CC BY
21УДК 615.331:579.66(579.862.1+ 579.864.1) DOI: 10.37279/2224-6444-2021-11-4-44-53
КАЧЕСТВЕННЫЙ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ СОСТАВ МЕТАБОЛИТОВ
ШТАММОВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ В СВЯЗИ С РАЗРАБОТКОЙ ПРЕПАРАТОВ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ
Семенова Е. Ф.1, Маркелова Н. Н.2, Бибарсова А. А.3, Ржевская В. С.1, Теплицкая Л. М.1, Сластья Е. А.4, Степанова А. П.5, Солодаренко О. В.1
'Институт «Медицинская академия имени С.И. Георгиевского», ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского», 295051, бульвар Ленина, 5/7, Симферополь, Россия
2ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии», 117997, ул. Профсоюзная 86, Москва, Россия
3ФГБОУ ВО «Пензенский государственный университет», 440026, ул. Красная 40, Пенза, Россия
4Всероссийский национальный научно-исследовательский виноградарства и виноделия «Магарач» РАН, 298600, ул. Кирова 31, Ялта, Россия
5Всероссийский научно-исследовательский институт жиров, 191119, ул. Черняховского 10, Санкт-Петербург, Россия
Для корреспонденции: Семенова Елена Федоровна, к.б.н., профессор кафедры фармации Медицинской академии имени С.И. Георгиевского ФГБОУ ВО «КФУ имени В.И. Вернадского», e-mail: [email protected]
For correspondence: Elena F. Semenova, PhD (Biology), Professor of the Department of Pharmacy, Medical Academy named after S.I. Georgievsky of Vernadsky CFU, e-mail: [email protected]
Information about authors:
Semenova E. F., http://orcid.org/0000-0002-7987-6886 Markelova N. N., https://orcid.org/0000-0003-0759-721X Bibarsova A. A., https://orcid.org/0000-0001-8530-377X Rjevskaya V. S., https://orcid.org/0000-0003-4788-0407 Teplitskaya L. M., https://orcid.org/0000-0003-0452-6782 Slastya E. A., https://orcid.org/0000--0002-6750-9587 Stepanova A. P., https://orcid.org/0000-0001-6185-6660 Solodarenko O. V., https://orcid.org/0000-0002-3508-5185.
РЕЗЮМЕ
Молочнокислые бактерии синтезируют антимикробные вещества различной природы: кислоты, спирты, диацетил, реутерин, перекись водорода, углекислый газ и др. Управление по контролю за продуктами питания и лекарствами (Food and Drug Administration, США) и Европейское агентство по безопасности пищевых продуктов (European Food Safety Agency) признало молочнокислые бактерии безопасными для здоровья человека и животных. В связи с этим важное значение они могут иметь и в качестве продуцентов аминокислот, в том числе и незаменимых. Цель - провести сравнительный анализ продукции органических и аминокислот штаммами пробиотических бактерий. Объектами исследования служили селекционированные нами и запатентованные штаммы: Lactobacillus plantarum IMV B-7344, Lactobacillus casei IMV B-7343, Lactobacillus acidophilus RCAM 01850, Lactococcuslactis subsp. lactis RCAM 02909, Lactococcuslactis subsp. cremoris RCAM 05396, Streptococcus thermophilus RCAM 02910. В работе использованы контент-анализ источников патентной и научной литературы, морфологические, биохимические, микробиологические, биотехнологические, математические методики. Выявлено, что у всех изучаемых штаммов метаболизм бродильного типа с образованием молочной, уксусной, масляной и капроновой кислот с уровнем суммарной продукции до 29,06 г/л. Следует отметить продукцию лактобациллами яблочной и янтарной кислот (0,06-0,59 г/л) в отличие от лактококков и стрептококка, которые не синтезируют эти кислоты даже в следовых количествах. Содержание свободных аминокислот в процессе глубинного культивирования составило 35,88-49,06 г/л, в том числе незаменимых 11,81-21,21 г/л. Существенные количества в культуральной жидкости были отмечены лейцина и изолейцина (8,63-17,20 г/л), глутамина (9,8310,60 г/л) и пролина (5,42-7,48 г/л), причем первые две аминокислоты относятся к незаменимым. Полученные результаты необходимо учитывать при разработке поликомпонентных пробиотиков, так как эти факторы в большой степени определяют эффективность воздействия на патогенные микроорганизмы и человека.
Ключевые слова: биогенные органические кислоты, свободные аминокислоты, молочнокислые бактерии, биосинтез, препараты пробиотического действия.
QUALITATIVE AND QUANTITATIVE COMPOSITION OF LACTIC BACTERIA STRAINS' METABOLITES IN CONNECTION WITH THE DEVELOPMENT OF PROBIOTIC MEDICATIONS
Semenova E. F.1, Markelova N. N.2, Bibarsova A. A.3, Rzhevskaya V. S.1, Teplitskaya L. M.1, Slastya E. A.4, Stepanova A. P.5, Solodarenko O. M.1
•Medical Academy named after S. I. Georgievsky of Vernadsky CFU, Simferopol, Russia 2Russian Scientific Center of Roentgenoradiology (RSCRR), Moscow, Russia
3Penza State University, Penza, Russia
4Russian National Research Institute of Viticulture and Winemaking "Magarach" RAS, Yalta, Russia 5All-Russian Research Institute of Fats, St. Petersburg, Russia
SUMMARY
Lactic acid bacteria synthesize antimicrobial substances of various natures: acids, alcohols, diacetyl, reuterin, hydrogen peroxide, carbon dioxide, etc. Food and Drug Administration (USA) and European Food Safety Agency recognized lactic acid bacteria as safe for human and animal health. In this regard, they can be of great importance as producers of amino acids, including irreplaceable ones. The aim is to conduct a comparative analysis of organic and amino acids' production by strains of probiotic bacteria. The objects of the study were selected and patented strains: Lactobacillus plantarum IMV B-7344, Lactobacillus casei IMV B-7343, Lactobacillus acidophilus RCAM 01850, Lactococcus lactis subsp. lactis RCAM 02909, Lactococcus lactis subsp. cremoris RCAM 05396, Streptococcus ther-mophilus RCAM 02910. Content analysis of patent and scientific literature sources, morphological, biochemical, microbiological, biotechnological, mathematical methods were used. Content analysis of patent and scientific literature sources, and morphological, biochemical, microbiological, biotechnological, mathematical methods were used. It was determined that all of the studied strains have fermentation-type metabolism with the formation of lactic, acetic, butyric and caproic acids with a total production level of up to 29.06 g/L. It should be noted that Lactobacillus produce malic and succinic acids (0.06-0.59 g/L), in contrast to Lactococcus and Streptococcus, which do not synthesize these acids even in trace amounts. The content of free-form amino acids in the process of submerged cultivation was 35.88-49.06 g/L, including irreplaceable 11.81-21.21 g/L. Significant amounts of leucine and isoleucine (8.63-17.20 g/L), glutamine (9.83-10.60 g/L) and proline (5.42-7.48 g/L) were revealed in the culture fluid, and the first two amino acids are essential. The results obtained must be taken into account when developing multicomponent probiotics, since these factors largely determine the effectiveness of the impact on pathogenic microorganisms and humans.
Key words: biogenic organic acids, free-form amino acids, lactic acid bacteria, biosynthesis, probiotic medications.
Молочнокислые бактерии синтезируют антимикробные вещества различной природы: органические кислоты, спирты, диацетил, реу-терин, перекись водорода, углекислый газ и др. [1]. Известно, что снижение рН приводит к подавлению сопутствующей микрофлоры и даже патогенных микроорганизмов. Короткоцепо-чечные жирные кислоты (молочная, уксусная, пропионовая и масляная кислоты), пройдя через клеточные мембраны и оказавшись в более щелочной среде внутри клетки, диссоциируют в заряженные протоны и анионы, подкисляющие цитоплазму [2; 3]. Закисление цитоплазмы может вызывать осмотический стресс и ингиби-рование некоторых метаболических процессов (например, синтез АТФ), что приводит к гибели микроорганизма [4]. Однако, способность молочнокислых бактерий эффективно подавлять другие виды обусловлена не только их способностью снижать рН, но и зависит от природы органических кислот, которые они производят.
Снижение рН в результате гомофермента-тивного брожения происходит преимущественно за счет молочной кислоты. Отмечается, что L-лактат обладает большей ингибирующей активностью по сравнению с D-изомером [5]. Некоторые виды Lactobacillus продуцируют L(+)-изомер, и когда эти изомеры накапливаются, молочная кислота превращается в D(-)-изомер до тех пор, пока не будет достигнуто равновесие и не образуется рацемическая смесь [6]. Многие исследователи подтверждают способность неко-
торых молочнокислых бактерий (L. plantarum, L. casei, L. lactis) синтезировать фенилмолочную кислоту, хотя этот процесс является штаммо- и видоспецифичным [7]. Уксусная и пропионовая кислоты эффективно ингибирует рост бактерий, плесени и дрожжей [8]. Так, физиологически релевантные концентрации уксусной кислоты значительно подавляют рост Candida. При значении pH, которое способствует концентрации недиссоциированной формы уксусной кислоты, токсичность в отношении дрожжевых клеток привела к выраженному подавляющему их рост и развитие эффекту. При этом уксусная кислота обладает более широким спектром антимикробного действия по сравнению с молочной. В то же время для смеси уксусной и молочной кислот известно синергетическое действие: они задерживают рост патогенных грамотрицательных энтеробактерий Salmonella typhi и Escherichia coli [9]. Ингибирующая активность уксусной и молочной кислот повышается по мере снижения рН, обе кислоты действуют совместно в слабо-буференных средах: молочная кислота снижает рН среды, тем самым повышая токсичность уксусной кислоты.
Ингибирующая способность молочнокислых бактерий отмечена не только в отношении роста спорообразующих бактерий, но и в отношении спор этих микроорганизмов. Так, Bacillus cereus сначала постепенно ингибируется, а затем погибает при совместном культивировании с различными молочнокислыми бактериями. Рост
полностью прекра-щается при значениях рН 6,1, 6,0 и 5,6 в случае ацетата, формиата и лактата, соответственно. Что касается прорастания спор, формиат, лактат и ацетат ингибировали прорастание спор на 50% при рН 4,4, 4,3 и 4,2, соответственно [10]. Для других спорообразующих бактерий Clostridium tyrobutyricum показано, что вегетативные клетки были подавлены при рН 4,65, в то время, как прорастание спор было нарушено при рН 4,60. Немногие микроорганизмы способны расти при значениях рН ниже порогового значения рН молочнокислых бактерий. Так, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Proteus vulgaris имеют нижнее значение pH, позволяющее рост, 4,4, Salmonella typhi - 4,0 - 4,5, Pseudomonas aeruginosa - 5,6, Staphylococcus aureus - 4,0, Listeria monocytogenes - 5,5 [11].
Управление по контролю за продуктами питания и лекарствами FDA (Food and Drug Administration, США) признало молочнокислые бактерии безопасными для здоровья человека и животных GRAS (Generally Recognized as Safe), а Европейское агентство по безопасности пищевых продуктов EFSA (European Food Safety Agency) присвоило им статус "Квалифицированной презумпции безопасности" QPS ("Qualified Presumption of Safety") [12]. Поэтому важное значение они могут иметь и в качестве продуцентов аминокислот, в том числе и незаменимых, например, лейцина и изолейцина. Лейцин защищает мышечные ткани и может являться источником энергии. Его наличие способствует восстановлению костей, кожи, мышечной ткани и снижает уровень холестерина. Изолейцин необходим для синтеза гемоглобина, увеличивает выносливость и способствует восстановлению мышц [13].
Цель данной работы - провести сравнительный анализ продукции органических и аминокислот селекционированными штаммами про-биотических бактерий.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объектами исследования служили селекционированные нами и запатентованные штаммы молочнокислых бактерий: Lactobacillus plantarum IMV B-7344, Lactobacillus casei IMV B-7343, Lactobacillus acidophilus RCAM 01850, Lactococcus lactis subsp. lactis RCAM 02909, Lactococcus lactis subsp. cremoris RCAM 05396, Streptococcus thermophilus RCAM 02910 [14-17].
В работе использованы стандартные питательные среды, применяемые в микробиологических исследованиях, в соответствии с МУ 2.3.2.2789-10: питательные среды по ГОСТ 10444.1 и ГОСТ 10444.11; среды для выращивания молочнокислых бактерий (АГВ, MRS, лак-
тобакагар) по ТУ 10-02-02-789-192-95; молоко обезжиренное по ГОСТ 10444.1. Учеты показателей и наблюдения за изучаемыми культурами вели в течение 10-ти суток сквашивания по общепринятым методикам [18].
Хроматографический анализ культуральной жидкости осуществляли на жидкостном хроматографе Shimadzu LC20 Prominence (Япония). Режим разделения: тандемная хроматография. Первая колонка - силикагель с привитой обращенной фазой Supelcosi Nautilus RPC18 250*4.1 мм, зернение 3.1 мкм, детектирование на выходе из колонки спектрофотометрическим детектором с диодной матрицей (расчет капроновой кислоты). Вторая колонка последовательно потоку - гель-проникающая с сульфатированным бута-диенстирольным сополимером в кислой форме Supelcogel C610H 310*7.1 мм, детектирование на выходе сканирующим спектрофо-тометрическим детектором при 210 нм и рефрактометрическим детектором (глицерин и этанол). Подвижная фаза изократическая - 0,01% раствор хлорной кислоты в дистиллированной воде, скорость потока 0,5 мл/мин.
Изучение качественного и количественного состава свободных аминокислот в образцах культуральной жидкости было проведено с помощью системы капиллярного электрофореза «Капель 105» фирмы «Люмекс», который основан на миграции анионных форм ФТК-производных аминокислот под действием электрического поля в кварцевом капилляре в фосфатном или боратном электролите и регистрации электрофореграммы при длине волны 254 нм. Идентификацию и количественное определение анализируемых веществ проводили с помощью программного обеспечения «Мультих-ром». Методика предусматривает проведение двух вариантов анализа. При первом анализе определили концентрацию лизина, тирозина, фенилаланина, гистидина, сумму лейцина и изолейцина, аргинина, метионина, валина, про-лина, треонина, серина, аланина и глицина при температуре 30 °С. Кислотный гидролиз проводили по ГОСТ 13496.21-87. На втором этапе анализа определили концентрации глутамино-вой и аспарагиновой кислот, а также цистеина при температуре 30 °С в соответствие с ГОСТом 13496.22-90.
Математическую обработку экспериментальных данных осуществляли с использованием программ Excel (Microsoft, США) и пакета Statistica 6.0 при уровне значимости P 0,05 (на 95 %-ном уровне надежности или доверительной вероятности) [19]. Полученные в ходе исследования показатели изучаемых штаммов сравнивали между собой. О степени изменчивости
судили по вариационному размаху (пределам варьирования) значений и среднему квадратичному отклонению от средней арифметической.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Проведенные исследования показали, что селекционированные штаммы лактобацилл, лактококков и стрептококка обладают широ-
ким спектром потребления единственных источников углерода и энергии (табл.1). К ним относятся моно-, ди-, олиго-, полисахариды и многоатомные спирты. Полученные результаты утилизации различных веществ свидетельствуют, что пищевые потребности сложны и варьируют с учетом видовой и штаммовой принадлежности.
Таблица 1
Утилизация источников углерода селекционированными штаммами молочнокислых бактерий
Источник углерода Штаммы
L. plantarum IMV B-7344 L. casei IMV B-7343 L. acidophilus RCAM 01850 L. lactis subsp. Lactis RCAM 02909 L. lactis subsp. Cremoris RCAM 05396 S. thermophilus RCAM 02910
сорбит + + - - - -
ксилоза + - - + - -
галактоза + + + + + +
глюкоза + + + + + +
маннит + + - + - -
мальтоза + + + + + +
фруктоза + + + + + +
манноза + + + + + +
сахароза + + + + + +
рафиноза + - + - + +
мелибиоза + - - - - -
лактоза + + + + + +
арабиноза - - - + - -
рамноза - - - + - -
ксилоза - - - + - -
целлобиоза + + + - - -
декстрин - - + + + -
Примечание: + - источник углерода утилизируется культурой; - - источник углерода не утилизируется культурой.
У молочнокислых кокков метаболизм бродильный по гомоферментативному типу с образованием, в основном (не менее 85 %% от общей продукции органических кислот), молочной кислоты. Лактобациллы являются факуль-тативно-гетероферментативными и образуют также другие кислоты, этанол и углекислый газ. Различия у штаммов были выявлены по физио-лого-биохимическим свойствам, в частности устойчивости к факторам среды: желчи, фенолам, солям и спиртам, а также биологической активности, в том числе амило-, липо- и проте-олитической (табл. 2). Показано, что рост не на-
блюдается в присутствии растворов хлористого натрия у штаммов L. lactis subsp. lactis RCAM
02909 (не менее 6,5 %), S. thermophilus RCAM
02910 (не менее 4,0 %), L. lactis subsp. cremoris RCAM 05396 (не менее 4,0 %). Высокой липоли-тической активностью и отсутствием амилоли-тической активности характеризовались практически все изучаемые штаммы, за исключением S. thermophilus RCAM 02910. Указанные характеристики следует учитывать при составлении композиции микроорганизмов в лекарственных препаратах и продуктах функционального питания пробиотического действия.
2021, т. 11, № 4
крымскии журнал экспериментальном и клиническои медицины
Таблица 2
Физиолого-биохимические свойства изучаемых штаммов молочнокислых бактерий
Свойства Штаммы
L. plantarum IMV B-7344 L. casei IMV B-7343 L. acidophilus RCAM 01850 L. lactis subsp. Lactis RCAM 02909 L. lactis subsp. Cremoris RCAM 05396 S. thermophilus RCAM 02910
устойчивость, %
Феноло- 0,4 0,4 0,5 0,0 0,0 0,0
Желче- 50,0 50,0 нд 40,0 40,0 0,0
Соле- 16,0 16,0 2,0 4,0 2,5 0,0
Спирто- 24,0 24,0 15,0-20,0 нд нд нд
литическая активность
Амило- - - нд - - +
Липо- + + - + + -
Протео- + + - - - -
Примечание: + - свойство проявляется культурой; - - свойство не проявляется культурой; + - свойство нестабильно; нд - нет данных.
Анализ культуральной жидкости молочнокислых бактерий показал наличие низкомолекулярных веществ, обеспечивающих ее физико-химические свойства(табл. 3,4).
Суммарное количество органических кислот находилось в пределах 15,92-30,71, а свободных аминокислот - 35,88-49,06 г/л. При этом рН варьировал от 3,69 до 5,32 единиц, а кислотность - от 70 до 172 ОТернера. Ценные технологические показатели, определяемые совокупностью синтезированных соединений, составили: динамическая вязкость 1,000-1,293 мПа-с, а относительная вязкость 0,826-1,055 единиц. Существенный вклад в реологические характеристики глубинных культур внесло наличие гиалуроновых кислот в концентрации 0,15 - 0, 68 %. Адгезивные свойства штаммов важны при разработке поликомпонентных пробиотиков, так как они повышают эффективность воздействия на организм человека.
Определение предела кислотообразования является комплексной оценкой, показывающей процесс молочнокислого брожения с количественной стороны. Предельная кислотность, которую изучаемые штаммы достигали в течение 10-суточного культивирования, варьирует в широких пределах: от 95 до 320 ОТ. Наименьшими показателями характеризовался L. lactis subsp. lactis RCAM 02909, а наибольшими - L. acidophilus RCAM 01850.
Результаты анализа качественного состава и количественного определения свободных органических и аминокислот в образцах глубинных моно-
культур молочнокислых бактерий представлены в таблице 4. Преобладающей кислотой у всех изучаемых штаммов является молочная (9,09-23,01 г/л). К основным, продуцируемым штаммами лак-тобацилл, относятся уксусная, масляная и капроновая кислоты (3,21-8,08 г/л). Следует отметить продукцию лактобациллами яблочной и янтарной кислот (0,06-0,59 г/л) в отличие от лактококков и стрептококка, которые не синтезируют эти кислоты даже в следовых количествах.
Контент-анализ литературных источников и собственных данных показал, что культуры штаммов молочнокислых бактерий обладают выраженной биохимической активностью в отношении аминокислот. В процессе культивирования микроорганизмов в молочном субстрате при оптимальной температуре наблюдался глубокий гидролиз белков, что привело к увеличению количества свободных аминокислот по сравнению с их содержанием в исходной питательной среде. Существенные количества в культуральной жидкости были отмечены лейцина и изолейцина (8,63-17,20 г/л), глутамина (9,83-10,60 г/л) и пролина (5,42-7,48 г/л). Лейцин и изолейцин относятся к незаменимым аминокислотам, которые не синтезируются клетками животных и человека и поступают в организм в составе белков пищи. Их отсутствие или недостаток в пище приводит к отрицательному балансу азота в организме, нарушениям биосинтеза белков, нарушению обмена веществ, остановке роста и развития, нервным расстройствам, депрессии и другим негативным последствиям.
Таблица 3
Химический состав метаболитов (г/л КЖ), определяющих физико-химические показатели культу-ральной жидкости селекционированных штаммов молочнокислых бактерий
Показатель Штаммы
L. plantarum IMV B-7344 L. casei IMV B-7343 L. acidophilus RCAM 01850 L. lactis subsp. Lactis RCAM 02909 L. lactis subsp. Cremoris RCAM 05396 S. thermophilus RCAM 02910
Органические кислоты 26,79 30,47 30,71 20,86 17,58 15,92
Аминокислоты 44,01 45,41 45,37 42,35 35,88 49,06
Спирты 1,63 1,98 1, 86 нд нд нд
Кислотность, ОТ 110-120 90-100 170-172 70-75 75-90 76-78
Предельная кислотность, ОТ 130-189 110-169 238-320 95-120 110-182 106-146
рН, ед. 4,45-5,21 3,69-4,49 4,37-4,74 4,70-4,80 4,92-5,32 4,89-5,02
Динамиче ская вязкость, мПа-с 1,034-1,104 1,000-1,121 1,093-1,135 1,100-1,141 1,024-1,204 1,023-1,293
Отно сительная вязкость, ед. 0,826-0,942 0,837-0,951 0,880-0,926 0,897-0,931 0,836-0,982 0,834-1,055
Примечание: нд - нет данных.
Суммарное количество свободных аминокислот в процессе глубинного культивирования составило 35,88-49,06 г/л, в том числе незаменимых 11,81-21,21 г/л. Наибольшим количеством незаменимых аминокислот характеризовались культуры термофильного стрептококка и ацидофильной палочки.
ОБСУЖДЕНИЕ
Большинство пробиотических микроорганизмов относятся к молочнокислым бактериям, которые не только изменяют состав микробиоты, но и образуют метаболиты с противомикробны-ми, иммуногенными и регенеративными свойствами [20].
Лактобактерии снижают рН содержимого кишечного тракта в результате выработки в высоких концентрациях ацетата, пропионата и бутирата, создавая благоприятные условия для собственного выживания и препятствуя адгезии и переносу патогенных микроорганизмов. Бути-рат действует как антиканцерогенный агент и образуется лактобациллами из лактата и ацетата [21]. Молочная кислота подавляет высвобождение провоспалительных цитокинов из эпителиальных клеток, стимулирует антимикробную активность нейтрофилов [22].
Живые лактобактерии обладают преимуществом при использовании их в качестве
противомикробных агентов, вырабатывающих бактериоцины, органические кислоты, перекись водорода, диацетил, реутерин, которые предотвращают адгезию и рост патогенов [23]. Кроме того, было выявлено подавление продукции сигнальных молекул QS (ацил-гомо-серин-лактон) в биопленках, образованных P. aeruginosa [24].
В отличие от живых микробов пробиотиче-ские лизаты практически не имеют побочного действия и оказывают различные биологические эффекты. Было показано, что иммуногенные белковые компоненты бактериальных лизатов, предотвращают респираторные и кишечные инфекции, повышая уровень IgA, обусловленного Т-клетками и антиген-определяемой индукцией иммуноглобулина, лизаты L. acidophilus обладают эффектами иммунологического адъ-юванта для активации иммунного ответа [25, 26]. Наиболее предпочтительным применением пробиотических лизатов является лечение воспалительных заболеваний, так как воздействие живых бактерий связано с чрезмерной активацией иммунной системы. В экспериментах in vitro лизаты L. casei усиливали пролиферацию кера-тиноцитов, а лизаты L. plantarum способствовали миграции кератиноцитов, ускоряя реэпите-лизацию клеточного монослоя, имитирующего раневое повреждение [27].
2021 т 11 № 4 крымскии журнал экспериментальной и клиническои медицины
Таблица 4
Продуктивность селекционированных штаммов молочнокислых бактерий по фармакологически
ценным метаболитам, г/л КЖ
Соединения Штаммы
L. plantarum IMV B-7344 L. casei IMV B-7343 L. acidophilus RCAM 01850 L. lactis subsp. Lactis RCAM 02909 L. lactis subsp. Cremoris RCAM 05396 S. thermophilus RCAM 02910
Органические кислоты
молочная 9,0901 16,8892 23,0055 20,8599 17,5843 15,9521
уксусная 8,0784 3,6816 5,8855 следы 0,0000 0,0000
масляная 3,7514 3,2068 нд нд нд нд
винная 0,0025 0,0121 нд нд нд нд
яблочная 0,0602 0,2353 0,1478 0,0000 0,0000 0,0000
янтарная 0,4545 0,5949 0,5747 0,0000 0,0000 0,0000
пропионовая 0,3921 0,5678 нд нд нд нд
капроновая 4,9579 5,2818 нд нд нд нд
Аминокислоты
лизин 0,77 0,80 0,87 0,78 0,74 0,72
тирозин 1,30 1,28 1,38 1,35 0,78 1,08
фенилала-нин 1,72 1,81 1,82 1,08 1,22 1,75
гистидин 0,61 0,67 0,71 0,53 0,63 0,68
лейцин/изо-лейцин 17,00 16,20 17,20 16,90 8,63 17,00
метионин 0,48 0,56 0,52 0,42 0,49 0,58
валин 1,10 1,11 1,13 1,45 1,95 2,26
пролин 5,44 6,40 5,42 5,63 6,83 7,48
треонин 0,54 0,68 0,58 0,45 0,73 1,16
серин 1,66 1,69 1,65 1,03 1,19 1,68
аланин 1,04 1,21 1,41 1,03 1,05 0,98
глицин 0,48 0,65 0,45 0,43 0,69 0,71
аргинин 0,67 0,70 0,71 0,38 0,72 0,76
аспарагин 1,10 1,15 1,12 0,69 0,76 1,26
глутамин 10,10 10,50 10,40 10,20 9,83 10,60
сумма незаменимых 20,51 19,25 20,99 19,63 11,81 21,21
Примечание: нд - нет данных.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Выявлено, что у всех изучаемых штаммов метаболизм бродильного типа с образованием молочной, уксусной, масляной и капроновой кислот с уровнем суммарной продукции до 29,06 г/л. Содержание свободных аминокислот в процессе глубинного культивирования составило 35,88-49,06 г/л, в том числе незаменимых
11,81-21,21 г/л. Существенные количества в культуральной жидкости были отмечены лейцина и изолейцина (8,63-17,20 г/л), глутамина (9,83-10,60 г/л) и пролина (5,42-7,48 г/л), причем первые две аминокислоты относятся к незаменимым. Полученные результаты необходимо учитывать при разработке поликомпонентных пробиотиков, так как эти факторы могут в
большой степени определять взаимоотношения внутри консорциума бактерийного препарата и эффективность его воздействия на патогенные микроорганизмы и человека.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.
ЛИТЕРАТУРА
1. Halima B. A., Alkali Z. D., Shafiu N. A. Lactic acid bacteria: a review. International Journal of Advanced Academic Research | Sciences, Technology and Engineering. 2020;6(3):21-36.
2. Haller M., Mironov S., Karschin A., Richter D.W. Dynamic activation of K(ATP) channels in rhythmically active neurons. The Journal of Physiology. 2001;537(1):69-81. doi:10.1111/ j.1469-7793.2001.0069k.x.
3. Gadotti C., Nelson L., Diez-Gonzalez F. Inhibitory effect of combinations of caprylic acid and nisin on Listeria monocytogenes in queso fresco. Food Microbiology. 2014;39:1-6. doi:10.1016/j.fm.2013.10.007.
4. Lavermicocca, P., Valerio, F., Evidente, A., Lazzaroni, S., Corsetti, A., Gobbetti, M. Purification and characterization of novel antifungal compounds by sourdough Lactobacillus plantarum 21B. Applied and Environmental Microbiology. 2000;66:4084-4090. doi:10.1128/AEM.66.9.4084-4090.2000.
5. Stoyanova L., Ustiugova E., Netrusov A. Antibacterial metabolites of lactic acid bacteria: Their diversity and properties. Appl. Biochem. Microbiol. 2012;48:229-243 doi: 10.1134/ S0003683812030143.
6. Alatar F., Bushell F., Sannasiddappa T., Herbert J., Falciani F., Lund P. Molecular approaches to understand the effect of acetic acid in uropathogenic E. coli. Access Microbiology. 2019;1(1A). doi.org/10.1099/acmi.ac2019.po0478.
7. Cortés-Zavaleta O., López-Malo A., Hernández-Mendoza A., García H.S. Antifungal activity of lactobacilli and its relationship with 3-phenyllactic acid production. Intern. J. of Food Micro-biol. 2014;173:30-35.
8. Florou-Paneri P., Christaki E., Bonos E. Lactic acid bacteria as source of functional ingredients (w) Lactic Acid Bacteria - R & D for Food, Health and Livestock Purposes, red. M. Kongo, InTech, Rijeka; 2013:589-614.
9. Lavermicocca P., Valerio F., Evidente A., Lazzaroni S., Corsetti A., Gobbetti M. Purification and characterization of novel antifungal compounds by sourdough Lactobacillus plantarum 21B. Applied and Environmental Microbiology. 2000;66:4084-4090 doi:10.1128/AEM.66.9.4084-4090.2000.
10. Nuryana I., Andriani A., Lisdiyanti P., and Yopi. Analysis of organic acids produced by lactic acid bacteria. IOP Conf. Series: Earth and Environmental Science 2019;251. doi:10.1088/1755-1315/251/1/012054.
11. Бибарсова А. А., Семенова Е. Ф., Жученко
E. В. Изучение влияния современных препаратов антибиотиков на некоторые пробиотические штаммы и их ассоциативную культуру. Вестник Воронежского университета. Серия «Химия. Биология. Фармация». 2015;2:101-105.
12. López-Seijas J., García-Fraga B., Abigail
F. da Silva, Sieiro C. Wine Lactic Acid Bacteria with Antimicrobial Activity as Potential Biocontrol Agents against Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici. Agronomy. 2020;10(1):31. doi: 10.3390/agronomy10010031
13. Nowak A., Slizewska K., Libudzisz Z. Probiotyki - historia i mechanizmy dzialania. Zywn. Nauka Technol. Jakosc. 2010;71:5-19.
14. Ржевская В. С., Теплицкая Л. М., Отурина И. П. Изучение биологических свойств штаммов молочнокислых бактерий. Ученые записки Таврического национального университета им В.И. Вернадского. Серия «Биология, химия». 2014;27(66),1:145-160.
15. Патент № 2524117. РФ. Штамм бактерии Lactobacillus acidophilus RCAM01850, используемый для приготовления кисломолочного продукта / Бибарсова А. А., Семенова Е. Ф., Моисеева И. Я., Степанова А. П., Ловцова Л. Б., (РФ) Заявка № 2013131302/10 (046807), 08.07.2013 г., опубл. 27.07.2014. Бюл. № 21.
16. Патент № 2588386. РФ. Штамм бактерии Lactococcus lactis - компонент молочнокислой закваски / Бибарсова А. А., Семенова Е. Ф., Моисеева И. Я., Степанова А. П., Лов-цова Л. Б. (РФ) Заявка № 2015118880, 19.05.2015, опубл. 27.06.2016. Бюл. № 18.
17. Патент № 2590716. РФ. Штамм бактерии Streptococcus thermophilus, используемый для приготовления кисломолочного продукта / Бибарсова А. А., Семенова Е. Ф., Моисеева И. Я., Степанова А. П., Маркелова Н. Н. (РФ) Заявка № 2015119939, 26.05.15, опубл. 10.07.2016. Бюл. № 19.
18. Степанова А. П., Ловцова Л. Б., Бибарсова А.А., Золкина Н. Г., Семенова Е. Ф. Скринин-говые исследования культурально-морфологи-ческих признаков и физиолого-биохимических свойств коллекционных штаммов молочнокислых бактерий. Вестник ВНИИ жиров. 2020;1-2:83-87. doi: 10.25812/VNIIG.2020.43.29.007.
19. Трухачёва Н. Математическая статистика в медико-биологических исследованиях с применением пакета Statistica. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2012.
20. Lukic J., Chen V., Strahinic I. et al. Probiotics or prohealers: the role of beneficial bacteria in
tissue repair. Wound Repair and Regeneration. 2017;25(6):912-922. doi: 10.1111 / wrr.12607
21. Cerdó T., García-Santos J. A., Bermúdez M., et al. The role of probiotics and prebiotics in the prevention and treatment of obesity. Nutrients. 2019;11(3):635. doi: 10.3390 / nu11030635
22. Sivamaruthi B. S., Kesika P., Chaiyasut
C. The role of probiotics in colorectal cancer management. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020;2020(40). doi: 10.1155/2020/3535982
23. Masood M. I., Qadir M. I., Shirazi J. H., et al. Beneficial effects of lactic acid bacteria on human beings. Critical reviews in microbiology. 2011;37(1):91-98. doi:10.3109 / 1040841X.2010.536522
24. Valdéz J. C., Peral M. C, Rachid M, Valdez J. C. et al. Interference of Lactobacillus planta-rum with Pseudomonas aeruginosa in vitro and in infected burns: the potential use of probiotics in wound treatment. Clinical microbiology and infection. 2005;11(6):472-479. doi: 10.1111 / j.1469-0691.2005.01142.x
25. Pfefferle P. I., Prescott S. L., Kopp M. Microbial influence on tolerance and opportunities for intervention with prebiotics/probiotics and bacterial lysates. Journal of allergy and clinical immunology. 2013;131(6):1453-1463. doi: 10.1016 / j.jaci.2013.03.020
26. Zhuo Q., Yu B., Zhou J. Lysates of Lactobacillus acidophilus combined with CTLA-4-blocking antibodies enhance antitumor immunity in a mouse colon cancer model. Scientific reports. 2019;9(1):1-12. doi: 20128(2019).
27. Brandi J., Cheri S., Manfredi M., et al. Exploring the wound healing, anti-inflammatory, anti-pathogenic and proteomic effects of lactic acid bacteria on keratinocytes. Scientific reports. 2020;10(1):1-14. doi: 11572( 2020 ).
REFERENCES
1. Halima B. A., Alkali Z. D., Shafiu N. A. Lactic acid bacteria: a review. International Journal of Advanced Academic Research | Sciences, Technology and Engineering. 2020;6(3):21-36.
2. Haller M., Mironov S., Karschin A., Richter
D. W. Dynamic activation of K(ATP) channels in rhythmically active neurons. The Journal of Physiology. 2001;537(1):69-81. doi:10.1111/ j.1469-7793.2001.0069k.x
3. Gadotti C., Nelson L., Diez-Gonzalez F. Inhibitory effect of combinations of caprylic acid and nisin on Listeria monocytogenes in queso fresco. Food Microbiology. 2014;39:1-6. doi:10.1016/j.fm.2013.10.007
4. Lavermicocca, P., Valerio, F., Evidente, A., Lazzaroni, S., Corsetti, A., Gobbetti, M. Purification
and characterization of novel antifungal compounds by sourdough Lactobacillus plantarum 21B. Applied and Environmental Microbiology. 2000;66:4084-4090. doi:10.1128/AEM.66.9.4084-4090.2000
5. Stoyanova L., Ustiugova E., Netrusov A. Antibacterial metabolites of lactic acid bacteria: Their diversity and properties. Appl. Biochem. Microbiol. 2012;48:229-243 doi: 10.1134/ S0003683812030143
6. Alatar F., Bushell F., Sannasiddappa T., Herbert J., Falciani F., Lund P. Molecular approaches to understand the effect of acetic acid in uropathogenic E. coli. Access Microbiology. 2019;1(1A). doi.org/10.1099/acmi.ac2019.po0478
7. Cortés-Zavaleta O., López-Malo A., Hernández-Mendoza A., García H.S. Antifungal activity of lactobacilli and its relationship with 3-phenyllactic acid production. Intern. J. of Food Micro-biol. 2014;173:30-35.
8. Florou-Paneri P., Christaki E., Bonos E. Lactic acid bacteria as source of functional ingredients (w) Lactic Acid Bacteria - R & D for Food, Health and Livestock Purposes, red. M. Kongo, InTech, Rijeka; 2013:589-614.
9. Lavermicocca P., Valerio F., Evidente A., Lazzaroni S., Corsetti A., Gobbetti M. Purification and characterization of novel antifungal compounds by sourdough Lactobacillus plantarum 21B. Applied and Environmental Microbiology. 2000;66:4084-4090 doi:10.1128/AEM.66.9.4084-4090.2000
10. Nuryana I., Andriani A., Lisdiyanti P., and Yopi. Analysis of organic acids produced by lactic acid bacteria. IOP Conf. Series: Earth and Environmental Science 2019;251. doi:10.1088/1755-1315/251/1/012054
11. Bibarsova A. A., Semenova E. F., Zhuchenko
E. V. Study of the influence of modern antibiotic preparations on some probiotic strains and their associative culture. Voronezh University Bulletin. Series «Chemistry. Biology. Pharmacy». 2015;2:101-105. (In Russ).
12. López-Seijas J., García-Fraga B., Abigail
F. da Silva, Sieiro C. Wine Lactic Acid Bacteria with Antimicrobial Activity as Potential Biocontrol Agents against Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici. Agronomy. 2020;10(1):31. doi: 10.3390/agronomy10010031
13. Nowak A., Slizewska K., Libudzisz Z. Probiotyki - historia i mechanizmy dzialania. Zywn. Nauka Technol. Jakosc. 2010;71:5-19.
14. Rzhevskaya V. S., Teplitskaya L. M., Oturina I. P. Study of the biological properties of strains of lactic acid bacteria. Scientific notes of the V.I. Vernadsky. Series «Biology, Chemistry». 2014;27(66),1:145-160. (In Russ).
15. Patent 2524117. RU. The strain of the bacterium Lactobacillus acidophilus RCAM01850 used for the preparation of a fermented milk product / Bibarsova A. A., Semenova E. F., Moiseeva I. Ya., Stepanova A. P., Lovtsova L. B., (RU.) Application 2013131302/10 (046807), 08.07.2013, publ. 07/27/2014. Bul. No. 21. (In Russ.).
16. Patent 2588386. RU. The strain of the bacterium Lactococcus lactis is a component of lactic acid sauerkraut / Bibarsova A. A., Semenova E. F., Moiseeva I. Ya., Stepanova A. P., Lovtsova L. B. (RU.) Application No. 2015118880, 05/19/2015, publ. 06/27/2016. Bul. No. 18. (In Russ).
17. Patent 2590716. RU. The strain of the bacterium Streptococcus thermophilus used for the preparation of a fermented milk product / Bibarsova A. A., Semenova E. F., Moiseeva I. Ya., Stepanova A. P., Markelova N. N. (RU.) Application No. 2015119939, 05/26/15, publ. 10.07.2016. Bul. No. 19. (In Russ.).
18. Stepanova A. P., Lovtsova L. B., Bibarsova A. A., Zolkina N. G., Semenova E. F. Screening studies of cultural and morphological characters and physiological and biochemical properties of collection strains of lactic acid bacteria. VNII Fat Bulletin. 2020;1-2:83-87. doi: 10.25812/ VNIIG.2020.43.29.007 (In Russ.).
19. Trukhacheva N. Mathematical statistics in biomedical research using the Statistica package. M. : GEOTAR-Media; 2012. (In Russ).
20. Lukic J., Chen V., Strahinic I. et al. Probiotics or prohealers: the role of beneficial bacteria in tissue repair. Wound Repair and Regeneration. 2017;25(6):912-922. doi: 10.1111 / wrr.12607
21. Cerdó T., García-Santos J. A., Bermúdez M. The role of probiotics and prebiotics in the
prevention and treatment of obesity. Nutrients. 2019;11(3):635. doi: 10.3390 / nu11030635
22. Sivamaruthi B. S., Kesika P., Chaiyasut C. The role of probiotics in colorectal cancer management. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020;2020(40). doi: 10.1155 / 2020/3535982
23. Masood M. I., Qadir M. I., Shirazi J. H., et al. Beneficial effects of lactic acid bacteria on human beings. Critical reviews in microbiology. 2011;37(1):91-98. doi: 10.3109 / 1040841X.2010.536522
24. Valdéz J. C., Peral M. C, Rachid M, Valdez J. C. et al. Interference of Lactobacillus planta-rum with Pseudomonas aeruginosa in vitro and in infected burns: the potential use of probiotics in wound treatment. Clinical microbiology and infection. 2005;11(6):472-479. doi: 10.1111 / j.1469-0691.2005.01142.x
25. Pfefferle P. I., Prescott S. L., Kopp M. Microbial influence on tolerance and opportunities for intervention with prebiotics/probiotics and bacterial lysates. Journal of allergy and clinical immunology. 2013;131(6):1453-1463. doi: 10.1016 / j.jaci.2013.03.020
26. Zhuo Q., Yu B., Zhou J. Lysates of Lactobacillus acidophilus combined with CTLA-4-blocking antibodies enhance antitumor immunity in a mouse colon cancer model. Scientific re-ports. 2019;9(1):1-12. doi: 20128 (2019).
27. Brandi J., Cheri S., Manfredi M. Exploring the wound healing, anti-inflammatory, anti-pathogenic and proteomic effects of lactic acid bacteria on keratinocytes. Scientific reports. 2020;10(1):1-14. doi: 11572 (2020).
