CC BY
159
© коллектив авторов, 2014 УДК 579.871.1:579.252.55]:615.33
1Я.Н. Фролова, 2Г.Г. Харсеева, 3А.Ю. Миронов
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К АНТИБИОТИКАМ БИОПЛЕНОЧНЫХ КУЛЬТУР ТОКСИГЕННЫХ ШТАММОВ СОЙУМЕВАСТЕЙШМ О!РИТИЕШАЕ
1ГБОУ БПО Ростовский государственный медицинский университет, Ростов-на-Дону; 2ГБОУ БПО Первый Московский медицинский университет им. И.М. Сеченова
Изучена чувствительность к антибактериальным препаратам типовой и биопленочной культуры музейного штамма Corynebacterium diphtheriae gravis tox+ SV-665, полученного из ГИСК им. Л.А. Тарасевича и циркулирующего в популяции в Ростовской области эпидемического штамма С. diphtheriae gravis tox+, выделенного от больного с диагнозом "локализованная форма дифтерии" бактериологической лабораторией ФГУ 1002 ЦГСЭН СКВО Ростова-на-Дону. Использованы недельная и месячная биопленочные культуры обоих штаммов С. diphtheriae gravis tox+. Чувствительность к антибактериальным препаратам типовой и биопленочных культур музейного и циркулирующего в популяции штаммов возбудителя дифтерии определяли с помощью минимальной подавляющей концентрации (МПК) методом серийных разведений в жидкой питательной среде. Показано, что наиболее эффективными в отношении С. diphtheriae являются цефотаксим, гентамицин, линкомицин, канамицин и цефазолин, к которым чувствительность патогена в составе биопленки не изменяется.
Ключевые слова: антибиотикочувствительность; биопленка; возбудитель дифтерии. Ya.N. Frolova1, G.G. Kharseyeva2, A.Yu. Mironov2
THE SENSITIVITY TO ANTIBIOTICS OF BIOFILM CULTURES OF TOXIGENIC STRAINS CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIAE
1The Rostov state medical university, Rostov-on-Don, Russia; 2 The I.M. Sechenov first Moscow medical university of Minzdrav of Russia, 119992, Moscow, Russia
The article presents analysis of sensitivity to antibacterial preparations of typical and biofilm culture of museum strain of Corynebacterium diphtheriae gravis tox+ SV-665. The strain was obtained from the L.A. Tarasevitch state research institute of standardization and control of medical biological preparations. The second strain C. diphtheriaecirculates gravis tox+ circulates in population of the Rostov oblast and it was recovered from patient with diagnosis of "localized form of diphtheria" by bacteriologic laboratory "1002 CGSEN SKVO" of Rostov-on-Don. The week and month biofilm cultures of both strains of C. diphtheriae gravis tox+ were used. The sensitivity to antibacterial preparations of typical and biofilm cultures of museum and circulating in population strains of agent of diphtheria were detected using minimal suppressing concentration by technique of serial dilutions in fluid growth medium. It is demonstrated that the most effective in respect of C. diphtheriae are such preparations as cefotaxinum, gentamycinum, lincomycin, canamycin and cefasolin. The sensitivity of pathogen in composition of biofilm to these preparations has no changes.
Keywords: antibiotic; sensitivity; biofilm; agent of diphtheria.
Введение. Циркуляция токсигенных штаммов Согте-Ьа^епит diphtheriae в популяции сохраняется, несмотря на проведение вакцинопрофилактики с использованием высо-коиммуногенного препарата - дифтерийного анатоксина [1]. Резервуаром возбудителя являются бактерионосители, имеющие высокий уровень противодифтерийных антитоксических антител [2]. Для борьбы с дифтерийным бактерионосительством используют антибиотики широкого спектра действия (цефтриаксон, цефотаксим, анаэроцеф, линкомицин и др.) [3]. Недостаточная эффективность антибиотикотерапии может быть связана со способностью возбудителя формировать полимикробные ассоциации.
Большинство возбудителей инфекционных заболеваний могут существовать в виде не только свободноплавающих планктонных клеток, но и специфически организованных и прикрепленных к субстратам биопленок, образование которых представляет собой сложнорегулируемый процесс [4]. Развитие таких микробных ассоциаций является одной из форм выживания бактерий не только в окружающей среде, но и в организме инфицированных хозяев [5]. Биопленки -
Для корреспонденции:
Фролова Яна Николаевна, аспирант каф. микробиологии и вирусологии
Адрес: 344022, Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29 Телефон: 8-918-575-44-65
это полимикробные, подвижные, непрерывно изменяющиеся гетерогенные сообщества, внедренные в слизистый слой, состоящий из сахаров и протеинов, формирующих межмикробный матрикс - экзополисахарид [6, 7].
В составе биопленки бактерии приобретают повышенную устойчивость не только к факторам врожденного иммунитета, но и к антибиотикам [9]. Биопленочные микроорганизмы способны выживать при воздействии антибактериальных препаратов в таких высоких концентрациях, которые не могут быть достигнуты в организме человека при стандартных терапевтических дозировках [8, 9]. Биопленки проявляют устойчивость одновременно ко многим антибиотикам из разных групп [8]. В клинических условиях столь высокая выживаемость биопленочных микробов ведет к хронизации инфекционного процесса [10].
Исследование антибиотикорезистентности как самого возбудителя дифтерии, так и продуцируемой им биопленки приобретает в настоящее время особую актуальность в связи с продолжающейся циркуляцией экологического агента дифтерии в человеческой популяции.
Цель исследования - изучение чувствительности к антибактериальным препаратам возбудителя дифтерии в составе биопленки.
Материалы и методы. Объектом исследования послужили типовая и биопленочная культуры музейного штамма C. diphtheriae gravis tox+ SV-665, полученного из Государственного научно-исследовательского института стандартизации и
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 6, 2014
Антибиотикочувствительность типовой и биопленочных культур токсигенных штаммов C. diphtheriae gravis (Мпк в мкг/мл)
Антибиотик Музейный штамм 665 Циркулирующий в популяции штамм
типовая культура биопленочная биопленочная типовая биопленочная биопленочная
культура(1 нед) культура(1 мес) культура культура (1 нед) культура (1 мес)
Ванкомицин 0,9 ± 0,5 2,0 ± 1,6 7,0 ± 1,3* 1,3 ± 0,3 2,3 ± 1,2 1,7 ± 0,6**
Цефотаксим 2,6 ± 0,9 1,2 ± 0,6 6,7 ± 1,0* 7,8 ± 1,0** 6,4 ± 0,8** 6,2 ± 0,7
Анаэроцеф (цефокситин) 0,1 ± 0,2 4,1 ± 0,4* 4,5 ± 0,6* 0,5 ± 0,04 1,0 ± 0,2*, ** 0,3 ± 0,04*, **
Гентамицин 1,1 ± 1,0 1,0 ± 1,0 1,0 ± 0,7 1,0 ± 0,7 1,8 ± 0,6 1,8 ± 0,6
Цефтриаксон 2,2 ± 0,5 5,7 ± 1,5* 4,0 ± 0,9* 4,5 ± 1,0 5,8 ± 0,8 9,0 ± 1,2* **
Линкомицин 0,15 ± 0,3 0,78 ± 0,2 0,06 ± 0,003 6,1 ± 0,9** 7,0 ± 1,1** 7,7 ± 1,3**
Канамицин 0,33 ± 0,04 0,5 ± 0,1 1,6 ± 0,4* 1,0 ± 0,2** 1,0 ± 0,3 1,8 ± 0,6
Цефазолин 0,25 ± 0,05 0,5 ± 0,05* 1,0 ± 0,2* 1,0 ± 0,2** 1,2 ± 0,4 1,1 ± 0,3
Бензилпенициллин 0,19 ± 0,3 1,6 ± 0,7 0,8 ± 0,04 0,4 ± 0,05 4,3 ± 2,1* 4,1 ± 1,0*, **
Примечание. * - достоверные различия (p < 0,05) между МПК типовой и бипленочной культур; ** - достоверные различия (p < 0,05) между МПК соответствующих культур музейного и циркулирующего штаммов C. diphtheriae gravis tox+.
контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича, и циркулирующего в популяции эпидемического штамма C. diphtheriae gravis tox+, выделенного от больного с диагнозом локализованной формы дифтерии бактериологической лабораторией ФГУ 1002 ЦГСЭН СКВО Ростова-на-
Дону.
Тестирование штаммов на способность формировать биопленку проводили по методике P.L. Watnick и соавт. [11]. Для исследования использовали недельную и месячную биопленочные культуры обоих штаммов С. diphtheriae gravis tox+. Предварительно по стандарту Мак Фарланда готовили микробную взвесь дифтерийных микробов густотой 1 млрд микробных тел на 1 мл. Полученную микробную взвесь в разведении 1:100 вносили в объеме 0,1 мл в пробирки и флаконы с 20% сывороточным бульоном и инкубировали в термостате при 370С в течение 7 и 30 сут. Для получения биопленочной культуры из пробирок и флаконов удаляли жидкую фракцию, двукратно промывали дистиллированной водой. Затем при помощи урологического зонда вертикальными обратно-поступательными движениями снимали с поверхности стекла адгезированную биопленочную культуру исследуемого микроорганизма. Полученное содержимое помещали в пробирку типа Эппендорф и центрифугировали при 1,5 тыс/об 10 мин, убирали надосадочную жидкость и при помощи физиологического раствора доводили до объема 1 мл. Готовили 10-кратные разведения биопленочной культуры, после чего в объеме 0,05 мл из разведений 10-6-10-10 производили высев на кровяно-теллуритовый агар, затем на кровяной агар для наращивания биомассы биопленочной культуры.
Чувствительность к антибактериальным препаратам типовой и биопленочных культур музейного и циркулирующего штаммов возбудителя дифтерии определяли с помощью минимальной подавляющей концентрации (МПК) методом серийных разведений (микрометодом) в жидкой питательной среде [8].
Статистическую обработку результатов проводили с использованием статистических пакетов Microsoft Office 2007 и Statistica 6.0 для Windows XP. Достоверность полученных данных оценивали при уровне значимости p < 0,05.
Результаты и обсуждение. Результаты определения чувствительности к антибиотикам, рекомендованным для лечения дифтерии [12], музейного и циркулирующего в популяции токсигенных штаммов C. diphtheriae gravis представлены в таблице. Типовая культура музейного штамма C. diphtheriaе gravis tox+ 665 обладала чувствительностью ко всем указанным антибактериальным препаратам, при этом значения МПК колебались от 0,1 ± 0,2 до 2,6 ± 0,9 мкг/мл. Типовая культура циркулирующего штамма C. diphtheriaе gravis tox+ также оказалась чувствительной ко всем перечисленным препаратам, однако МПК была несколько выше и
варьировала от 0,4 ± 0,05 до 7,8 ± 1 мкг/мл. Чувствительность типовой культуры циркулирующего штамма коринебактерий достоверно (р < 0,05) выше аналогичной музейного штамма по отношению к 4 препаратам: цефотаксиму, линкомицину, канамицину, цефазолину, МПК которых составила 7,8 ± 1,0, 6,1 ± 0,9, 1,0 ± 0,2 и 1,0 ± 0,2 мкг/мл соответственно.
При сравнении типовой и биопленочных культур музейного штамма C. diphtheriae gravis tox+ 665 установлено, что недельная биопленочная культура сохраняла чувствительность к указанным антибактериальным препаратам, МПК которых находилась в пределах от 0,5 ± 0,05 до 5,7 ± 1,5 мкг/мл. Чувствительность недельной биопленочной культуры по результатам определения МПК (р < 0,05) ниже по отношению к анаэроцефу (4,1 ± 0,4 мкг/мл), цефтриаксону (5,7 ± 1,5 мкг/мл) и цефазолину (0,5 ± 0,05 мкг/мл). У месячной биопленочной культуры сохранилась пониженная чувствительность к тем же антибиотикам, что и у недельной (анаэроцеф, цефтриаксон, цефазолин), но спектр препаратов, к которым снижалась антибиотикочувствительность, расширился до 6. Увеличились (р < 0,05) значения МПК ванкомицина (7,0 ± 1,3 мкг/мл), цефотаксима (6,7 ± 1,0 мкг/мл), канамицина (1,6 ± 0,4 мкг/мл) по сравнению с типовой культурой этого же штамма.
Сравнительное исследование антибиотикочувствитель-ности типовой и биопленочных культур циркулирующего токсигенного штамма C. diphtheriae gravis показало, что недельная биопленочная культура сохраняла чувствительность к указанным антибактериальным препаратам, МПК которых находилась в пределах от 1,0 ± 0,2 до 7,0 ± 1,1 мкг/ мл. Чувствительность недельной бипленочной культуры ниже (р < 0,05) типовой по отношению к анаэроцефу (МПК 1,0 ± 0,2 мкг/мл) и бензилпенициллину (МПК 4,3 ± 2,1мкг/мл). У месячной биопленочной культуры пониженная чувствительность сохранилась, как и у недельной, по отношению к анаэроцефу и бензилпенициллину. Наблюдали снижение чувствительности (р < 0,05) и к цефтриаксону, МПК которого составила 9,0 ± 1,2 мкг/мл.
При сравнении музейного и циркулирующего штаммов C. diphtheriaе gravis tox+ обнаружено, что чувствительность типовой культуры циркулирующего штамма по отношению к цефотаксиму, линкомицину, канамицину и цефазолину ниже (р < 0,05), чем у типовой культуры музейного штамма. Подобная тенденция отмечена и у биопленочных культур. Чувствительность к антибиотикам биопленочных культур циркулирующего штамма ниже как у недельной (к цефотак-симу, анаэроцефу, линкомицину), так и у месячной культуры (анаэроцефу, цефтриаксону, линкомицину, бензилпеницил-лину) по сравнению с аналогичной музейной культурой. В отношении ванкомицина наблюдалась обратная зависимость. У месячной биопленочной культуры циркулирующего штам-
ма чувствительность к ванкомицину выше (р < 0,05), чем у аналогичной музейной культуры (МПК составила 1,7,0 ± 0,6 и 7,0 ± 1,3 мкг/мл соответственно).
Типовая музейная и циркулирующая культуры C. diphtheriae gravis tox+ обладают разной степенью чувствительности к антибактериальным препаратам. У циркулирующего штамма устойчивость к антибиотикам ниже, чем у музейного. Возможно, это связано с тем, что на фоне существующей персистенции токсигенных штаммов C. diphtheriae при лечении различных воспалительных заболеваний используют антибиотики широкого спектра действия, что и может послужить причиной развития множественной анти-биотикорезистентности возбудителя. Понижение антибиоти-кочувствительности циркулирующего штамма C. diphtheriae связано и с его способностью формировать в организме микробную биопленку. Биопленки имеют гетерогенный экзопо-лисахаридный матрикс, который не только образует единую структуру, но и заполняет межклеточные пространства, формируя трехмерную фильтрующую систему [8]. В результате биопленки экранируют пепдидогликан и угнетают доставку антибактериальных препаратов к бактериальным клеткам. Использованные антибиотики обладают способностью полностью или частично нарушать синтез пептидогликана (це-фазолин, цефатоксим, бензилпенициллин), а также ингиби-руют фермент транспептидазу, участвующую в биосинтезе мукопептида клеточной стенки (ванкомицин, цефтриаксон, анаэроцеф). В результате МПК антибиотика повышается, а чувствительность биопленочной культуры снижается [13]. Вероятное использование данных антимикробных препаратов при лечении дифтерийной инфекции может привести к формированию антибиотикорезистентных культур бактерий, входящих в состав биопленки C. diphtheriae.
Заключение. Наиболее эффективными в отношении возбудителя дифтерийной инфекции являются такие антибактериальные препараты, как цефотаксим, гентамицин, линкоми-цин, канамицин и цефазолин, к которым чувствительность C. diphtheriae в составе биопленки не изменяется.
ЛИТЕРАТУРА
1. Голуб А. В. Бактериальные биопленки - новая цель терапии? Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2012; 4 (1): 23-30.
2. Елинов Н.П. Структурированные и неструктурированные формы существования микромицетов в искусственных и естественных условиях. Проблемы медицинской микологии. 2009; 11 (3): 3-9.
3. Иванова В.В., Родионова О.В., Аксенов А.А. и др. Дифтерия у детей. СПб.: Политехника; 2000.
4. Костюкова Н.Н. Уроки дифтерии. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1999; 2: 92-6.
5. Куклева Л.М., Ерошенко Г.А., Видяева Н.А., Кутырев В.В. Бактериальная биопленка и особенности ее образования у возбудителя чумы и других патогенных иерсиний. Проблемы особо опасных инфекций. 2011; 110.
6. Сависько А.А., Костинов М.П., Харсеева Г.Г., Лабушкина А.В., Алутина Э.Л. Состояние иммунитета к дифтерии и столбняку у рожениц в раннем послеродовом периоде. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011; 6: 77-82.
7. Чеботарь И.В., Маянский А.Н., Кончакова Е.Д., Лазарева А.В., Чистякова В.П. Антибиотикорезистентность биопленочных бактерий. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2012; 4 (1): 51-7.
8. Харсеева Г.Г., Миронов А.Ю., Фролова Я.Н., Лабушкина А.В. Способность к формированию биопленки возбудителем дифтерии. Клиническая лабораторная диагностика. 2013; 2: 36-8.
9. МУ 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: Методические указания. М.; 2004.
10. Aslam S., Darouiche R.O. Role of antibiofilm-antimicrobial agents in controlling device-related infections. Int. J. Artif. Organs. 2010; 34: 752-8.
11. Pintucci J.P., Corno S., Garotta M. Biofilms and infections of the upper respiratory tract. Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 2010; 14: 683-90.
12. Donlan R.M., Costerton J.W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganism. Clin. Microbiol. Rev. 2002; 15: 167-93.
13. Hall-Stoodley L., Stoodley P. Evolving concepts in biofilm infections. Cell Microbiol. 2009; 11 (7): 1034-43.
14. Watnick P., Kolter R. Biofilm, city of microbes. J. of Bacteriol. 2000; 182 (10): 2675-9.
REFERENCES
1. Golub A. Bacterial biofilms - a new goal of therapy? Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya. 2012; 4 (1): 23-30. (in Russian)
2. Elinov N.P. Structured and unstructured forms of existence micromycetes in vitro and in vivo. Problemy meditsinskoy mikologii. 2009; 11 (3): 3-9. (in Russian)
3. Ivanova V.V., Rodionova O.V., Aksenov A.A. Diphtheria in children. Sankt-Petersburg: Politekhnika; 2000. (in Russian)
4. Kostyukova N.N. Lessons diphtheria. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 1999; 2: 92-6.
5. Kukleva L.M., Eroshenko G.A., Vidyaeva N.A., Kutyrev V.V. Bacterial biofilm formation and in particular its plague pathogen and other pathogenic Yersinia. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2011; 110. (in Russian)
6. Savis'ko A.A., Kostinov M.P., Harseeva G.G., Labushkina A.V., Alutina E.L. The state of immunity to diphtheria and tetanus among pregnant women in the early postpartum period. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2011; 6: 77-82. (in Russian)
7. Chebotar' I.V., Mayanskiy A.N., Konchakova E.D., Lazareva A.V., Chistyakova V.P. Antimicrobial Biofilm bacteria. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya. 2012; 4 (1): 51-7. (in Russian)
8. Harseeva G.G., Mironov A.Yu., Frolova Ya.N., Labushkina A.V. The ability to form biofilms diphtheria. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2013; 2: 36-8. (in Russian)
9. MU 4.2.1890-04. Determination of the sensitivity of microorganisms to antibiotics: Guidelines. Moscow; 2004.
10. Aslam S., Darouiche R.O. Role of antibiofilm-antimicrobial agents in controlling device-related infections. Int. J. Artif. Organs. 2010; 34: 752-8.
11. Pintucci J.P., Corno S., Garotta M. Biofilms and infections of the upper respiratory tract. Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 2010; 14: 683-90.
12. Donlan R.M., Costerton J.W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganism. Clin. Microbiol. Rev. 2002; 15: 167-93.
13. Hall-Stoodley L., Stoodley P. Evolving concepts in biofilm infections. Cell Microbiol. 2009; 11 (7): 1034-43.
14. Watnick P., Kolter R. Biofilm, city of microbes. J. of Bacteriol. 2000; 182 (10): 2675-9.
Поступила 23.04.13
