Отечественная двухфазная питательная среда для культивирования дифтерийных бактерий Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

УДК 576.852.23

© Э Л. Алутина, Г Г. Харсеева, А.Ю. Миронов, 2011

Э.Л. Алутина1, Г.Г. Харсеева1, А.Ю. Миронов2

ОТЕЧЕСТВЕННАЯ ДВУХФАЗНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДИФТЕРИЙНЫХ БАКТЕРИЙ

1ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России 2ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова» Минздравсоцразвития России

Разработана двухфазная питательная среда для культивирования Gorynebacterium diphtheriae с улучшенными ростовыми свойствами: чувствительностью среды, показателем прорастания и скоростью роста дифтерийных бактерий. Предлагаемая двухфазная питательная среда обеспечивает оптимальные условия для культивирования дифтерийных бактерий, позволяющие повысить чувствительность среды в 10 раз, количество колоний - более чем в 2 раза, скорость роста дифтерийных бактерий - в 1,7 раза.

Ключевые слова: Corynebacterium diphtheriae, питательная среда, ростовые свойства.

E.L. Alutina, G.G. Harseeva, A.Yu. Mironov

THE NATIONAL BIPHASE NUTRIENT MEDIUM FOR CULTIVATION OF DIPHTHERIA BACTERIA

The biphase nutrient medium was created for cultivation of Corynebacterium diphtheriae with improved growth qualities: sensitivity of medium, index of growth and velocity of growth of Diphtheria microbes. Offered biphase nutrient medium provides optimal conditions for Diphtheria bacteria cultivation that lead to increase sensitivity of medium in 10 times, quantity of colonies more than in 2 times, velocity of growth of Diphtheria bacteria in 1,7 times.

Key words: Corynebacterium diphtheriae, nutrient medium, growth properties.

Введение. Заболеваемость дифтерией в современных условиях носит спорадический характер [3]. Возбудитель дифтерии продолжает циркулировать среди населения благодаря существованию бактерионосительства токсигенных штаммов дифтерийных бактерий, что создает угрозу возникновения новых эпидемий дифтерии [1, 7, 8]. В сложившейся ситуации диагноз «дифтерия» может быть поставлен без бактериологического подтверждения, что свидетельствует о недостатках в бактериологической диагностике дифтерии [2] и связано со сложностью культивирования дифтерийных бактерий на существующих питательных средах. В настоящее время для культивирования дифтерийных бактерий используют кровяно-теллуритовый агар, среду Клауберга II, среду Тинсда-ля-Садыковой и другие среды, содержащие в своем составе гидролизаты белкового сырья, стимуляторы роста и ингибиторы роста посторонней микрофлоры [4]. Однако при культивировании дифтерийных бактерий на указанных питательных средах единичные колонии возбудителя появляются только через 24 часа, а достаточное их количество, необходимое для дальнейшего проведения бактериологической диагностики, вырастает через 48 и более часов [4, 6].

Разработка новых питательных сред, обеспечивающих оптимальные условия для накопления и выделения дифтерийных бактерий при минимальном их содержании в аналите, остается актуальной проблемой современной медицинской микробиологии.

Цель: разработка питательной среды для культивирования Gorynebacterium diphtheriae с улучшенными ростовыми свойствами: чувствительностью среды, показателем прорастания и скоростью роста дифтерийных бактерий.

Материалы и методы. В качестве стимуляторов роста микроорганизмов в состав плотной фазы питательной среды введены гидролизат панкреатический рыбной муки, стимулятор роста гемо-фильных микроорганизмов, экстракт дрожжевой, в состав жидкой фазы - экстракт дрожжевой и сыворотка крови крупного рогатого скота. В качестве источника энергии и в жидкую, и в плотную фазу добавлена глюкоза. Все компоненты разводили в дистиллированной воде. Для получения плотной фазы использовали агар микробиологический, жидкой фазы — пептон ферментативный. В качестве ингибитора роста сопутствующей микрофлоры применяли раствор теллурита калия.

Питательную среду для культивирования дифтерийных бактерий готовили следующим образом. Плотную (30 мл) и жидкую (10 мл) фазы питательной среды разливали в стеклянные флаконы и стерилизовали при температуре +121° С, давлении 1,0 атм в течение 15 мин, охлаждали до температуры +45° С. В плотную фазу добавляли раствор теллурита калия. Флаконы закупоривали и оставляли в наклонном положении под углом 30° до застывания. В жидкую фазу добавляли сыворотку крови крупного рогатого скота.

Во флаконы с плотной фазой питательной среды с соблюдением правил асептики стерильно над факелом вносили по 10 мл жидкой фазы и герметизировали стерильными пробками.

Разработанная питательная среда имела следующий состав:

• плотная фаза (в г/л): гидролизат панкреатический рыбной муки - 20,0; стимулятор роста гемофильных микроорганизмов - 10,0; натрий хлористый - 4,0; экстракт дрожжевой - 3,0; глюкоза -3,0; агар - 10,0; теллурит калия - 2 % раствор - 13,0 мл;

• жидкая фаза (в г/л): гидролизат панкреатический рыбной муки - 8,0; пептон ферментативный - 8,0; натрий хлористый - 4,0; экстракт дрожжевой - 0,3; глюкоза - 3,0; сыворотка крови крупного рогатого скота - 80,0 мл.

Для проверки стерильности питательной среды флаконы выдерживали 24-48 часов в термостате.

Контроль качества питательной среды осуществляли с помощью тест-штаммов: С. diphtheriae gravis tox+, ВН, серотип 2, штамма Staphylococcus aureus АТСС 25923, полученных из ГКПМ ФГБУ ГИСК им. Л.А. Тарасевича Минздравсоцразвития России, и штамма С. diphtheriae gravis tox+, выделенного от больного дифтерией.

В соответствии с методическими указаниями [5], определяли чувствительность среды, показатель прорастания и скорость роста дифтерийных бактерий.

В качестве контрольной среды использовали кровяно-теллуритовый агар [4].

Проверку чувствительности питательной среды осуществляли путем посева микробной взвеси тест-штаммов из разведений 10-7 и 10-8 в жидкую фазу питательной среды для культивирования дифтерийных бактерий в трех повторностях.

Показатель прорастания микроорганизмов определяли путем посева микробной взвеси на испытуемую и контрольную среду. Отношение среднего числа колоний на испытуемой среде к среднему количеству колоний на контрольной среде, выраженное в процентах, являлось показателем прорастания дифтерийных бактерий.

Скорость роста дифтерийных бактерий определяли по минимальному времени инкубации посевов, за которое обеспечивался отчетливый (не менее 100 жизнеспособных клеток) рост на плотной фазе питательной среды.

Результаты и обсуждение. В результате исследований установлено, что разработанная питательная среда полностью обеспечивала питательные потребности С. diphtheriae. Добавленный в среду 2 % раствор теллурита калия (13 мл/л) ингибировал рост микробов-ассоциантов, содержащихся в большом количестве в аналите.

Анализ результатов сравнительного изучения основных ростовых свойств разработанной и контрольной питательных сред (табл.), полученных при проведении лабораторных испытаний, свидетельствовал о том, что разработанная питательная среда обладала высокой чувствительностью - 10-8 в отношении всех испытуемых штаммов, в то время как показатель чувствительности контрольной среды составил 10-7. Повышенная скорость роста дифтерийных бактерий на предлагаемой среде проявлялась при меньшем времени культивирования. Так, на разработанной питательной среде визуально обнаруживали колонии дифтерийных бактерий через 13,5-14 часов культивирования, тогда как на контрольной среде - только через 24-48 часов. Помимо этого, количество колоний, выросших на предлагаемой среде, было больше, чем на кровяно-теллуритовом агаре. Так, при культивировании взвеси дифтерийных бактерий из разведения 10-6 на разработанной питательной среде количество колоний составило 120-170, на контрольной среде - 50-63. Показатель прорастания дифтерийных бактерий разработанной питательной среды (254-270 %) достоверно (р < 0,05) отличался от такового контрольной среды (38-39 %).

Таблица

Ростовые свойства питательных сред для культивирования дифтерийных бактерий_

Ростовые свойства среды Тест-штаммы Разработанная среда Контрольная среда (кровянотеллуритовый агар)

Чувствительность среды С. diphtheriae gravis tox+, ВН, серотип 2 (контрольный) 10-8 10-/

С. diphtheriae gravis tox+ (циркулирующий) 10-8 10-/

Стафилококк Нет роста

Скорость роста микробов (часы) С. diphtheriae gravis tox+, ВН, серотип 2 (контрольный) 14 24

С. diphtheriae gravis tox+ (циркулирующий) 13,5 24

Стафилококк Нет роста

Количество колоний (10-6) С. diphtheriae gravis tox+, ВН, серотип 2 (контрольный) 120-150 50

С. diphtheriae gravis tox+ (циркулирующий) 150-170 63

Стафилококк Нет роста

Показатель прорастания микробов (%) С. diphtheriae gravis tox+, ВН, серотип 2 (контрольный) 270 38

С. diphtheriae gravis tox+ (циркулирующий) 254 39

Двухфазность питательной среды и введение дополнительных стимуляторов роста способствовали повышению показателей ростовых свойств предлагаемой питательной среды за счет сокращения логарифмической фазы роста дифтерийных микробов в процессе культивирования.

Выводы. Предлагаемая двухфазная питательная среда для культивирования дифтерийных бактерий создает оптимальные условия для культивирования дифтерийных бактерий, что обеспечивает улучшенные по сравнению с кровяно-теллуритовым агаром ростовые свойства двухфазной питательной среды с увеличением числа колоний дифтерийных бактерий более чем в 2 раза, увеличением в 1,7 раз их скорости роста, повышением в 10 раз чувствительности среды.

Список литературы

1. Костюкова, Н. Н. Возбудитель дифтерии и условно-патогенные коринебактерии / Н. Н. Костюкова // Клиническая лабораторная диагностика. - 2001. - № 6. - С. 25-31.

2. Максимова, Н. М. Дифтерия в России в 2005-2009 годах / Н. М. Максимова, С. С. Маркина, К. А. Яцковский и др. //Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2010. - № 3. - С. 31-36.

3. Маркина, С. С. Эпидемиологическая ситуация по дифтерии в России в настоящее время / С. С. Маркина, Н. М. Максимова, В. В. Черкасова, Н. А. Кошкина // Вакцинация. - 2006. - № 3. -С. 7-9.

4. Методические указания МУ 4.2.698-98 «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции». - М., 1998. - 47 с.

5. Методические указания МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред» - М. : Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. -66 с.

6. Миронов, А. Ю. Основы клинической микробиологии и иммунологии : учеб. пос. / А. Ю. Миронов, Г. Г. Харсеева, Т. В. Клюкина. - Ростов-на-Дону : ГОУ ВПО «Первый моск. мед. ун-т им. И.М. Сеченова», ГОУ ВПО «Рост. гос. мед. ун-т», ГОУ СПО «Мед. колледж № 1» Департамента здравоохранения г. Москвы, 2011. - 248 с.

7. Харсеева, Г. Г. Состояние иммунитета к дифтерии у населения г. Ростова-на-Дону и Ростовской области в последние годы / Г. Г. Харсеева, А. Р. Квасов, Э. Л. Алутина и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2009. - № 6. - С. 80-83.

8. Харсеева, Г. Г. Патогенные свойства С. ^рЬШейае, циркулирующих в г. Ростове--на-Дону и Ростовской области в межэпидемический период / Г. Г. Харсеева, Е. П. Москаленко, А. Л. Трухачев, Т. В. Митрофанова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. - 2006. - № 6. - С. 6-9.

Алутина Эльвира Львовна, старший лаборант кафедры микробиологии и вирусологии № 2 ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, Россия, 340412, г. Ростов-на-Дону, ул. Чкалова, д. 25, тел. 8-918-575-44-65, e-mail: galinagh@bk.ru.

Харсеева Галина Георгиевна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой микробиологии и вирусологии № 2 ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, Россия, 340412, г. Ростов-на-Дону, ул. Чкалова, д. 25, тел. 8-918-575-44-65, email: galinagh@bk.ru.

Миронов Андрей Юрьевич, доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, Россия, 119991, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2, тел. (495) 629-71-19, e-mail: profmironov@mmascience.ru.

УДК 615.373: 577.112.825

© С.С. Бочкарева, А.Г. Лютов, Л.И. Новикова, 2011

С.С. Бочкарева1, А.Г. Лютов2, Л.И. Новикова1

ОЦЕНКА СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ОТЕЧЕСТВЕННОГО ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ «ГАБРИГЛОБИН-IgG»

1ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора 2ЗАО «Иммуно-Гем», г. Москва

Проведено сравнительное исследование панели антител коммерческих препаратов иммуноглобулина для внутривенного введения к возбудителям наиболее распространенных бактериальных и вирусных инфекций. Новый отечественный иммуноглобулин «Габриглобин-IgG» содержит широкий спектр антител в высоком титре ко всем изученным возбудителям инфекционных заболеваний, в том числе менингококкам, дифтерийной палочке, коклюшному токсину, хеликобактеру и хламидиям и не уступает по данному показателю отечественным и импортным аналогам.

Ключевые слова: иммуноглобулиновый препарат, специфическая активность.

S.S. Bochkaryeva, A.G. Lyutov, L.I. Novikova

SPECIFIC ACTIVITY EVALUATION OF NATIONAL IMMUNOGLOBULIN MEDICINE FOR INTRAVENOUS ADMINISTRATION «GABRIGLOBIN-IgG»

The comparative research of antibody panels of commercial immunoglobulin preparations for intravenous administration to the most common causative agents of bacterial and viral infections was carried out. New national immunoglobulin «Gabriglobin-IgG» contained a wide range of high-titer antibodies for all studied agents of infectious diseases, including meningococcus, diphtheria bacilli, pertussis toxin, Helicobacter pylori and chlamydia, and not inferior in this indicator both to national and foreign analogues.

Key words: immunoglobulin medicine, specific activity.

Введение. В настоящее время в России ежегодно регистрируется около 30 млн больных инфекционными болезнями, а в годы эпидемических подъемов их число может достигать 60 и более млн. Проблема рациональной терапии инфекций продолжает оставаться острой и в настоящее время не утратила своей актуальности. Перспективным направлением лечения инфекционных заболеваний является терапия иммуноглобулинами для внутривенного введения (ВВИГ), которые, обладая доказанной эффективностью, высокой биодоступностью, являются средствами пассивной защиты, обеспечивая опсонизацию, нейтрализацию и выведение бактерий, вирусов и токсинов. Содержание антител в препарате иммуноглобулина является показателем его качества и зависит от многих факторов: способ получения препарата, инфицированность населения, уровень заболеваемости, экологическая обстановка, напряженность иммунитета, способность населения к иммунному ответу и иммунологи-