CC BY
198
УДК 576.852.23
ОТЕЧЕСТВЕННАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА - КОРИНЕБАКАГАР ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ДИФТЕРИИ
© Шепелин А.П.
ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора, Оболенск
E-mail: shepelin.rabota@rambler.ru
Разработана питательная среда коринебакагар для культивирования Corynebacterium diphtheriae с улучшенными ростовыми свойствами. Коринебакагар содержит гидролизат панкреатический рыбной муки - 20,0; стимулятор роста гемофильных микроорганизмов - 10,0; натрий хлористый - 5,0; глюкоза - 0,5; агар микробиологический - 11,0; тел-лурит калия - 2% раствор - 12,5 мл. Предлагаемая питательная среда обеспечивает оптимальные условия для культивирования дифтерийных бактерий, позволяющие повысить высеваемость коринебактерий более чем в 2 раза, скорость роста - в 1,8 раз. Коринебакагар рекомендуется к использованию в практике здравоохранения при проведении бактериологического анализа.
Ключевые слова: Corynebacterium diphtheria, питательная среда, коринебакагар, ростовые свойства.
DOMESTIC NUTRIENT MEDIUM - CORYNEBACAGAR FOR ISOLATING THE CAUSATIVE
AGENT OF DIPHTHERIA Shepelin A.P.
SSC of Applied Microbiology & Biotechnology, Obolensk
A nutrient medium named corynebacagar has been developed for cultivation of Corynebacterium diphtheria with the improved growth properties. Corynebacagar contains pancreatic hydrolysate of fish meal - 20.0; hemophilic microorganisms growth stimulator - 10.0; sodium chloride - 5.0; glucose - 0.5; microbiological agar - 11.0; potassium tellurite (2% solution) -
12.5 ml. The proposed medium provides the optimum conditions for cultivation of diphtheria bacteria allowing doubling the isolation rate of corynebacteria, and increasing the speed of growth - more than 1.8 times. Corynebacagar is recommended for using in public health practice when conducting a bacteriological analysis.
Keywords: Corynebacterium diphtheria, medium, corynebacagar, growth properties.
Возбудитель дифтерии постоянно циркулирует среди населения благодаря существованию бактерионосительства токсигенных штаммов дифтерийных бактерий, что создает угрозу возникновения новых вспышек дифтерии [1, 5].
Для выделения коринебактерий из инфицированного материала в соответствии с приказом Минздрава СССР № 450 «О мерах по предупреждению заболеваемости дифтерией»в практике здравоохранения широко используются среды лабораторного приготовления - кровяной теллу-ритовый агар и среда Клауберга II. В состав этих сред входит сухой питательный агар, а в качестве стимулятора роста — кровь крупного рогатого скота [2]. Однако при культивировании дифтерийных бактерий на указанных питательных средах единичные колонии возбудителя появляются только через 24 часа, а достаточное их количество, необходимое для дальнейшего проведения бактериологического исследования, вырастает через 48 и более часов [2, 4].
В отделе питательных сред ФБУН ГНЦПМБ для культивирования возбудителя туляремии и легионеллёза разработаны сухие питательные среды, содержащие в качестве заменителя крови -стимулятор роста гемофильных микроорганизмов (ТУ 64-15-119-909), полученный путём фермента-
тивного гидролиза суспензии чёрного альбумина с последующей сушкой методом распыления. В этой связи представляет интерес определить возможность использования стимулятора роста гемофильных микроорганизмов взамен крови в составе сред для культивирования коринебактерий.
Целью исследования явилась разработка питательной среды - коринебакагар для выделения возбудителя дифтерии с улучшенными ростовыми свойствами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве стимуляторов роста микроорганизмов в состав питательной среды введены гидролизат панкреатический рыбной муки и стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, в качестве источника энергии - глюкоза. Все компоненты разводили в дистиллированной воде. Для получения среды необходимой плотности использовали агар микробиологический. В качестве ингибитора роста сопутствующей микрофлоры применяли раствор теллурита калия.
Питательную среду для выделения дифтерийных бактерий [6] готовили следующим образом: смешивали панкреатический гидролизат рыбной
муки, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, натрий хлористый, глюкозу, агар микробиологический в смесителе барабанного типа. Полученный сухой препарат расфасовывали в ламинированные пакеты или стеклянные банки с ввинчивающейся крышкой. Для приготовления плотной питательной среды содержимое пакета или банки (42 г) растворяли в 1 л дистиллированной воды, тщательно размешивали, доводили до кипения и кипятили 1-2 мин при перемешивании, стерилизовали при 1 атм. (+121°С) в течение 20 мин. После охлаждения до 45-60°С добавляли
12.5 мл 2% раствора теллурита калия и разливали по чашкам Петри.
Разработанная питательная среда имела следующий состав(в г/л): гидролизат панкреатический рыбной муки - 20,0; стимулятор роста гемофильных микроорганизмов - 10,0; натрий хлористый - 5,0; глюкоза - 0,5; агар микробиологический - 11,0; теллурит калия - 2% раствор -
12.5 мл.
Для проверки стерильности чашки с питательной средой выдерживали 24-48 часов в термостате.
Контроль качества питательной среды осуществляли с помощью тест-штаммов: С.
diphtheriaegravis 3649, С. diphtheriaemitis 143, C. xerosis 1911, Stapylococcus аигеш Biomico 209p, полученных из ГКПМ ФГБУ ГИСК им. Л.А. Та-расевича Минздравсоцразвития.
В соответствии с методическими указаниями [3] определяли ростовые свойства разработанной питательной среды для выделения дифтерийных бактерий через 48 часов культивирования.
В качестве контрольной среды использовали кровяно-теллуритовый агар [2].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что разработанная питательная среда - коринебакагар полностью обеспечивала питательные потребности С. diphtheriae. Добавленный в среду 2% раствор теллурита калия (12,5 мл/л) полностью ингибировал рост S.au^us Biomico 209р при разведении 10-10.
Предлагаемая питательная среда прозрачна в отличие от кровяно-теллуритового агара, что значительно облегчает обнаружение колоний дифтерийных бактерий на поверхности агара.
Анализ результатов сравнительного изучения основных ростовых свойств разработанной и контрольной питательных сред (табл. 1), полученных при проведении лабораторных испытаний, свидетельствовал о том, что разработанная питательная среда обладала высокой чувствительностью - 107 в отношении всех испытуемых штаммов, в то время как показатель чувствительности контрольной среды составил - 10-6. Повышенная скорость роста дифтерийных бактерий на предлагаемой среде проявлялась при меньшем времени культивирования. На разработанной питательной среде визуально обнаруживали колонии дифтерийных бактерий через 19-20 часов культивирования, тогда как на контрольной среде - только через 24-48 часов. Количество колоний, выросших на предлагаемой среде, больше, чем на кро-вяно-теллуритовом агаре. При культивировании взвеси дифтерийных бактерий из разведения 10-6 на разработанной питательной среде количество колоний составило от 93±6 до 123±10, на контрольной среде - от 31±4 до 86± 10. При этом выросшие колонии обладали типичной морфологией: округлые, с приподнятым центром, серо-чёр-
Таблица 1
Ростовые свойства питательных сред для культивирования C. diphtheriae
Ростовые свойства среды Тест-штаммы Разработанная среда(коринебакагар) Контрольная среда (кровяно-теллуритовый агар)
1. Размер колоний (мм) C.diphtheriae gravis 3689 і,5-2^ і,5
С. diphtheriae mitis 143 і,5-2^ !,5-2,Q
C. diphtheriae xerosis 1911 2,Q !,Q-і,5
2. Количество колоний C. diphtheriae gravis 3689 94±6 63±7
(посев из разведения C. diphtheriae mitis 143 93±6 31±4
10"6) C. diphtheriae xerosis 1911 123±10 86± 10
3. Чувствительность C. diphtheriae gravis 3689 10"7 10"7
C. diphtheriae mitis 143 10"7 10"7
C. diphtheriae xerosis 1911 10"7 10"7
4. Скорость роста микро- C. diphtheriae gravis 3689 і9^ 24-4S
бов (час) C. diphtheriae mitis 143 і9^ 24-4S
C. diphtheriae xerosis 1911 !9-2Q 24-4S
!Q9
ного цвета, с радиальной исчерченностью (С. Diphtheriae gravis) или гладкие (С. diphtheriae mi-tis). Диаметр образующихся на коринебакагаре колоний через 48 часов культивирования на 0,51,0 мм больше, чем на кровяно-теллуритовом агаре.
Использование оптимального соотношения двух компонентов - стимулятора роста гемофиль-ных микроорганизмов и гидролизата панкреатического рыбной муки способствовали повышению показателей ростовых свойств предлагаемой питательной среды - коринебакагара за счёт сокращения логарифмической фазы роста дифтерийных бактерий в процессе культивирования.
На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
1. Разработана отечественная питательная среда - коринебакагар для выделения C. diphtheriae.
2. Предлагаемая питательная среда - кори-небакагар позволяет обеспечить оптимальные условия для культивирования C. diphtheriae.
3. Разработанная питательная среда - кори-небакагар для выделения возбудителя дифтерии обладает улучшенными по сравнению с кровяно-теллуритовым агаром ростовыми свойствами и
рекомендуется к использованию в практике здравоохранения при проведении бактериологического анализа.
ЛИТЕРАТУРА
1. Яцковский К.А и др. Дифтерия в России в 20052009 годах // Эпидемиология и вакцинопрофилак-тика. - 2010. - № 3. - С. 31-36.
2. Методические указания 4.2.698-98. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. М. : МЗ РФ, 1998. - 47 с.
3. Методические указания 4.2.2316-08. Методы контроля бактериологических питательных сред. -М. : Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. - 66 с.
4. Миронов А.Ю., Харсеева Г.Г., Клюкина Т.В. Основы клинической микробиологии и иммунологии // Учебное пособие. - Ростов н/Д, 2011. - 248 с.
5. Харсеева Г.Г., Москаленко Е.П., Трухачев А.Л., Митрофанова Т.В. Патогенные свойства С. diphtheriae, циркулирующих в г. Ростове-на-Дону и Ростовской области в межэпидемический период // ЖМЭИ. - 2006. - № 6. - С. 6-9.
6. Питательная среда для выделения дифтерийного
микроба: пат. 2041947 Рос. Федерация.
№ 5030693 / 13; заявл. 04.03.92; опубл. 20.08.95.
