СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ САЛЬМОНЕЛЛ ИЗ ПОЧВЫ Текст научной статьи по специальности «Экологические биотехнологии»

УДК 614.777:543.Зй]:57в.851.49

Г. П. Беспятая

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ САЛЬМОНЕЛЛ

ИЗ ПОЧВЫ

Институт общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина АМН СССР, Москва

Действующими инструкциями и официальными руководствами рекомендуется 2 бактериологических метода определения патогенных энтеробак-терий в почве. Эти методы дают возможность обнаружить единичные клетки патогенных энтеробактерий в 1 л исследуемой воды. Высокая чувствительность методов достигнута благодаря использованию новых эффективных питательных сред обогащения — магниевой среды «М» (В. А. Шнганова и Г. П. Калина), селенитового бульона (AI. С. Жарикова; Ю. Г. Талаева и соавт., 1969), среды с охмеленным суслом (Ю. Г. Талаева и Данон-Моше) и с тетратионатом калия по Пройсу (Krannich и Möller, 1968; Kampelmacher и соавт. и др.). Имеются работы, посвященные применению этих сред накопления и для выделения патогенных энтеробактерий из почвы (К. У. Урум-баева; Э. Л. Эргашева; М. И. Тарков и соавт.; Ocker и Gerwin; Krannich и Möller).

Нашей задачей являлось сравнение предлагаемых официальными руководствами методов определения в почве патогенных энтеробактерий и выявление более эффективного из них, а также сравнительная оценка накопительной способности применяемых в нашей стране сред обогащения при выделении сальмонелл из почвы. С этой целью были использованы магниевая среда «М», селенитовый бульон, среда с охмеленным суслом, а также 10% желчный бульон. Селенитовый и 10% желчный бульон готовили по общепринятой методике, магниевую среду использовали в экспедиционной модификации, среду с охмеленным суслом разводили стерильной водопроводной водой в соотношении 1:4.

Экспериментальные исследования проводили на подзолистой супесчаной почве. Ее доводили до воздушно-сухого состояния, освобождали от посторонних включений, растирали крупные комки и просеивали через 3-миллиметровые сита. Почва по бактериологическим показателям относилась к чистым, общее число бактерий составляло 7000, титр Cl. perfringens — более 1, бактерии группы кишечных палочек и сальмонеллы в образцах почвы не обнаружены. В качестве бактериальной модели взята суточная культура S. typhimurium, типичная по морфологическим, биохимическим и серологическим свойствам. Почву полевой влажности заражали из расчета 7000 клеток на 1 г. Постоянную влажность поддерживали путем ежедневного взвешивания и восполнения дефицита в весе стерильной водопроводной водой. Пробы почвы отбирали на 2, 5, 8, 20 и 27-е сут после заражения.

Почвенную суспензию приготовляли и исследовали на сальмонеллы в строгом соответствии с существующими методиками, подробное описание которых дано в Инструкции по санитарно-бактериологическому исследованию почвы (1958) и Руководстве по санитарной охране почвы (1972). Так как для определения сальмонелл методом коагуляции с центрифугированием рекомендуется брать не менее 30 г почвы, из которой в среднем можно получить 250 мл почвенной суспензии, этот объем суспензии был выбран нами для исследования. Вместе с тем через мембранные фильтры можно профильтровать не более 20 мл почвенной суспензии, да и то только в случае анализа песчаной и супесчаной почвы (Л. И. Мац и М. И. Маркнна-Перцовская).

В связи с этим методом концентрирования бактерий на мембранных фильтрах исследовали 20 мл почвенной суспензии. Одновременно отбирали 4 пробы зараженной почвы (по 50 г) соответственно 4 исследуемым средам накопления и готовили почвенную суспензию. Из каждой пробы 250 мл коагулировали 10% раствором сернокислого железа с подщелачиванием 10% раствором углекислого натрия, выдерживали 1 ч в холодильнике и центри-

фугировали при скорости 3000 об/мин в течение 5 мин. Осадок в количестве 0,5 мл засевали на 3 чашки висмут-сульфитного агара, а оставшуюся часть осадка помещали в среды накопления. Из той же пробы почвенной суспензии дважды по 20 мл фильтровали ее одновременно через планктонный фильтр № 6, предназначенный для задержания крупных механических примесей, и мембранный фильтр № 3. Первые 2 фильтра укладывали на поверхность висмут-сульфитного агара, вторые помещали в среды накопления. Результаты роста бактерий на висмут-сульфитной среде просматривали через 24 ч инкубации в термостате при 37°.

Высевы из сред накопления делали дважды: ранний — через 5—6 ч и поздний — через 18—20 ч. При позднем высеве среды раститровывали до Ю-5— 10~после чего засевали по 0,1 мл каждого разведения на 2 чашки с висмут-сульфитным агаром. На чашках наблюдался типичный для сальмонелл рост колоний. Выделенная культура давала четкую агглютинацию с сывороткой Б. 1урЫтипит, разлагала глюкозу и образовывала сероводород, но не ферментировала лактозу, сахарозу и мочевину в трехсахарной среде по Окельницкому.

Средние данные опытов по 3 повторным сведены в табл. 1. В результате исследований установлено, что прямым посевом почвенной суспензии по методу коагуляции с центрифугированием сальмонеллы обнаруживались до 8-го дня наблюдения. Подращивание фильтров на висмут-сульфитном агаре позволило выделять сальмонеллы до 8-го дня при исследовании планктонных фильтров и до 5-го дня — фильтров № 3. Применение сред накопления после коагулирования и центрифугирования почвенной суспензии удлиняет срок обнаружения сальмонелл до 13 дней. Вместе

о

Я

§

§3

§5

5

О

т

6

I I

I I I I I I I I I I

со г- со

О О О О

1111М

— о) со' —

-зэюоаочгсосо — со — — см — е-» —

оооооооооооо

1С Ю (ОСЧОЙ со см со го сч со" — сч" со со — — — см" со см" —

СО_ 10 со со со со_ со — ем с^сосо^сосмсмсосососм'тг

л

•Л V с?

о х

^ о?

ч с л .

> г—

о 2'в ч с 2' 5-° §« ^

§ 1 5

ГГ £ ¡С

1 §¿1 Ч О л » ч

о

_ ___й 5 к

£ г § - " -

— о: ^ с ТО

. = £ * £ г § : г = ^ ■а г

■ * 2 С/ та

оо?

5 ^

а

си г ? £

¡¡1Р

1113 |

* ч £ = £

. 5 о .

I I I I I I I I I ! I I

I I

I I

I I

—++++

- — — — ем

£38 £++++2 £2++

>> •е-

а>

а

Ж "

Зх - §

5,° се-

5

~ _ч

та со

о.

«о

а* —^

г

со

о

н

с тем с подращиванием мембранных фильтров в средах обогащения мы выделяли сальмонеллы так же, как н без обогащения,— до 8-го дня с планктонного фильтра и до 5-го дня — с мембранного фильтра № 3. Следовательно, обогащение при концентрации бактерий на мембранных фильтрах практически не повышает чувствительности метода. Основная масса сальмонелл задерживается на планктонном фильтре, а не на фильтре № 3. По-видимому, это связано с адсорбцией бактерий на пленке, образованной крупными фракциями почвенной суспензии.

Исследования позволяют характеризовать метод коагуляции с центрифугированием как более эффективный и простой по сравнению с методом мембранных фильтров.

Существенной разницы в эффективности накопительной способности исследуемых сред накопления в первые дни наблюдения не выявлено. С увеличением срока вегетирования из экспериментально зараженной почвы количество высеваемых сальмонелл уменьшилось. Этот процесс более резко выражен на примере селенитового бульона и магниевой среды «М», что, по-видимому, объясняется наличием в них сильных ингибиторов, подавляющих рост не только сапрофитной микрофлоры почвы, но и ослабленных в неблагоприятных условиях сальмонелл. На 13-й день исследования в 1 мл селенитового бульона и магниевой среды «М» после 20 ч инкубации количество высеваемых сальмонелл оказалось на 1 порядок ниже, чем в 1 мл 10% желчного бульона и среды с охмеленным суслом.

Пятичасовое подращивание позволяет определять сальмонеллы в первые дни вегетирования их в почве, т. е. неизмененные, типичные формы этих бактерий. При концентрировании бактерий на мембранных фильтрах и 5-часо-вой инкубации в средах обогащения удалось выделить сальмонеллы только на 2-й день из 10% желчного бульона. При дальнейших исследованиях результаты посевов из всех сред накопления были отрицательными. Методом коагуляции с центрифугированием сальмонеллы выделялись на 2-й день из всех исследуемых сред накопления, за исключением среды с охмеленным суслом, а из желчного бульона — до 13-го дня наблюдения, как и после суточного подращивания. Это можно объяснить лучшими селективными свойствами последней среды но сравнению с другими.

При определении зависимости эффективности исследуемых сред обогащения от степени общего микробного загрязнения почвы мы использовали схему оценки санитарного состояния почвы по коли-титру и тигру С1. рег-fringens, предложенную Е. Н. Мишустиным и М. И. Перцовской (1954). Музейные штаммы Е. coli 0,7 (Кайффманн) и Cl. perfringens типа «А» № 612 получены из Института им. Л. А. Тарасевича. Культуры по их свойствам были типичны. Концентрацию кишечной палочки и Cl. perfringens создавали согласно схеме при одинаковой концентрации сальмонелл, равной 50 кл на 1 г почвы. Для заражения почвы кишечной палочкой и сальмонеллами делали смыв суточного роста культур с мясо-пептонного агара и устанавливали нужную концентрацию по оптическому стандарту мутности. Культуру Cl. perfringens выращивали в казеиново-грибной среде, трижды отмывали ее физиологическим раствором от среды с центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин, после чего готовили взвесь микробов по оптическому стандарту мутности.

Для выделения сальмонелл использовали только метод коагуляции с центрифугированием. Коли-титр определяли методом концентрирования бактерий на мембранных фильтрах с последующим подращиванием на среде Эндо. Титр Cl. perfringens определяли по методике с использованием железо-сульфитной среды Вильсона—Блера, гдеС1. perfringens образуют черные колонии, разрывающие среду вследствие газообразования. Среды обогащения раститровывали до 10-в, высевы со сред обогащения проводили так же, как и в предыдущем эксперименте.

С увеличением микробного загрязнения почвы выявлена разница в эффективности сред накопления в отношении сальмонелл. Наиболее эффектив-

ной средой оказался 10% желчный бульон; среда с охмеленным суслом работала в этих условиях значительно хуже (разница по сравнению с желчным бульоном была в 2 порядка). На 5-й день мы уже не выделяли сальмонелл, что, по-видимому, можно объяснить антагонистическим действием кишечной палочки и клостридий, которое привело как к сокращению сроков выживаемости сальмонелл в почве, так и к уменьшению их количества на 1 г почвы. Е. coli и Cl. perfringens в зараженной почве определялись в течение всего срока наблюдения, причем их титры практически не менялись по сравнению с исходными.

Для определения чувствительности метода коагуляции с центрифугированием использовали почву с большим микробным загрязнением. Почву заражали экспериментально, как и в предудыщих опытах. Концентрацию сальмонелл снижали от десятков тысяч до единичных клеток на 1 г почвы. Почвенную суспензию обрабатывали по указанной выше инструкции. Кроме 10% желчного бульона, была апробирована элективная среда накопления, предложенная МНИИГЭ 1 (МРТУ-42 № 508—72 от 19/Х 1972 г.). Среда приготовлена на гидролизате казеина, в качестве ингибитора используется, так же как и в селенитовом бульоне, селинитовокислый натрий. Эту среду рекомендуют для сальмонелл из испражнений и объектов внешней среды, в том числе и почвы (М. Г. Бранд; М. И. Тарков и соавт.). При сравнении с результатами предыдущих опытов существенной разницы в накопительных свойствах среды МНИИГЭ, селенитового бульона и магниевой среды «М» не обнаружено. Несколько более эффективным оказался 10% желчный бульон, однако и здесь разница в концентрациях сальмонелл в 1 мл накопительных сред после 20-часовой инкубации в термостате составляла только 1 порядок.

Как следует из табл. 2, уменьшение заражающей дозы от десятков тысяч до десятков клеток практически не влияет на количество вырастающих сальмонелл. Лишь при внесении единичных клеток на 1 г почвы их количество уменьшается на 1 порядок. Подобная зависимость наблюдается при использовании как 10% желчного бульона, так и среды МНИИГЭ с поправкой на эффективность среды.

Колебания титров Е. coli от 0,01 до 0,0001 и Cl. perfringens от 0,01 до 0,00015 также не оказывали существенного влияния на количество высеваемых сальмонелл. Результаты раннего высева оказались положительными даже при наличии единичных клеток в 1 г почвы. Однако при посеве из среды МНИИГЭ на чашках вырастали единичные колонии, тогда как из желчного бульона их было более 200.

Таблица 2

Сравнительная оценка сред накопления при выделении сальмонелл из почвы

10% желчный бульон Среда МНИИГЭ

Концентрация заражения рост через

S ч 20 ч 5 ч 20 ч

43 600 + 1,74 108 6 2,2 107

20 000 + 2,51 10е 15 2,2 10'

4 360 + 1,68 10е 6 1,78 10'

2С00 + 2,17 ю8 10 2,3 10'

436 + 1,23 10е 2 1,56 10'

200 + 1,13 10е 4 1,52 10'

167 8,8-10s 1,52 10е 5 1,60 10'

17 3,3-102 1,02 10е 3 1,25 10'

1—2 1,4-10« 2,99 10' 1 4,00 10е

1 Молдавский научно-исследовательский институт гигиены и эпидемиологии.

Выводы

1. Для выделения сальмонелл из почвы метод коагуляции с центрифугированием более эффективен и прост по сравнению с методом концентрирования бактерий на мембранных фильтрах. Чувствительность его достаточно высока; удается определять единичные клетки в 1 г почвы, имеющей большое общее микробное загрязнение.

2. В практике санитарно-бактериологического исследования почвы на наличие сальмонелл могут быть использованы наряду с 10% желчным бульоном и другие среды обогащения — селенитовый бульон, магниевая среда «М» и среда МНИИГЭ. Однако некоторое преимущество сохраняет 10% желчный бульон.

3. Применение раннего высева из сред накопления через 5 ч инкубации может ускорить получение ответа на 12—15 ч. Особенно целесообразна 5-часовая инкубация при использовании в|качестве среды накопления 10% желчного бульона.

ЛИТЕРАТУРА. Б р а н д. М. Г. и др. Новая питательная среда для выделения сальмонелл и шигелл. — В кн.: Бактериальные кишечные инфекции. Кишинев, !967, с. 143—145. — Жарикова М. С. Использование обогатительной среды с селенитом при бактериологической диагностике сальмонеллеза и дизентерии. — «Ж- микробиол.», 1963, № 8, с. 108—112. — Мац ЛИ., Маркина-Перцовская М. И. Почва. — В кн.: Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под. ред. М. О. Биргера. М., 1973. с. 397—403. —Талаева Ю. Г., Данон-М о ш е С. Усовершенствование меюдов выделения патогенных бактерий рода сальмонелла из воды. — В кн.: Материалы конференции по итогам научных исследований за 1968 г. Ин-та общей и коммунальной гигиены. М., 1969, с. 51—53. — Талаева Ю. Г. и др. Оценка селенитового бульона как накопительной среды при выделении брюшно-тифозных бактерий из воды.— В кн.: Материалы конференции по итогам научных исследований за 1966 г. Ин-та общей и коммунальной гигиены. М., 1967, с. 51—52.— Талаева Ю. Г. и др. Опыт использования селенитовых сред при исследовании сточных вод и вод открытых водоемов на наличие брюшно-тифозных бактерий. — «Гиг. и сан.», 1969. № 9, с. 96—98. — ТарковМ. И. и др. Методы выделения и сроки выживания сальмонелл в почзе. — В кн.: Актуарные вопросы санитарной микробиологии. М., 1973, с. 50. — У р у м б а е в а К. У. Материалы к микробиологической оценке почвы г. Алма-Аты (распространение брюшнотифозных и дизентерийных бактерий и соответствующих им бактериофагов). Дис. канд. Алма-Ата, 1968. — Шиганова В. Л., Калина Г. П. К методике обнаружения сальмонелл в сточных жидкостях.—«Ж. микробиол.», 1972, № 1, с. 145—148.—Эрга ш е в а Л. Э. Влияние орошения сточными водами на бактериальную обсемененность почвы в условиях Узбекск. ССР. — В кн.: Материалы 3-го съезда гигиенистов, санитарных врачей, эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов Узбекистана. Ташкент, 1973, с. 33. — К а ш р е 1 m а с h е г E.H. е. а. — «J. Water Pollut. Control. Fed.», 1970. v. 42, p. 2069. — К r a n n i с h К. Möller F. — «Z. ges. Hyg.», 1968, Bd 14, S. 696.— Ibid., S. 174A. — Ocker G., Gerwin J. — «Z. ges. Hyg.», 1968, Bd 14, S. 683.

Поступила 26/XI 1974 г.

УДК 614.72-074:547.495.1

М. Д. Бабина

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЛКИЛКАРБАМАТОВ В ВОЗДУХЕ

Научно-исследовательский институт гигиены труда и профзаболеваний АМН СССР, Москва

Алкилкарбаматы представляют собой эфиры карбаминовой кислоты с общей формулой ЫН2СООН. Наибольшее применение из них находят метил- и этилкарбаматы. Это бесцветные кристаллические вещества, хорошо растворимые в воде и органических растворителях. При смешивании этих алкилкарбаматов в определенных соотношениях образуются эвтектические смеси, жидкие при комнатной температуре. Бинарная смесь метил- и этил-карбамата (1 : 1) является эффективным экстрагентом для ароматических углеводородов. ПДК такой смеси в воздухе — 3 мг/м3. С целью разработки метода были испытаны реакции, основанные на кислотном гидролизе с извлечением образующегося спирта бензолом и определением его с ванадий-