CC BY
103
Исследование способности улавливать свободные стабильные радикалы по радикалу БРРН (2,2-дифе-нил-1-пикрилгидразил) [4] проводили по 5 точкам различной концентрации. Изучение БРРН-теста осуществляли спектрофотометрическим методом со спиртовым раствором радикала БРРН при длине волны 517 нм [5].
Антирадикальную активность выражали в виде Ш50 (количество вещества, требуемого для ингибирования БРРН радикала на 50%) и рассчитывали по кривой зависимости «% поглощения БРРН - концентрация экстракта» (рис. 3).
На рис. 4 представлены графики изменения процента поглощения радикала БРРН в течение 120 мин (х50). Они наглядно показывают силу антирадикального воздействия образцов меда. Это динамический вариант метода БРРН. Антирадикальная активность определена при концентрации мг/мл.
Данные по Ш50 и х50 представлены в таблице.
Таблица
Образец меда ID50, мг/мл Т50, мин
Гречишный (Башкирия) 73 6
Липовый (Самара) 22 Не достигает
Акациевый (Алтай) 38 »
В сотах 93 4
Гречишный (Самара) 53 10
Донниковый (Алтай) 55 9
Луговой (Башкирия) 56 9
По величине антиоксидантной активности образцы меда были условно разделены на 3 группы: с наивысшей, средней и слабой антиоксидантной активностью.
К 1-й группе можно отнести образцы: Гречишный (Башкирия) - 73 г/мл и мед в сотах - 93 г/мл; ко 2-й: Гречишный (Самара) - 53 г/мл, Донниковый (Алтай) -55 г/мл, Луговой (Башкирия) - 56 г/мл; к 3-й: Липовый (Самара) - 22 г/мл, Акациевый (Алтай) - 38 г/мл.
Анализируя полученные данные, можно сделать вывод, что исследуемые нами образцы меда являются эффективными антиоксидантами. В меде были обнаружены фенольные соединения и флавоноиды, которые проявляют высокую активность в отношении DPPH радикала [6].
ЛИТЕРАТУРА
1. Physico-chemical and bioactive properties of different floral origin honeys from Romania / A.M. Liviu, D. Dezmirean, M. Adela et al. // Food Chem. - 2009. - 112, № 4. - P. 863-867.
2. Aljadi A.M., Kamaruddin M.Y. Evaluation of the phenolic contents and antioxidant capacities of two Malaysian floral honeys // Food Chem. - 2004. - 85, № 4. - P. 513-518.
3. Millefiori honey is packed full of antioxidants / M. Blasa, M. Candiracci, A. Accorsi et al. // Food Chem. - 2006. - 97, № 2. -P. 217-222.
4. Determination of the total phenolic, flavonoid and proline contents in Burkina Fasan honey, as well as their radical scavenging activity / A. Meda, L.Ch. Euloge, M. Romito et al. // Food Chem. - 2005.
- 91, № 3. - P. 517-577.
5. Bertoncelj J., Dobersek U., Jamnik M., Golob T. Evaluation of the phenolic content, antioxidant activity and color of Slovenian honey // Food Chem. - 2007. - 105, № 2. - P. 822-828.
6. Characterization of honey from different floral sources. Its functional properties and effects of honey species on storage of meat / T. Nagai, R. Inoue, N. Kanamori et al. // Food Chem. - 2006. - 97, № 2. -P. 256-262.
Поступила 07.05.10 г.
ANTIOXIDANT SUBSTANCES OF HONEY VARIOUS GRADES
H.V. MAKAROVA, V.S. LIMANOVA, V.P. BORDINOVA
Samara State Technical University,
244, Molodogvardejskaya st., Samara, 443100;ph.: (846) 232-20-69, e-mail: [email protected]
Samples of honey of a various geographical origin on the content of total of phenolic connections and flavonoids are investigated. It is defined also antioxidant ability of honey with use of free radical DPPH (2,2-diphenyl-1-pikrilhidrazil).
Key words: honey grades, antioxidants, antioxidant activity, phenolic substances, phlavonoids.
678.4:547.458.8(045)
КИНЕТИКА ГИДРОЛИЗА НЕКРАХМАЛЬНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ЬАМШЕХБО
В.М. ЛЫСЮК, М.В. ГЕРНЕТ, И.В. ВЯЛЬЦЕВА, Е.Ф. ШАНЕНКО
Московский государственный университет пищевых производств,
125080, г. Москва, Волоколамское шоссе, 11; электронная почта: [email protected]
Изложен теоретический и экспериментальный материал по исследованию влияния С7-алкилоксибензола (С7-АОБ) на кинетику гидролиза некрахмальных полисахаридов под действием ферментного препарата Ьатіпех БО, применяемого при получении пивного сусла. На основании анализа зависимостей начальной скорости реакции от концентрации фермента и субстрата и определения кинетических параметров (максимальной скорости ферментативной реакции гидро-
лиза и кажущейся константы Михаэлиса) показана целесообразность применения С7-АОБ в качестве активатора и стабилизатора препарата Laminex БО.
Ключевые слова: цитолитические ферменты, некрахмальные полисахариды, кинетика ферментативного гидролиза.
Создание интенсивной биотехнологии пивного сусла при переработке несоложеного сырья наряду с ячменным солодом, ферменты которого играют ключевую роль при затирании зернопродуктов [1,2], связано с использованием цитолитических ферментных препаратов. При затирании ферменты, расщепляющие пен-тозаны, а также Р-глюканазы, обладающие специфичностью действия к Р-1,3- и Р-1,4-гликозидным связям некрахмальных полисахаридов (гемицеллюлозы и гумми-веществ), являющихся структурными веществами клеточных стенок эндосперма зерна, имеют существенное значение [3, 4]. Применение цитолитических ферментов позволяет поддерживать постоянным требуемое содержание Р-глюканов, способствует снижению продолжительности осахариания заторов, снижению вязкости сусла, повышению скорости его фильтрования, увеличению выхода экстракта, снижает риск возникновения помутнения пива, обусловленного присутствием Р-глюканов.
Известно, что ферменты являются катализаторами с регулируемой каталитической активностью, которая может изменяться под действием различных факторов, влияющих на конформацию белка фермента или структуру его активного центра, поэтому для эффективного применения ферментных препаратов необходимо предварительно изучить условия, влияющие на скорость катализируемых ими реакций, так как именно она является мерой каталитической активности фермента [5, 6].
В настоящей статье представлены результаты исследований активирующих факторов при ферментативном гидролизе некрахмальных полисахаридов на примере фильтровальной бумаги (ФБ). В работе использовали ферментный препарат (ФП) Laminex BG фирмы «БашБСО», который применяется в пивоварении, производстве соков, вина и пищевого спирта. Он представляет собой ферментативный комплекс, продуцируемый грибом Trichoderma reesei, включающий глюканазы и ксиланазы (эндоглюканазная активность - 1950 ед./см3, экзоглюканазная - 1595 ед./см3, ксила-назная - 870 ед./см3), выпускаемый в форме концентрата. Температурный оптимум действия ФП 50°С, рН оптимум 4,7. В качестве активатора использовали природное соединение С7-алкилоксибензол, широко представленное в растениях, грибах и бактериях [7], предоставленное для исследований институтом микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. С7-АОБ - ам-фифильное соединение с молекулярной массой 124, растворимое в воде и спиртах. С7-АОБ относится к группе алкилоксибензолов, которые способны образовывать водородные связи, вступать в гидрофобные и ионные взаимодействия, благодаря чему они являются модификаторами биомакромолекул [8, 9]. Обладая функциями естественных молекул-«компаньонов», они могут образовывать комплексы с молекулами бел-
ка фермента за счет слабых физико-химических взаимодействий, изменяя и стабилизируя при этом их конформацию, что создает благоприятные условия для проявления биокаталитической активности [10]. В литературе имеются данные о способности алкилокси-бензола к активации ферментов в экспериментах с трипсином, химотрипсином, лизоцимом, рибонуклеа-зой [11], а также с а- и Р-амилазой пивоваренного ячменя [12].
Нами проведены исследования по влиянию С7-АОБ на начальную скорость реакции гидролиза (Ко) ФБ в зависимости от концентрации фермента ([£]), концентрации субстрата ([5]) и концентрации С7-АОБ, определены кинетические параметры - максимальная скорость ферментативной реакции (Ктах) и кажущаяся константа Михаэлиса (Км), представляющая собой величину, численно равную концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции составляет половину Ктах [5, 6]. Контролем служил гидролиз ФБ ферментным препаратом без добавления С7-АОБ.
Для проведения кинетических исследований предварительно была установлена область концентраций фермента, при которой сохраняется прямая пропорциональная зависимость между скоростью реакции и его концентрацией. С этой целью проводили гидролиз ФБ (содержание 0,25 г/см3) при оптимальных температуре и рН действия ФП. Путем последовательных разведений в реакционной смеси создавали различные концентрации ФП. Гидролиз проводили в течение 1 ч, через определенные промежутки времени в гидролизате определяли количество образующихся продуктов реакции (РВ) методом Шомодьи-Нельсона [13] и строили кинетические кривые накопления РВ в процессе гидролиза (рис. 1: [Е] = 1 • 10-4см3 ФП/см3 реакционной смеси: кривая 1 - 0,1; 2 - 0,2; 3 - 0,3; 4 - 0,5; 5 - 0,7; 6 - 1,0).
За количество продуктов реакции РВ принимали разность между их количеством в опытной пробе и количеством в «нулевой» пробе (без ФП). Начальную скорость реакции в каждом варианте гидролиза определяли как тангенс угла наклона касательной, проведенной из начала координат к кинетическим кривым в начальный период реакции [6]. Был построен график К0 = /[Е], на основании анализа которого установлено, что прямо пропорциональная зависимость между К0 и [Е] сохраняется при концентрациях ФП меньше 0,5 • 10-4 см3 ФП/см3 реакционной смеси (рис. 2, кривая 1). При дальнейшем повышении концентрации ФП прямо пропорциональная зависимость нарушается и скорость реакции нарастает нелинейно. Наиболее вероятной причиной этого может быть нехватка субстрата [5, 6]. С учетом полученных результатов для дальнейших исследований была выбрана концентрация 0,5 • 10-4 см3 ФП/см3 реакционной смеси.
О 10 20 30 40 50 60
Продолжительность гидролиза, мин
Рис. 1
Поскольку эта концентрация ФП была определена для конкретных экспериментальных условий, то при изменении этих условий (в наших исследованиях - это проведение ферментативного гидролиза ФБ в присутствии С7-АОБ) необходимо было получить зависимости, характеризующие накопление РВ во времени при гидролизе ФБ ферментным препаратом Laminex BG при использовании различных концентраций С7-АОБ, определить начальную скорость реакции и построить зависимость К0 = /[С7-АОБ]. В этой серии экспериментов концентрацию С7-АОБ изменяли от 0,6 мг/см3 ФП до 6,0 мг/см3 ФП. Чтобы выбрать концентрацию для дальнейших исследований, исключающую такой фактор, как нехватка активатора, по кинетическим кривым были определены начальные скорости реакции и построена зависимость К0 = / [С7-АОБ]. Она составила
3,0 мг/см3 ФП.
Сравнение графических зависимостей К0 =/[Е] при гидролизе ФБ (рис. 2) неактивированным (кривая 1) и активированным в присутствии С7-АОБ препаратом Laminex ВО (кривая 2) показывает, что в обоих случаях при концентрациях ФП, меньших, чем 0,5 • 10-4 см3 ФП/см3 реакционной смеси, сохраняется прямо пропорциональная зависимость между начальной скоростью ферментативной реакции и концентрацией фермента, но в присутствии С7-АОБ (3,0 мг/см3 ФП) К0 почти в 2,3 раза больше, чем в котрольном варианте при одной и той же концентрации фермента, что под-
[5], г/см3 Рис. 3
4 3 3
[£] ■ 10 , см /см гидролизата Рис. 2
тверждает факт активирующего действия С7-АОБ на препарат Laminex ВО (рис. 2, кривая 2).
Дополнительная информация может быть получена при исследовании зависимости скорости реакции от концентрации субстрата, которая дает возможность предположительно ответить на вопрос о механизме активации [6]. В результате проведенных исследований были получены зависимости, характеризующие накопление РВ в процессе ферментативного гидролиза при различных концентрациях субстрата (от 0,04 до
1,0 г/см3 реакционной смеси) для контрольного (ФП без С7-АОБ) и опытного (ФП + С7-АОБ) вариантов, определена начальная скорость реакции при каждой концентрации субстрата и построены графические зависимости К0 = /[5] (рис. 3: 1 - контрольный вариант; 2 -опытный).
Полученные зависимости наглядно иллюстрируют активирующее действие С7-АОБ на ФП Laminex ВО при гидролизе ФБ, однако не позволяют оценить влияние С7-АОБ как активатора на кинетические параметры Ктах и Км. Простейшим приемом для определения этих параметров является изображение экспериментальных данных в координатах 1/К0 от 1/[5] (т. е. преобразование уравнения Михаэлиса методом Лайнуиве-ра-Берка) [5].
Сравнительный анализ полученных зависимостей (рис. 4: 1 - без активатора, 2 - с активатором) и определенных на основании их кинетических параметров Ктах и Км косвенно подтверждает ранее сделанное за-
1/[5]
Рис. 4
ключение, что активация ФП Laminex БО в присутствии С7-АОБ обусловлена определенными конформаци-онными изменениями в молекуле белка фермента, при этом С7-АОБ не изменяет кажущуюся константу Михаэлиса (КМ = 0,25) и увеличивает Кшах в 2,3 раза.
Характер этих зависимостей (рис. 4) позволяет предположить, что активация ФП может быть как результатом увеличения эффективной концентрации фермента (за счет перевода фермента из неактивной формы в активную), так и следствием индукционного влияния активатора на каталитические группы активного центра и конформационных изменений, при которых домены около активного центра приобретают большую подвижность, что повышает доступность активного центра для ферментативной реакции [6, 14].
Результаты проведенных исследований показывают целесообразность применения С7-АОБ в качестве активатора и стабилизатора ФП Laminex БО и являются основой для разработки практических рекомендаций по применению С7-АОБ в технологии пивного сусла для интенсификации биокаталитических процессов при затирании зернопродуктов и осахаривании полученного затора.
ЛИТЕРАТУРА
1. Нарцисс Л. Краткий курс пивоварения. - СПб.: Профессия, 2007. - 640 с.
2. Кунце В. Технология солода и пива. - СПб.: Профессия, 2001. - 912 с.
3. Неверова О.А., Гореликова Г.А., Позняковский В.М.
Пищевая биотехнология продуктов из сырья растительного происхождения. - Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2007. - 415 с.
4. Кислухина О.В. Ферменты в производстве пищи и кормов. - М.: ДеЛи принт, 2002. - 336 с.
5. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. В 3 т. - М.: Мир, 1982. -1118 с.
6. Петушкова Е.В. Введение в кинетику ферментативных реакций. - М.: Изд-во МГУ им. М.В. Ломоносова, 1972. - 200 с.
7. О химической природе ауторегуляторного фактора dj Pseudomonas carboxydoflava / Г.А. Осипов, Г.И. Эль-Регистан, В.А. Светличный и др. // Микробиология. - 1985. - 54. - № 2. -С.186-190.
8. Карпекина Т.А., Грачева И.М., Эль-Регистан Г.И.
Участие микробных алкилоксибензолов в регуляции автолитиче-ской деструкции дрожжевых клеток // Микробиология. - 2002. - 71.
- № 5. - С. 611-618.
9. Мартиросова Е.И., Карпекина Т.А., Эль-Регистан Г.И. Модификация ферментов естественными химическими шапе-ронами микроорганизмов // Микробиология. - 2004. - 73. - № 5. -С. 708-715.
10. Стабилизация ферментов аутоиндукторами анабиоза как один из механизмов устойчивости покоящихся форм микроорганизмов / А.И. Колпаков, О.Н. Ильинская, М.М. Беспалов и др. // Микробиология. - 2000. - 69. - № 2. - С. 224-230.
11. Функции аутоиндукторов анабиоза микроорганизмов при создании метаболического блока в клетке / М.М. Беспалов, А.И. Колпаков, Н.Г. Лойко и др. // Микробиология. - 2000. - 69. - № 2. -С. 217-223.
12. Конаныхина И.А. Разработка интенсивной технологии солода и пива с использованием алкилоксибензолов природного происхождения для улучшения качества готовой продукции: Авто-реф. дис. ... канд. техн. наук. - М., 2007. - 24 с.
13. Полыгалина Г.В., Чередниченко Г.С., Римарева Л.В. Определение активности ферментов.-М.: ДеЛи принт, 2003.-298 с.
14. Creighton T.E. Protein structure: A practical approach. -IRL Press Oxsford University. - 1997. - 362 p.
Поступила 11.11.10 г.
KINETICS OF NON-STARCH POLYSACCHARIDES HYDROLYSIS WITH ENZYME LAMINEXBG
V.M. LYSYUK, M.V. GERNET, I.V. VYALTSEVA, E.F. SHANENKO
Moscow State University of Food Production,
11, Volokolamskoe shosse, Moscow, 125080; e-mail: [email protected]
The theoretical and experimental data on the effect of C7-alkylhydroxybenzene (C7-AOB) on the kinetics of non-starch polysaccharides hydrolysis with the enzyme Laminex BG used in brewing wort technology are presented. Based on the analysis of the dependence of the initial reaction rate on of the enzyme and substrate concentration and the determination of kinetic parameters (maximum rate of enzymatic hydrolysis and the Michaelis constant) the expediency of using C7-AOB as the activator and stabilizer of Laminex BG enzyme is shown.
Key words: cytolytic enzymes, non-starch polysaccharides, kinetics of enzymatic hydrolysis.
