CC BY
58
УДК 663.45
Активация ферментного комплекса Laminex BG Glucanase Complex в производстве пива
В. М. Лысюк, Е. Ф. Шаненко
Московский государственный университет пищевых производств М. В. Гернет
Московский государственный университет пищевых производств ВНИИ пивоваренной, безалкогольной и винодельческой промышленности Г. И. Эль-Регистан
Институт микробиологии РАН, г. Москва
Повышение эффективности процессов пивоварения достигается применением наряду с ячменным солодом ферментных препаратов и мультэнзимных композиций, сочетающих амилолитическую, про-теолитическую и цитолитическую активности. Чтобы эффективно использовать их в производстве, необходимо знать свойства и способы регуляции активности ферментов, что позволит усовершенствовать процессы пивоварения и проводить их с получением максимального количества конечного продукта с высокими качественными показателями.
Цель исследований — разработка условий активации и стабилизации цитолитического ферментного препарата Laminex BG Glucanase Complex для повышения эффективности его применения в пивоварении. В качестве объекта как активатора и стабилизатора ферментов цито-литического действия нами был выбран алкилоксибензол (С7-АОБ), относящийся к группе алкилокси-
Ключевые слова:
цитолитические ферментные препараты; ферментативный гидролиз; активация; стабильность ферментов; С7-алкилоксибензол
бензолов, способных образовывать водородные связи, вступать в гидрофобные и ионные взаимодействия, благодаря чему они служат модификаторами макромолекул ферментов. Они обладают функциями естественных молекул-«компаньо-нов», которые образуют комплексы с молекулами биополимеров за счет слабых физико-химических взаимодействий, изменяя при этом конформацию биомакромолекул и стабилизируя их, что создает благоприятные условия для проявления биокаталитической активности [1]. Способность алкилоксибензола к активации была показана в экспериментах с трипсином, химотрипси-ном, лизоцимом, рибонуклеазой [2],
а также с а- и ^-амилазой пивоваренного ячменя [3].
В работе использовали жидкий ферментный комплекс фирмы «Да-ниско» Laminex BG Glucanase Complex, который применяется в пивоварении, производстве соков, вина и пищевого спирта. Laminex BG Glucanase Complex позволяет поддерживать постоянным требуемое содержание в-глюканов; улучшает отделение сусла и повышает эффективность процесса фильтрования; снижает риск возникновения помутнения пива, обусловленного присутствием в-глюканов; делает процессы постоянными вне зависимости от качества сырья; повышает эффективность фильтрации пива [4]. Предынкубация раствора ферментного препарата в определенном температурном режиме может привести к конформацион-ным изменениям в молекуле белка фермента, а это, в свою очередь, — к увеличению его активности [5, 6]. Мы предварительно провели исследования по влиянию тепловой обработки раствора ферментного препарата в ультратермостате при температуре 40; 50; 60 °С в течение 30-60 мин. Активность ферментного препарата определяли в стандартных условиях по гидролизу фильтровальной бумаги (АФБ) и выражали в процентах к активности ферментного препарата, не подвергнутого тепловой обработке, которая была принята за 100 %. Было установлено, что проведение предынкубации раствора ферментного препарата при 50 °С в течение 30-60 мин вызывает увеличение активности на 35-50 %. Однако
Концентрация С7-АОБ, мг/см3
— Окисленная форма С7-АОБ
— Восстановленная форма С7-АОБ
Рис. 1. Влияние концентрации С7-АОБ на активность Laminex BG Glucanase Complex
ПИ
НАПИТКИ А2010
12
Продолжительность гидролиза, мин
— С7-АОБ 0 мг/см3 — С7-АОБ 0,1 мг/см3
— С7-АОБ 0,3 мг/см3 — С7-АОБ 1 мг/см3
Рис. 2. Влияние активации ферментного препарата
в присутствии С7-АОБ в различных концентрациях на накопление глюкозы при гидролизе АФБ
снижение или увеличение температуры всего на 5 °С приводило к существенному снижению активности. В этой связи применение алкилоксибензола на стадии пред-ынкубации раствора ферментного препарата с учетом вышеотмечен-ной его стабилизирующей способности в отношении макромолекул биополимеров представляется весьма целесообразным. С целью подтверждения данного предположения исследовали влияние алкилок-сибензола в окисленной и восстановленной формах на активность ферментного препарата. Предынку-бацию 1 %-ных растворов ферментного препарата проводили в ультратермостате в течение 1 ч при температуре 50 °С при концентрации АОБ от 0,05 до 1,5 мг/см3. Ферментативную активность выражали в процентах по отношению к контролю (раствор ФП без добавления АОБ). Данные, представленные на рис. 1, свидетельствуют о том, что добавление С7-АОБ на стадии предынкубации раствора ферментного препарата приводит к значительному увеличению активности. Наибольший эффект достигается при концентрации 1,0 мг/см3, при этом несущественно, в какой форме используется алкилокси-бензол.
Проведение предварительной активации ферментного комплекса Laminex BG Glucanase Complex в присутствии АОБ способствует интенсификации последующего гидролиза некрахмальных полисахаридов, что демонстрируется на примере гидролиза фильтровальной бумаги (рис. 2). При концентрации АОБ 1,0 мг/см3 содержание глюкозы в гидролизате уже через 30 мин гидролиза в 2,5 раза выше, чем в контроле. Подобный эффект сохраняется при увеличении продолжительности гидролиза до 90 мин.
В результате исследований (рис. 3) установлено, что повышение активности ферментного комплекса Lam-inex BG Glucanase Complex зависит от длительности предынкубации раствора ферментного препарата с С7-АОБ при температуре 50 °С.
Анализ полученных данных позволяет сделать заключение, что проведение предынкубации ферментного препарата с С7-АОБ при 50 °С в течение 30 или 60 мин при-
водит к увеличению активности по отношению к контролю (предын-кубация без АОБ) соответственно в 2,3 и 2,5 раза, а по отношению к «нулевому» контролю (без АОБ предынкубация — 0 мин) — соответственно в 3,2 и 3,8 раза.
Повышение ферментативной активности при использовании данного АОБ, по-видимому, связано с изменением конформации белковой молекулы фермента в сторону повышения доступности ее каталитического центра и центров связывания, а также с таким повышением стабильности целлюлазно-го комплекса, которое позволило снизить ингибирующее действие субстрата и конечных продуктов реакции на фермент.
Стабильность — важнейшая характеристика ферментов, определяющая их применение в пищевых технологиях, в том числе в пивоварении.
Поскольку стабилизация фермента в результате модификации молекулы белка должна проявляться в повышении устойчивости белковой молекулы к денатурирующим воздействиям, мы изучили влияние С7-АОБ на рН-стабильность и термостабильность ферментного препарата Laminex BG Glucanase Complex.
О стабильности ферментного комплекса Laminex BG Glucana-se Complex судили по изменению ферментативной активности при различных значениях возмущающих параметров (рН и температура). С этой целью проводили пред-ынкубацию ферментного раствора без АОБ и ферментного раствора с добавлением АОБ в диапазоне рН 3,3-8,0 (температура 50 °С) и температур 45...70 °С (рН 4,7) в течение 60 мин. Активность оценивали в стандартных условиях и выражали в процентах к контролю (инкубация раствора ферментного препарата при 50 °С). Анализ полученных данных (рис. 4) показывает, что повышенная активность ферментного комплекса Laminex BG Glucanase Complex сохраняется в широком диапазоне рН (3,3-6,0) при использовании С7-АОБ в качестве стабилизирующего фактора при проведении предынкубации его раствора, однако максимальная активность наблюдается при рН 4,7-5,0.
Рис. 3. Влияние длительности
предынкубации ферментного раствора на активность BG Glucanase Complex
Рассматривая результаты исследований по рН-стабильности препарата, надо учитывать, что эффект влияния на стабильность фермента связан прежде всего с влиянием кислотности среды на ионизацию функциональных групп белковой части фермента, а также кофакторов, что может сказываться на конформации молекулы (и, как следствие, на сродстве фермента к субстрату) и даже приводить к инактивации фермента [7]. Как следует из данных, представленных на рис. 4, проведение пред-ынкубации с С7-АОБ позволило расширить рН-интервал действия ферментного препарата Laminex BG Glucanase Complex: активность препарата выше, чем в контроле, в 2-2,5 раза при рН 3,3-6,0 Аналогичное стабилизирующее действие С7-АОБ отмечается и по данным исследования термостабильности. В отсутствие С7-ВОБ даже небольшие колебания температуры от 50 °С приводят к падению ферментативной активности, в то время как в присутствии С7-АОБ ферментативная активность выше, чем в контроле, в 2-2,5 раза в диапазоне 50.60 °С (рис. 5).
Использование восстановленной формы С7-АОБ приводило к аналогичным результатам с незначительным снижением активирующего эффекта.
Результаты проведенных исследований позволяют сделать заключение, что эффективность применения в пивоварении цитолитическо-го ферментного комплекса Lami-nex BG Glucanase Complex мо-
2010
13
pH
— Контроль (без С7-АОБ) - Опыт (с С7-АОБ)
Рис. 4. Стабильность ферментного комплекса в зависимости от величины рН
Температура, °С — Контроль (без С7-АОБ) - Опыт (с С7-АОБ)
Рис. 5. Стабильность ферментного комплекса в зависимости от температуры
жет быть существенно повышена за счет проведения предынкубации ферментного раствора с С7-АОБ в качестве активатора и стабилизатора каталитической активности ферментов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Карпенкина Т. А., Грачева И. М., Эль-Ре-гистан Г. И. и др. Участие микробных алкилоксибензолов в регуляции авто-литической деструкции дрожжевых кле-ток//Микробиология. 2002. Т. 71. № 5. С. 611-618.
2. Беспалов М. М., Эль-Регистан Г. И. Функции аутоиндукторов анабиоза микроорганизмов при создании метаболического блока в клетке//Микробиология. 2000. Т. 69.№ 2. С. 217-223.
3. Конаныхина И. А. Разработка интенсивной технологии солода и пива с использованием алкилоксибензолов природного происхождения для улучшения качества готовой продукции: Автореф. дис... канд. техн. наук. — М., 2007.
4. Кислухина О. В. Ферменты в производстве пищи и кормов. — М.: ДеЛи принт, 2002.
5. Траубенберг С. Е. Научное обоснование, разработка и применение способов активации ферментных препаратов для интенсификации промышленного биокатализа: Автореф. дис. д-ра техн. наук. — М.: 1985.
6. Ляшенко Е. В. Разработка ферментативного способа обработки облепихового сиропа и применение в пищевой промышленности: Автореф. дис. канд. техн. наук. — М., 1991.
7. Диксон М., УэббЭ. Ферменты: в 3-х т./Пер. с англ. Л. М. Гинодмана и М. И Левянта; Под ред. В. К. Антонова и А. Е. Браун-штейна. — М.: Мир, 1982. &
ПИВО " "ЛПИТКИ
М-2010
14
