CC BY
10
Таблица 1
Шкала стандартов для количественного определения белофора КБ
Таблица 2
Шкала стандартов для количественного определения белофора КД
№ стандартов 1 2 3 4 5 N« стандартов 1 2 3 4 5
Количество стан- Количество стандарт- *
дартного раство- ногораствора ссодер- 0,1 О.з 0,5 0,7
ра с содержанием жанием 1 мг/л (в мл) 1,0
1 мг/мл (в мл) 0.1 0,3 0,5 0,7 1,0 Количество воды (в мл) 0,9 0,7 0,5 0,3 0
Количество воды Содержание белофора 0,3 0.5 0,7 1.0
(в мл) 0,9 0,7 0,5 0,3 0 в пробе (в мг) 0.1
Содержание бело- 0,7
фора (в мг) 0,1 0,3 0,5 1,0
К каждому стандарту прибавляют по 0,13 мл раствора серной кислоты (1:3) и 0,08 мл 2 н. раствора перманганата калия при исследовании белофора КБ (при исследовании белофора КД приготовляют 1,4 мл серной кислоты и 0,4 мл перманганата калия). Реакционные смеси оставляют в темном месте на 7 мин. Затем к каждому стандарту прибавляют по 0,12 мл 2 н. раствора щавелевой кислоты для белофора КБ (а для белофора КД — 0,6 мл), нейтрализуют реакционную смесь насыщенным раствором ацетата натрия до рН, равной 7,0, по индикаторной бумаге, прибавляют по .0,92 мл 0,003 М раствора солянокислого фенил-гидразина (0,44 мл — для белофора КД) и ставят на 30 мин на кипящую водяную баню. Далее образовавшиеся в каждом стандарте гид-разоны экстрагируют гексаном трижды порциями по 2,5 мл в течение 3 мин (для белофора КД — порциями по 5 мл). Все 3 порции экстракта собирают вместе, выпаривают. Полученный сухой остаток растворяют 2,5 мл этилацетата и измеряют величину оптической плотности в кювете шириной 5 мм при длине волны 364 нм. По полученным средним данным строят соответствующие калибровочные графики, которые используют для количественного определения белофоров КБ и КД в воде и в воздухе.
При определении белофоров КБ и КД в воздухе пробы отбирают на бумажный фильтр со скоростью 15—20 л/мин. Затем белофоры смывают с фильтров водой и анализируют водные растворы, как указано выше. Контролем служит «смыв» из бумажного фильтра, не использованного для анализа.
ЛИТЕРАТУРА. Губен-Вейль. Методы органической химии Ч. 2. М., 1963, с. 442. — У отер с У.-А. Механизмы окисления органических соединений. М.. 1966, с. 146—148. — Ьа11пак У. — "Л. СИгота^г.", 1964, V. 14, р. 482—484.
Поступила 24/1V 1975 г.
УДК 576.851.49 (Salmonella).01:631.46].083.31
Г. В. Меренюк, AI. И. Тарков, М. Г. Бранд
КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ САЛЬМОНЕЛЛ ИЗ ПОЧВЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЖИДКИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
.Молдавский научно-исследовательский институт гигиены и эпидемиологии, Кишинев
Нашей задачей явилась микробиологическая оценка качества некоторых наиболее широко используемых в практике питательных сред, предназначенных для бактериологической диагностики сальмонеллезов, разработка количественного метода выделения сальмонелл из почвы с использованием жидких питательных сред.
Изучали плотную питательную среду Плоскирева и жидкую среду Молдавского научно-исследовательского института гигиены и эпидемиологии (МНИИГЭ). Тест-объектом был избран возбудитель Salm, typhimurium. При постановке опытов готовили инокулум микроорганизма по обычной схеме — центрифугирование и отмывание 18—20-часовой бульонной культуры, суспендирование в физиологическом растворе, определение концентрации клеток в 1 мл турбидиметрическим методом, раститровку инокулума до необходимой концентрации. Качество питательных сред оценивали по проценту роста к ожидаемому на плотных средах методом микробного числа, на жидкой — методом серийных разведений. Для этого по 0,1 мл инокулума, содержащего 1000 клеток в 1 мл по коли-стандарту, засевали на поверхность 10 чашек Петри с агаром Плоскирева и 10 чашек с 1,5% МПА. В жидкую среду МНИИГЭ без селенита засевали по 1 мл культуры, содержащей 10 и 1 клетку в 1 мл в 10 пробирках с 9—10 мл среды каждой концентрации.
Опыты по количественному выделению сальмонелл из почвы производили следующим образом. Пробы почвы ннокулировали различными количествами возбудителя — от единиц на 10 г до сотен клеток на 1 г почвы. Затем готовили почвенные суспензии обычным способом и раститровывали до нужного разведения. На среду Плоскирева посев производили в количестве 0,1—0,2 мл из соответствующих разведений почвы. На жидкую среду МНИИГЭ без селенита и с содержанием 0,4 и 0,1% селенита каждое разведение засевали в количестве 1 мл в пробирки с 9—10 мл этой среды и по 10 мл во флаконы с 50 мл среды (посев 1 г почвы). Кроме того, 10 г почвы засевали во флаконы с 100 мл среды с последующим взбалтыванием. После инкубации в течение 18—20 ч при 37° выросшие на среде Плоскирева колонии идентифицировали принятым способом, а из жидкой среды производили высев на среду Плоскирева с дальнейшим обычным ходом анализа. Количественный учет при прямом посеве на среду Плоскирева производили, исходя их количества выросших колоний сальмонелл, количества засеянного материала и почвенного разведения, а при посеве на жидкую среду — только из расчета наибольшего разведения, дающего положительный результат, т. е. фактически определяли лишь титр сальмонелл.
Для оценки качества среды Плоскирева и жидкой среды МНИИГЭ без селенита по сравнению с 1,5 МПА проведено 6 серий опытов по вышеописанной методике. На среде МНИИГЭ процент высеваемости, исходя из 1000 клеток в 1 мл по коли-стандарту, составил 33% (45^-21), на 1,5% МПА —27% (38ч-16) и на среде Плоскирева всего 5,2% (8,5-И,9). Иначе говоря, на среде МНИИГЭ и 1,5% МПА выросло практически одинаковое количество клеток, тогда как на среде Плоскирева — в 5—6 раз меньше. Тот факт, что на жидкой среде и 1,5% МПА вырастало только 27—33% посеянных клеток по коли-стандарту, объясняется известными ошибками турбидимитрического метода определения концентрации микробных клеток, а также наличием в исходной культуре определенного количества мертвых клеток. Учитывая эти данные, мы предположили, что для выделения из почвы сальмонелл жидкие питательные среды будут лучше, чем плотные. Поставлены 2 серии опытов, каждая по 15 почвенных проб с 2 дозами заражения — десятки и сотни клеток в 1 г почвы.
При дозе заражения десяток клеток в 1 г почвы на среде Плоскирева положительным оказался только 1 образец, на селенитовой среде с 0,4% концентрации селенита — 9 образцов, а при дозе заражения сотен соответственно 3 и 12 образцов. Несмотря на малое количество наблюдений, эти данные свидетельствуют о преимуществе использования для выделения из почвы сальмонелл селенитовой среды МНИИГЭ перед средой Плоскирева, проявляющемся в значительно большем про-
центе положительных результатов. Однако на селенитовой среде все же высевается незначительное количество внесенных в почву клеток — 1 —10 клеток при дозе заражения от десятка до сотен клеток в 1 г почвы. Возникло предположение, что и эта среда проявляет ингибирую-щий эффект по отношению к указанному возбудителю.
С учетом изложенных выше результатов дальнейшие исследования преследовали цели: определить чувствительность количественного метода выделения сальмонелл из почвы на минимальных дозах заражения; изучить возможность выделения сальмонелл из почвы не только на среде МНИИГЭ в официальной прописи (0,4% селенита), но и при более низких концентрациях селенита (0,1%) и без внесения ингибитора в среду; выявить значение механического состава почвы на высеваемость сальмонелл. Исследования проводились по описанной выше методике с 4 средними дозами заражения от 0,3 (3 на 10 г) до 445 клеток в 1 г почвы. Анализ результатов проводили по 2 критериям — проценту положительных проб и среднему проценту выделенных клеток от количества внесенных. Последний рассчитывали путем перевода обнаруженных титров сальмонелл в индексы с последующим подсчетом средней величины каждой серии опытов (тип почвы, вариант среды) и ее ошибки.
По проценту положительных результатов на всех вариантах сред ^ методика оказалась довольно чувствительной. Даже минимальная доза заражения, исчисляемая 3—5 клетками в 10 г почвы, давала положительные результаты в 24—72% случаев. С увеличением дозы заражения увеличивался процент положительных проб: при дозе 370—445 клеток в 1 г в тяжелосуглинистой почве он составлял 75—93, а в супесчаной — 100. Самым лучшим оказался вариант без селенита, менее значительным — с содержанием 0,1% селенита и наихудшим — вариант в классической прописи. Особенно выраженное токсическое действие выявилось при классическом варианте с высевом сальмонелл из супесчаной почвы. В отдельных случаях между вариантами сред обнаружена существенная разница, в других — явно выраженное различие. В целом на всех вариантах сред процент положительных проб выше из супесчаной почвы, хотя при дозах заражения 0,3—0,5 и 3,1—3,5 клетки в 1 г почвы разница несущественна, по-видимому, из-за недостаточного количества наблюдений. Разница в проценте положительных анализов между типами почв четко прослеживается при более высоких дозах w заражения.
Еще более четкие результаты получены при разработке материала по проценту выделенных клеток возбудителя от количества внесенных. Процент высеваемости возрастает с увеличением дозы заражения, но значительно колеблется в зависимости от типа почвы и использованного варианта среды. В отдельных сериях он достигает 100. В количественном отношении лучшим является вариант среды без селенита, хотя при некоторых посевных дозах среда с содержанием 0,1% селенита даже лучше, чем без селенита. Классический вариант наиболее неудовлетворительный — на этой среде в некоторых сериях выделяется в 8 раз меньше клеток, чем при других вариантах. Очень ясно проявляется зависимость процента выделения от типов почвы на всех вариантах сред. Практически во всех сериях из супесчаной почвы выделяется в количественном отношении больше сальмонелл, чем из тяжелосуглинистой.
Выявленные закономерности мы изучали в дальнейшем в натурных условиях. Почвенные образцы, помещенные в стеклянных аквариумах и хранившиеся в естественных метеорологических условиях (17), заражали культурой Salm, typhimurium из расчета 100 тыс. клеток в 1 г Ф почвы по коли-стандарту. Сразу же после внесения и через определенные интервалы времени производили выемку и исследование проб с использованием среды с 0,4% селенита и без селенита. В результате установлено, что сразу после внесения все пробы на обоих вариантах
сред дали положительный результат. Количество высеянных клеток при варианте без селенита равнялось 46 000, а при варианте с селенитом — 8780 на 1 г почвы (разница существенна). Через 1 нед при использовании варианта без селенита все образцы также дали положительный результат; количество клеток равнялось 1790 на 1 г, при варианте с селенитом 2 образца дали отрицательный результат, а количество клеток составляло 850 на 1 г почвы. Через 3 нед при варианте без селенита положительными оказались 12 образцов с средним содержанием 26 клеток в 1 г почвы, а при варианте с селенитом — соответственно 3 положительных образца с содержанием 12 клеток в 1 г почвы. Через 5 нед сальмонеллы не выделялись ни на одном варианте среды. Опыт показывает, что вариант среды без селенита приводит не только к лучшей высеваемости, но и к более длительному выделению сальмонелл из почвы, что имеет важное эпидемиологическое значение.
Диагностические питательные среды, в частности селенитовые, используемые для бактериологической диагностики кишечных инфекций, проявляют сильный ингибирующий эффект по отношению к посторонней микрофлоре, в первую очередь к кишечной палочке. В связи с этим возникла необходимость проверки влияния загрязнения почвы кишечной палочкой на высеваемость сальмонелл. Для этого в 14 вегетационных сосудов одновременно вносили культуру сальмонелл и в 100— 1000 раз больше культуры кишечной палочки, затем периодически производили отбор проб и их исследование на количество кишечной палочки и сальмонелл на среде с селенитом и без селенита. Результаты оказались прежними: при варианте без селенита высеваемость сальмонелл была лучшей.
Поступила IO/X1 1974 г.
УДК 614.76:547.56
J1. П. Козицкая, И. Ф. Казаринова
ОБ ОПРЕДЕЛЕНИИ ФЕНОЛОВ СЛАНЦЕВОЙ СМОЛЫ В ПОЧВЕ И РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ
Всесоюзный научно-исследовательский институт гигиены и токсикологии пестицидов, полимерных и пластических масс, Киев
В литературе мы не нашли работ, посвященных описанию группового метода анализа фенолов сланцевой смолы в почве и растительных продуктах. Ввиду потребности в методах анализа, позволяющих контролировать содержание фенолов, нами был разработан колориметрический способ определения их в почве и растительных продуктах (зерне ржи, пшенице и арбузах).
В основу определения положена цветная реакция с 4-аминоанти-пирином 1 (Б. Ершов и Ф. Борисов; В. Каплин; В. Каплин и Н. Фесен-ко), в результате которой образуются продукты реакции, окрашенные в сиренево-розовые цвета.
Методика определения. Навески почвы (100—200 г) и растительного материала2 (20 г зерна, 50 г арбуза) экстрагировали дистиллированной водой путем взбалтывания в шюттель-аппарате в течение 30 мин
1 Сравнение результатов анализа исследуемых объектов при применении реакций с диазореактивами и 4-аминоантипирином показало преимущества последнего. Например, окраска продуктов реакции контрольной пробы почвы с 4-аминоантипирином соломенно-желтая при сиренево-розовой окраске проб, при реакции же с диазореактивами (диа-зосульфаниловая кислота, диазотированный п-нитроанилин) — светло-коричневая при оранжево-красных тонах окраски проб.
2 Подготовка образцов к анализу заключалась в следующем. Образцы почвы измельчали, перемешивали и освобождали от посторонних включений; зерно размалывали на ручной кофейной мельнице (грубый помол); арбузы освобождали от корки и измельчали.
