CC BY
312
8. Yanushevich O.O., Dmitrieva L.A., Grudyanov A.I. Periodontitis XXI Century. [Parodontit XXI vek]. Moscow; 2012. (in Russian)
9. Ashimoto A., Chen C., Bakker I., Slots J. Polimerase chain reaction detection of 8 putative periodontal pathogens in subgingival plaque of gingivitis and advanced periodontitis lesions. Oral Microbiol. Immunol. 1996; 11 (4): 266-73.
10. Ezzo P.J., Culter C.W. Microorganisms as risk indicators for periodontal disease. Periodontol. 2000. 2003; 32: 24-35.
11. Le H., Theilade E., Jensen S.B. Experimental gingivitis in man. J. Periodontol. 1965; 36: 177-87.
12. Grande S.R., Imbronito A.V., Okuda O.S., Lotufo R.F., Magalhaes M.H., Nunes F.D. Herpes viruses in periodontal compromised sites: comparison between HIV-positive and -negative patients. J. Clin. Periodontol. 2008; 35 (10): 838-45.
13. Mombelli A., Meier C. On the symmetry of periodontal disease. J. Clin. Periodontol. 2001; 28 (8): 741-5.
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 579.871.1.083.12
Шепелин А.П.1, Полосенко О.В.1, Борисова О.Ю.2, Пименова А.С.2, Гадуа Н.Т.2
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ КОРИНЕБАКТЕРИЙ
1ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, 142279, Московская обл., пос. Оболенск; 2ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, 125212, Москва
Проведены сравнительные испытания питательных сред для выделения и накопления дифтерийных бактерий: шести серий питательной среды Коринебакагар производства ФБУН ГНЦ ПМБ и трех серий кровяного теллуритового агара. Представлены итоговые результаты по определению биологических показателей всех серий питательных сред. Коринебакагар рекомендуется к использованию в практике здравоохранения для первичного посева патологического материала при проведении культурального исследования на дифтерию.
Ключевые слова: питательные среды; коринебактерии; специфическая активность; ингибирующие свойства.
Для цитирования: Клиническая лабораторная диагностика. 2016; 61 (1): 59-64. ShepelinA.P.1, Polosenko O.V.1, Borisova O.Yu.2, PimenovaA.S.2, GaduaN.T.2
TMOSKOVHE COMPARATIVE CHARACTERISTIC OF GROWTH MEDIUMS FOR SEPARATION OF CORYNEBACTERIA
1The state research center of applied microbiology and biotechnology of Rospotrebnadzor, 142279 village of Obolensk, the Moskovskaia oblast, Russia; 2G.N. Gabrichevskii Moscow research institute of epidemiology and microbiology of Rospotrebnadzor, 125212 Moscow, Russia
The comparative tests of growth mediums for isolation and accumulation of diphtheria bacteria were implemented. The testing consisted of six series of growth medium "Corynebacagar" produced by the state research center of applied microbiology and biotechnology and three series of blood tellurite agar. The concluding results of identification of biological indicators of all series of growth nutrient mediums are presented. The "Corynebacagar" is recommended for application in health care practice for primary inoculation ofpathological material during implementation of cultural analysis on diphtheria.
Keywords: growth medium; Corynebacteria; specific activity; inhibiting characteristics
Citation: Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika. 2016; 61 (1): 59-64. (in Russ.)
Введение. Несмотря на очевидные успехи проводимой массовой иммунизации детского населения, дифтерия по-прежнему остается актуальной инфекцией как для детского, так и для взрослого населения. До настоящего времени сохраняются основные эпидемиологические особенности поддержания эпидемического процесса этой инфекции.
Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции имеет большое значение для установления диагноза, принятия решения о проведении специфической терапии, оценки и прогнозирования эпидемиологической ситуации. Бактериологический метод является основным. Он используется в диагностических, профилактических и эпидемиологических целях. Задача бактериологического исследования - выявление возбудителя дифтерии с помощью минимального количества диагностических тестов, необходимых, достаточных и специфичных для получения достоверного ответа
Для корреспонденции: Шепелин Анатолий Прокопьевич, [email protected]
For correspondence: Shepelin A.P. [email protected]
в максимально сжатые сроки: не менее 3 сут - отрицательный ответ, 3-4 сут - выделение токсигенных коринебакте-рий дифтерии (возбудителя дифтерии), 4-5 сут - выделение нетоксигенных коринебактерий дифтерии или других представителей данного рода [1]. Применение питательных сред, обеспечивающих оптимальные условия для накопления и выделения дифтерийных бактерий при минимальном их содержании в аналите, является актуальной проблемой бактериологической диагностики дифтерии.
Для выделения коринебактерий из инфицированного материала в соответствии с методическими указаниями МУК 4.2.3065-13 «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции» [2] в практике здравоохранения широко используются селективные дифференциально-диагностические кровяные теллуритовые среды лабораторного приготовления - кровяной теллуритовый агар (КТА), среда Клауберга II.
В качестве основы для этих сред используют сухой питательный агар, питательный агар на основе панкреатического гидролизата рыбной муки (ГРМ), АГВ, в которую ex tempore добавляют кровь либо любые гемолизированные кровяные добавки, глицериновую смесь, теллурит калия. Теллурит
калия включен в питательные среды в качестве ингибитора сопутствующей микрофлоры, так как он в определенных концентрациях не препятствует росту подавляющего большинства штаммов коринебактерий дифтерии. C. diphtheriae формирует на средах, содержащих теллурит калия, колонии темно-серого или черного цвета, так как за счет продукции теллуритредуктазы происходит восстановление металлического теллура и его накопление в клетках бактерий [1].
Для выделения коринебактерий дифтерии выпускается коммерческая питательная среда Коринебакагар (КБА) производства ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, широко используемая в практике российских бактериологических лабораторий, в которую, согласно прописи по приготовлению, не нужно добавлять кровь [2]. В качестве заменителя крови в данной среде содержится стимулятор роста гемофильных микроорганизмов (СРГМ), полученный путем ферментативного гидролиза суспензии черного альбумина с последующей сушкой методом распыления [3]. Введение в состав СРГМ позволило получить питательную среду, биологические свойства которой находятся на уровне КТА и среды Клауберга II. Вы-являемость коринебактерий на КБА по сравнению с контрольными средами (среда Клауберга II) составляет 90,3% [4].
В КБА регламентируется отсутствие роста стафилококка и стрептококка из разведения 10-4. Отличием питательных сред лабораторного приготовления по МУК 4.2.3065-13 является наличие роста единичных колоний стафилококка в высеве из разведения 10-7 (что довольно часто встречается на КТА). Такая среда может использоваться для посева, но в журнале контроля питательных сред отмечают снижение ингибирующих свойств питательной среды данной серии. В то же время повышение концентрации теллурита калия в питательной среде не допускается.
КБА выпускается в России более 20 лет, оформлен патент РФ на изобретение № 2041947 [5]. Объем производства питательной среды составляет 2 т в год (1 800 000 анализов).
С целью подготовки информационно-методического письма Роспотребнадзора «Организация исследований на дифтерию и коклюш» представляет интерес на базе Рефенс-центра по мониторингу за возбудителями дифтерии и коклюша ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора определить соответствие ростовых свойств питательной среды КБА требованиям МУК 4.2.306513 с использованием контрольных тест-штаммов возбудителя дифтерии.
Цель работы - межучрежденческие испытания питательной среды для выделения коринебактерий (КБА) производства ФБУН ГНЦ ПМБ по биологическим показателям на соответствие требованиям ТУ 9398-019-78095326-2006 и МУК 4.2.3065-13 для определения возможности использования среды в практике здравоохранения для первичного посева патологического материала при проведении культурального исследования на дифтерию.
Материалы и методы. В период с 25.05.14 по 28.05.15 на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского совместно с сотрудниками ФБУН ГНЦ ПМБ проведены межучрежденческие испытания биологических свойств шести серий питательной среды КБА: с. 294 (изг 02.2015 г, годен до 02.2018 г.); с. 295 (изг. 02.2015 г., годен до 02.2018 г.); с. 296 (изг. 02.2015 г., годен до 02.2018 г); с. 297 (изг. 03.2015 г., годен до 03.2018 г.); с. 298 (изг. 03.2015 г, годен до 03.2018 г.); с. 299 (изг. 03.2015 г, годен до 03.2018 г.); а также трех серий КТА на основе ГРМ-агара: с. 387, с. 728 и с. 1033.
Для контроля питательной среды КБА использованы тест-штаммы микроорганизмов C. diphtheriae gravis 665, C. diphtheriae mitis 6765, C. ulcerans 675, C. xerosis 1911, S. aureus Wood-46, S. pyogenes Dick I из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов «ГКПМ-Оболенск», а также тест-штаммы C. diphtheriae биовара gravis токсигенный № 665 из коллекции ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского и S. aureus
№ 25923 из коллекции ФГБУ НЦЭСМП Минздрава России.
Определение биологических показателей проводили следующими методами:
- специфической активности (показатели чувствительности среды, скорости роста и стабильности основных биологических свойств микроорганизмов питательной среды для выделения коринебактерий КБА) - культуральным методом по п. 4.9 ТУ 9398-019-78095326-2006 и п. 7 МУК 4.2.2316-08 [6];
- ингибирующих свойств питательной среды КБА - куль-туральным методом по п. 4.10 ТУ 9398-019-78095326-2006 и п. 7 МУК 4.2.2316-08 [6];
- оценку всхожести клеток C. diphtheriae - культураль-ным методом по п. 10.1 МУК 4.2.3065-13 [2];
- оценку времени формирования колоний C. diphtheriae, интенсивности их роста, размера и культурально-морфологических свойств - культуральным методом по п. 10.1 МУК 4.2.3065-13 [2];
- оценку ингибирующей активности в отношении сопутствующей микрофлоры (рост колоний S. aureus) - культу-ральным методом по п. 10.1 МУК 4.2.3065-13 [2].
Результаты и обсуждение
Этап 1: испытания питательной среды для выделения кори-небактерий КБА на соответствие ТУ 9398-019-78095326-2006. Суточные культуры тест-штаммов C. diphtheriae gravis 665, C. diphtheriae mitis 6765, C. ulcerans 675, C. xerosis 1911, выращенные на сывороточном агаре, а также S. aureus Wood-46, S. pyogenes Dick I смывали физиологическим раствором с поверхности питательной среды № 1 ГРМ и готовили бактериальные суспензии. Методика разведения штаммов по ТУ 9398-01978095326-2006 предусматривает использование стандарта оптической мутности. Испытания КБА и КТА в ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского проводились с использованием денситометра для определения концентрации клеток по Мак-Фарланду DEN-1 (BioSan Ltd). Разведение соответствовало значению 3,2.
На 3 чашки Петри с КБА засевали по 0,1 мл микробной взвеси каждого тест-штамма C. diphtheriae gravis 665, C. diphtheriae mitis 6765, C. ulcerans 675, C. xerosis 1911 из разведений 10-6, 10-7. Для контроля правильности приготовления суспензий и выполнения разведений проводили контрольный высев на питательные среды: сывороточный агар (питательный агар с добавлением 20% сыворотки крови крупного рогатого скота) и КТА на основе серий ГРМ-агара. Первичный учет результатов производили через 24 ч инкубации посевов при температуре (37±1)oC, окончательный - через 48 ч.
Из разведения 10-4 по 0,1 мл микробной взвеси каждого тест-штамма S. aureus Wood-46 и S. pyogenes Dick I высевали на 3 чашки Петри с КБА. Одновременно производили аналогичный высев на контрольную питательную среду № 1 ГРМ. Результаты оценивали визуально через 48 ч инкубации.
Через 20-24 ч инкубации при визуальном просмотре чашек (в том числе под микроскопом при увеличении в 25 раз) колонии штаммов коринебактерий выглядели следующим образом:
С. diphtheriae gravis 665 на КБА - темно-серые, круглые, уплощенные, со слегка неровными краями и несколько шероховатой поверхностью; диаметр большинства колоний 1,5 мм. На сывороточном агаре - круглые, бесцветные, диаметром 1,2-1,5 мм. На КТА - темно-серые, шероховатые, плосковатые, с неровными краями, незначительной радиальной ис-черченностью, диаметром 1,5 мм;
С. diphtheriae mitis 6765 на КБА - темно-серые, круглые, выпуклые, блестящие, с ровными краями, диаметр большинства колоний 1,6 мм. На сывороточном агаре - круглые, бесцветные, гладкие колонии диаметром 1,8 мм. На КТА -серовато-черные гладкие колонии диаметром 1,6 мм;
С. ulcerans 675 на КБА - темно-серые, круглые, выпуклые, блестящие, с серебристым ободком по краю, диаметр большинства колоний 0,4 мм. На сывороточном агаре - круглые, бесцветные колонии диаметром 0,2-0,4 мм. На КТА рост отсутствовал;
Таблица 1
Биологические показатели (специфическая активность: показатели чувствительности среды, скорости роста и стабильности основных биологических свойств микроорганизмов) питательной среды для выделения коринебактерий КБА
Показатель; характеристика и нормы по ТУ 9398-019-780953262006
Серия 294
Серия 295
Серия 296
Серия 297
Серия 298
Серия 299
Контроль роста тест-штаммов на сывороточном агаре
Контроль роста тест-штаммов на КТА
Специфическая активность
Через 20-24 ч инкубации при температуре (37±1)0С при визуальном просмотре чашек колонии указанных штаммов коринебактерий должны выглядеть следующим образом:
С. diphtheriae gravis 665 10-7 19 18 16 20 20 20 14 20
- темно-серые, круглые, несколько уплощенные, 1,0-1,5 1,0-1,5 1,0-1,5 1,0-1,5 1,0-1,5 1,0-1,5 1,2-1,5 1,5
диаметр большинства 10-6 63 55 66 73 56 67 46 44
колоний не менее 0,6 мм 1,0-1,5 1,0-1,5 1,0-1,5 1,0-1,5 1,0-1,5 1,0-1,5 1,2-1,5 1,5
С. diphtheriae mitis 6765 10-7 17 15 16 11 17 15 7 18
- темно-серые, круглые, выпуклые, блестящие, 1,2-1,6 1,2-1,6 1,2-1,6 1,2-1,6 1,2-1,6 1,2-1,6 1,8 1,6
диаметр большинства 10-6 50 61 50 51 51 60 50 42
колоний не менее 0,5 мм 1,2-1,6 1,2-1,6 1,2-1,6 1,2-1,6 1,2-1,6 1,2-1,6 1,8 1,6
С. ulcerans 675 - диа- 10-7 14 7 10 10 13 9 5 Рост отсут
метр большинства колоний не менее 0,2 мм 0,2-0,4 0,2-0,4 0,2-0,4 0,2-0,4 0,2-0,4 0,2-0,4 0,2-0,4
10-6 20 12 13 14 22 17 13 *
0,2-0,4 0,2-0,4 0,2-0,4 0,2-0,4 0,2-0,4 0,2-0,4 0,2-0,4
С. xerosis 1911 - 10-7 10 13 13 8 5 8 6 5
темно-серые, круглые, 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,2 1,2
выпуклые, блестящие,
диаметр большинства 10-6 51 48 53 57 46 47 52 *
колоний не менее 0,5 мм 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,2
Специфическая активность
Через 44-48 ч инкубации при температуре (37±1)0С при визуальном просмотре чашек колонии коринебактерий должны выглядеть следующим образом:
С. diphtheriae gravis 665 - темно-серые, шероховатые, со складчатой поверхностью, неровными (изрезанными) краями (тип "маргаритки"), диаметром 2,0-3,5 мм (рис. 1)
10-'
10-(
21 19 19 24 25 20 14 21
3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 4,0 2,5-3,5
65 65 72 79 66 75 48 44
3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 2,5-3,5
С. diphtheriae mitis 6765 10-7 19 17 21 19 23 23 8 18
- темно-серые, круглые, гладкие, блестящие, с 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 4,0 2,5-2,8
ровными краями, диаме- 10-6 51 61 50 54 55 61 50 42
тром 1,5-3,0 мм (рис. 2) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 4,0 2,5-2,8
С. ulcerans 675 - 10-7 14 7 10 10 16 13 6 Рост отсутствует
серовато-черные, круглые, выпуклые, 0,5-1,5 0,5-1,5 0,5-1,5 0,5-1,5 0,5-1,5 0,5-1,5 2,5
блестящие, диаметром 10-6 24 14 17 16 24 18 13 *
0,5-1,5 мм (рис. 3) 0,5-1,5 0,5-1,5 0,5-1,5 0,5-1,5 0,5-1,5 0,5-1,5 1,5
С. xerosis 1911 - 10-7 10 13 13 7 5 7 6 6
серовато-черные, круглые, выпуклые, 1,2-2,0 1,2-2,0 1,2-2,0 1,2-2,0 1,2-2,0 1,2-2,0 2,5-2,8 2,2 мм
блестящие, диаметром 10-6 54 48 61 58 46 47 52 *
1,2-2,0 мм (рис. 4) 1,2-2,0 1,2-2,0 1,2-2,0 1,2-2,0 1,2-2,0 1,2-2,0 2,5-2,8
П р и м е ч а н и е . В числителе - количество колоний (среднее значение); в знаменателе - диаметр (мм). * - Данные отсутствуют.
С. xerosis 1911 на КБА - темно-серые, круглые, выпуклые, блестящие, гладкие, с ровными краями, диаметр большинства колоний 1,0 мм. На сывороточном агаре - круглые бесцветные гладкие колонии диаметром 1,2 мм. На КТА - сероватые гладкие колонии диаметром 1,2 мм.
Через 44-48 ч инкубации при визуальном просмотре чашек колонии коринебактерий выглядели следующим образом:
С. diphtheriae gravis 665 на КБА - темно-серые, шероховатые, со складчатой поверхностью и неровными (изрезан-
Рис. 1. Рост тест-штамма С. diphtheriae gravis 665 на КБА через 48 ч инкубации (разведение 10-6).
Рис. 3. Рост тест-штамма С. ulcerans 675 на КБА через 48 ч инкубации (разведение 10-6).
Рис. 2. Рост тест-штамма С. diphtheriae mitis 6765 на КБА через 48 ч инкубации (разведение 10-6).
Рис. 4. Рост тест-штамма С. xerosis 1911 на КБА через 48 ч инкубации (разведение 10-6).
ными) краями (тип «маргаритки»), диаметром 3,5 мм. На сывороточном агаре - круглые, бесцветные, с неярко выраженным центром и неровными краями, диаметром 4,0 мм. На КТА - черные слегка уплощенные колонии с незначительной радиальной исчерченностью и неровными краями, диаметром 2,5-3,5 мм;
С. diphtheriae mitis 6765 на КБА - темно-серые, круглые, гладкие, блестящие, с ровными краями, диаметром 3,0 мм.
На сывороточном агаре - круглые, гладкие, слегка выпуклые бесцветные колонии диаметром 4,0 мм. На КТА - черные гладкие блестящие колонии диаметром 2,5-2,8 мм;
С. ulcerans 675 на КБА - серовато-черные, круглые, выпуклые, блестящие колонии диаметром 0,5-1,5 мм. На сывороточном агаре - круглые, блестящие, бесцветные, гладкие колонии диаметром 2,5 мм. На КТА рост отсутствовал;
С. xerosis 1911 на КБА - серовато-черные, круглые, вы-
Таблица 2
Ингибирующие свойства питательной среды для выделения коринебактерий КБА
Показатель; характеристика и нормы по ТУ 9398-019-78095326-2006 Серия 294 Серия 295 Серия 296 Серия 297 Серия 298 Серия 299 Контроль роста на питательной среде № 1 ГРМ
разведение, количество колоний, морфология, диаметр
Ингибирующие свойства среды. Питательная среда должна полностью подавлять рост тест-штаммов S. aureus Wood-46 и S. pyogenes Dick
I на всех засеянных чашках Петри при посеве по 0,1 мл микробной взвеси через 46-48 ч инкубации при температуре (37±1)0С
Staphylococcus aureus 10-4 Рост от- Рост отсут- Рост от- Рост от- Рост от- Рост от- Сплошной рост
Wood-46 сутствует ствует сутствует сутствует сутствует сутствует
Streptococcus pyogenes 10-4 Рост от- Рост отсут- Рост от- Рост от- Рост от- Рост от- Сплошной рост
Dick I сутствует ствует сутствует сутствует сутствует сутствует
Таблица 3
Биологические показатели питательной среды для выделения коринебактерий (КБА)
Показатель Количество колоний (среднее значение), диаметр
Серия 297 Серия 296 Серия 299 Серия 298 Серия 295 Серия 294
10-6 10-7 10-6 10-7 10-6 10-7 10-6 10-7 10-6 10-7 10-6 10-7
Оценка всхожести
клеток, времени фор-
мирования колоний C. diphtheriae биовара
gravis токсигенный
№ 665 интенсивности
их роста, размера
и культурально-морфологических
свойств:
через 20-24 ч 215 55 332 73 196 59 295 77 253 56 273 61
2 мм 2 мм 2,4 мм 1,9 мм 2,5 мм 2,25 мм 2,25 мм 2,15 мм 1,9 мм 2,25 мм 2,15 мм 2,1 мм
через 48 ч 225 57 301 74 197 58 299 78 260 56 283 62
4,5 мм 4,5 мм 5,25 мм 5,5 мм 4,0 мм 5,0 мм 4,0 мм 5,25 мм 4,0 мм 5,5 мм 4,25 мм 5,25 мм
Оценка ингибирую-
щей активности в от-
ношении сопутствующей микрофлоры S. aureus № 25923:
через 20-24 ч Роста Роста Роста Роста Роста Роста Роста Роста Роста Роста Роста Роста
нет нет нет нет нет нет нет нет нет нет нет нет
через 48 ч Роста Роста Роста Роста Роста Роста Роста Роста Роста Роста Роста Роста
нет нет нет нет нет нет нет нет нет нет нет нет
пуклые, блестящие, диаметром 1,2-2,0 мм. На сывороточном агаре - круглые, блестящие, бесцветные выпуклые колонии диаметром 2,5-2,8 мм. На КТА - серовато-черные блестящие выпуклые колонии диаметром 2,2 мм.
При оценке ингибирующей активности всех серий питательной среды КБА отмечено отсутствие роста S. aureus Wood-46 и S. pyogenes DickI на всех засеянных чашках Петри при посеве по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10-4 в течение 48 ч при температуре (37±1)oC. На контрольной питательной среде № 1 ГРМ наблюдался сплошной рост вышеуказанных культур.
Биологические свойства шести серий испытуемых образцов питательной среды на соответствие требованиям ТУ 9398-019-78095326-2006 представлены в табл. 1 и 2.
Таким образом, питательная среда для выделения коринебактерий (КБА) по биологическим показателям:
- соответствует требованиям ТУ 9398-019-780953262006.
- не уступает КТА на основе ГРМ-агара.
Этап 2. Испытания питательной среды для выделения коринебактерий (КБА) на соответствие МУК 4.2.3065-13
Суточные культуры C. diphtheriae биовара gravis ток-сигенный № 665 и S. aureus № 25923, выращенные на сывороточном агаре, смывали физиологическим раствором и готовили бактериальные суспензии. Контроль оптической плотности осуществляли с помощью денситометра для определения концентрации клеток по Мак-Фарланду DEN-1 (Bio-San Ltd.) со значением 3,2. Из исходных взвесей готовили
Таблица 4
Биологические показатели питательной среды для выделения коринебактерий (ГРМ-агар с 10% крови крупного рогатого скота и 2% теллурита калия)
Показатель Количество колоний (среднее значение), диаметр
серия 387 серия 728 серия 1033
10-6 10-7 10-6 10-7 10-6 10-7
Оценка всхожести клеток, времени формирования колоний C. diphtheriae биовара gravis токсигенный № 665 интенсивности их роста, размера и культурально-морфологических свойств:
через 20-24 ч 209 87 311 77 353 77
1,82 мм 2,00 мм 1,6 мм 1,5 мм 1,75 мм 1,65 мм
через 48 ч (рис. 5) 209 89 329 74 363 77
3,5 мм 3,75 мм 2,65 мм 2,5 мм 2,75 мм 2,6 мм
Оценка ингибирующей активности в отношении сопутствующей микрофлоры S. aureus № 25923:
через 20-24 ч Роста нет Роста нет Роста нет Роста нет Роста нет Роста нет
через 48 ч Роста нет Роста нет Роста нет Роста нет Роста нет Роста нет
Рис. 5. Рост тест-штамма C. diphtheriae биовара gravis токси-генный № 665 на КБА через 48 ч инкубации (разведение 10-6).
последовательные разведения в физиологическом растворе согласно п. 10.1 МУК 4.2.3065-13. Из двух последних разведений C. diphtheriae биовара gravis токсигенный № 665 и S. aureus № 25923 (6-е и 7-е разведения) по 0,1 мл культуры вносили на две чашки с испытуемой средой и досуха втирали стеклянным шпателем. В качестве контрольной питательной среды использовали ГРМ-агар (серии 297-294) с добавлением 10% крови крупного рогатого скота (НПО «Лейтран») и 2% теллурита калия. Для каждой серии испытуемой питательной среды - КБА и КТА на основе ГРМ-агара - делали три линейки последовательных разведений с последующим расчетом среднего значения.
При оценке всхожести клеток, времени формирования колоний C. diphtheriae биовара gravis токсигенный № 665, интенсивности роста, размера и культурально-морфологических свойств через 20-24 ч отмечено, что колонии этого штамма на всех шести сериях КБА имели одинаковую морфологию: серые с темно-серым центром, шероховатые, полублестящие, несколько уплощенные, с неровным краем, с незначительной радиальной исчерченностью, диаметром 1,9-2,4 мм, с намеком на приподнятость в центре, крошащиеся. На КТА - темно-серые, цвета асфальта, шероховатые, плосковатые, с неровным краем, незначительной радиальной исчерченно-стью, диаметром 1,6-2,0 мм, приподнятые в центре, крошащиеся.
Через 48 ч инкубации морфология C. diphtheriae биовара gravis токсигенный № 665 также не отличалась: на КБА колонии тест-штамма темно-серые, шероховатые, с неровным краем, радиальная исчерченность, «маргаритка», диаметром 4,0-5,5 мм, крошатся. На КТА - темно-серые, цвет асфальта, шероховатые, «маргаритка», с неровным краем, приподнятые (можно сказать, более выпуклые по сравнению с КБА), диаметром 2,5-3,7 мм, радиальная исчерченность, приподнятость в центре, крошатся.
Оценка ингибирующей активности в отношении сопутствующей микрофлоры показала отсутствие роста S. aureus № 25923 через 24-48 ч инкубации как на КБА, так и на всех сериях питательной среды ГРМ-агара с добавлением 10% крови крупного рогатого скота и 2% теллурита калия.
На протяжении всего эксперимента наблюдалась однородность культурально-морфологических признаков C. diphtheriae в сравнении с контрольными средами, что подтверждает ростовую ценность испытуемых питательных сред (табл. 3, 4).
Заключение. По результатам совместных межучрежденческих испытаний можно сделать следующие выводы:
1) питательная среда КБА обладает гарантированной стабильностью при выделении токсигенных С. diphtheriae, а также нетоксигенных коринебактерий и других представителей этого рода при минимальном их содержании в аналите. Все шесть серий КБА обеспечивают визуальное обнаружение роста культур СогупеЬа^епит в виде соответствующих колоний на поверхности питательной среды;
2) данная среда обеспечивает предварительную внутривидовую дифференциацию по морфологии выросших колоний;
3) на КБА подавляется рост стафилококков и стрептококков;
4) КБА выгодно отличается простотой приготовления в лабораторных условиях, исключающей необходимость внесения ех temporae кровяных добавок;
5) процент выявляемости возбудителей дифтерии на КБА более 90%;
6) по биологическим показателям питательная среда КБА соответствует требованиям ТУ 9398-019-78095326-2006 и МУК 4.2.3065-13 «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции».
Сравнительные испытания питательных сред для выделения и накопления дифтерийных бактерий показали высокое качество КБА. Использование данной питательной среды промышленного производства является важным условием успешной и своевременной диагностики дифтерии в практике здравоохранения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Харсеева Г.Г., Алутина Э.Л., Гасретова Т.Д., Дятлов И.А., Лабуш-кина А.В., Миронов А.Ю. и др. Дифтерия: микробиологические и иммунологические аспекты. М.: Практическая медицина; 2014.
2. Методические указания МУК 4.2.3065-13. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора; 2013.
3. Шепелин А.П. Отечественная питательная среда - Коринеба-кагар для выделения возбудителя дифтерии. Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». 2012; 4: 108-10.
4. Шепелин А.П. Разработка технологии производства панкреатического гидролизата рыбной муки и конструирование на его основе бактериологических питательных сред: Дисс. ... докт. биол. наук. М.; 2012.
5. Шепелин А.П., Татаринцева Н.А., Бизяева Г.В., Артюхин В.И. Питательная среда для выделения дифтерийного микроба. Патент РФ № 2041947; 1995.
6. Методические указания МУК 4.2.2316-08. Методы контроля бактериологических питательных сред. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора; 2008.
Поступила 23.09.15
REFERENCES
1. Kharseeva G.G., Alutina E.L., Gasretova T.D., Dyatlov I.A., Labushkina A.V., Mironov A.Yu. et al. Diphtheria: Microbiological and Immunological Aspects. [Difteriya: mikrobiologicheskie i immunologicheskie aspekty]. Moscow: Prakticheskaya meditsina; 2014. (in Russian)
2. Methodical instructions MUK 4.2.3065-13. Laboratory diagnosis of diphtheria infection. Moscow: Federal center of hygiene and epidemiology of Rospotrebnadzor; 2013. (in Russian)
3. Shepelin A.P. National nutrient medium - Corynebacterial to highlight the causative agent of diphtheria. Kurskiy nauchno-prakticheskiy vest-nik "Chelovek i ego zdorov'e". 2012; 4: 108-10. (in Russian)
4. Shepelin A.P. Development of Technology for Production of Pancreatic Hydrolysate of Fish Meal and Designing on the Basis of Bacteriological Culture Media: Diss. Мoscow; 2012. (in Russian)
5. Shepelin A.P., Tatarintseva N.A., Bizyaeva G.V., Artyukhin V.I. Nutrient Medium for Isolation of Diphtheria Microbe. Patent RF № 2041947; 1995. (in Russian)
6. Methodical instructions MUK 4.2.2316-08. Control methods of bacteriological culture media. Moscow: Federal center of hygiene and epidemiology of Rospotrebnadzor; 2008. (in Russian)
Received 23.09.15
