, 2012
Результаты учитывали через 24 и 48 ч и оценивали по нескольким критериям: всхожести бактериальной культуры, оптимальному размеру выросших колоний, интенсивности роста, культурально-морфологическим свойствам и ингибирующей активности в отношении сопутствующей микрофлоры.
Результаты и обсуждение. Выращивание микроорганизмов на питательных средах в лабораторных условиях применяется с целью выделения чистых культур для изучения биологических свойств микроорганизмов или продуктов их жизнедеятельности. Питательные среды определяют успех исследования и своевременную выдачу бактериологического заключения. Контроль качества питательных сред для культивирования микроорганизмов должен быть предметом постоянного внимания бактериологов [2].
Для того чтобы добиться максимальной высеваемости коринебактерий дифтерии из исследуемого материала, необходимо создать оптимальные условия для роста, размножения этих бактерий, сохранения их биологических свойств, а также для ингибирования роста сопутствующей микрофлоры [2]. Это достигается путем использования универсальных питательных основ с добавлением крови и калия теллурита. Калия теллурит в определенной концентрации не препятствует росту представителей рода коринебактерий и практически полностью ингибирует рост сопутствующей микрофлоры. Кровяно-теллуритовые среды являются также дифференциально-диагностическими, поскольку колонии С. diphtheriae на этих средах имеют серо-черную или черную окраску (указанные микроорганизмы способны восстанавливать калия теллурит до металлического теллура - вещества черного цвета - и накапливать его внутри клеток). Также в нашей стране разработана дифференциально-диагностическая среда для выделения коринебактерий - коринебакагар без добавления калия теллурита. В эксперименты включены агаровые основы для приготовления кровяно-теллуритовых сред и коринебакагар (без калия теллурита) для первичного посева патологического материала.
При сравнительном изучении все питательные агары обладали хорошими ростовыми свойствами и всхожесть колоний С. diphtheriae варьировала в достаточно узком пределе. Вместе с тем по размеру колоний, выросших через 24 ч, питательные среды оказались неодинаковыми. Оптимальный размер колоний, т. е. видимый невооруженным глазом, отмечали на СПА, всех сериях ГРМ-агара, всех вариантах среды Клауберга II и на импортных питательных средах. На СПА, ГРМ-агаре и средах Клауберга II размер колоний варьировал от 0,8 до 1,2 мм; на импортных агаровых основах: основе кровяного агара, Blood agar, Hoyle agar и Columbia agar - от 0,9 до 1,1 мм; размер выросших колоний на среде АГВ был несколько меньше - 0,7 мм. В различных сериях коринеба-кагара размер выросших колоний варьировал в достаточно широких пределах. Через 24 ч роста на одной серии размер колоний учесть невозможно, на двух сериях диаметр колоний составил 0, 2 мм и двух сериях - 0,6 мм.
По интенсивности роста питательные среды также имели различия. Большей интенсивностью обладали СПА, ГРМ-агар, среда Клауберга II и импортные питательные среды, на которых размер колоний, выросших через 48 ч, увеличился в 2-3 раза и составил от 1,6 до 2,5 мм. На коринебакагарах размер колоний также увеличился в 2-3 раза, однако если учесть, что размер колоний через 24 ч роста составлял 0,2-0,6 мм, то через 48 ч он достиг 0,4-1,2 мм. Меньшей интенсивностью обладал АГВ-агар: размер колоний, выросших на всех сериях, увеличился в 1,6-2 раза.
Одним из важных моментов при идентификации С. diph-theriae является выявление типичных колоний, т. е. колоний, характерных по культуральным признакам. Наиболее типичные культуральные признаки выросших колоний наблюдали
на СПА, в двух сериях ГРМ-агара, на всех вариантах среды Клауберга II, основе кровяного агара, Blood agar и Hoyle agar: колонии были серо-черного или черного цвета, приподняты, округлой формы с радиальной исчерченностью ("маргаритка"). Меньшей выраженностью культуральных свойств обладали колонии С. diphtheriae, выросшие на одной серии ГРМ-агара, двух сериях АГВ-агара, columbia agar и одной серии коринебакагара. В остальных четырех сериях коринебака-гара культурально-морфологические свойства варьировали - на трех сериях наблюдали легкую краевую исчерченность и на двух сериях структура колоний была менее типичной по сравнению со всеми испытуемыми средами. В отношении ингибирующей активности все питательные среды обладали хорошей активностью, роста сопутствующей микрофлоры (на примере S. aureus) не наблюдалось. Сравнительное исследование показало, что необходимо проводить контроль каждой серии питательной среды и с учетом использования питательных агаровых основ, позволяющих выявить изолированные колонии С. diphtheriae уже в первые сутки роста.
Проведено изучение дифференцирующей способности питательных сред для первичного посева патологического материала в отношении роста штаммов С. diphtheriae био-варов gravis и mitis. Сравнительное исследование ростовых свойств двух питательных сред - ГРМ-агара и СПА - при выращивании штаммов С. diphtheriae биоваров gravis и mitis показало различия в интенсивности роста и характере куль-туральных свойств штаммов различных биоваров. Независимо от питательной среды всхожесть штамма С. diphtheriae биовара mitis в 1,2-1,7 раза выше, чем у штамма С. diphtheriae биовара gravis. Интенсивность роста более выражена у штамма С. diphtheriae биовара gravis, чем у штамма биовара mitis. При сравнении размеров колоний штаммов различных биоваров оказалось, что на ГРМ-агаре размер колоний двух биоваров не различался, в то время как на СПА колонии биовара gravis в 1-1,5 раза превышали размер колоний штамма биовара mitis. Наибольшие различия между штаммами двух биоваров обнаружены в особенностях их культуральных свойств на этих средах. На среде ГРМ-агар морфология колоний двух биоваров незначительно различалась. На среде СПА морфология колоний штаммов двух биоваров различалась: для штамма биовара gravis была характерна выраженная радиальная исчерченность, в то время как колонии штамма биовара mitis имели вид гладких приподнятых образований с ровным краем. Различать штаммы С. diphtheriae биоваров gravis и mitis только по культуральным свойствам на питательных средах не представляется возможным в связи с тем, что этот признак не обладает дифференцирующей способностью, так как на различных питательных средах характер роста колоний штаммов двух биоваров может варьировать.
Заключение. Для успеха проведения бактериологического исследования на дифтерию необходимо проводить постоянный (каждая серия) контроль качества питательных сред для первичного посева патологического материала, который должен включать в себя несколько критериев оценки ростовых свойств: всхожесть выделенной культуры, интенсивность ее роста, оптимальный размер (т. е. видимых невооруженным глазом) колоний через 24 ч роста, характерные культурально-морфологические признаки колоний и ингибирующая активность в отношении сопутствующей микрофлоры.
ЛИТЕРАТУРА
1. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции: Метод. указания МУ 4.2.698-98. - М., 1998.
2. Частная медицинская микробиология и этиологическая диагностика инфекций / Под ред. А. С. Лабинской и др. - М., 2010.
Поступила 29.06.11
