Скрининг бактериоцинпродукцирующих штаммов молочнокислых бактерий для создания препарата с антимикробными свойствами Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 579.672

Скрининг бактериоцинпродукцирующих штаммов молочнокислых бактерий для создания препарата с антимикробными свойствами

Г. С. ВОЛКОВА, канд. техн. наук

ВНИИ пищевой биотехнологии — филиал ФИЦ питания, биотехнологии и безопасности пищи, Москва А. П. БЕЛЕКЧИ, студент

Московский государственный университет пищевых производств

В странах с развитой пищевой промышленностью наиболее актуальным является вопрос поиска безвредных и эффективных препаратов, увеличивающих сроки хранения продуктов питания. Вместо традиционных химических консервантов с этой целью начали применять бактериоцины и бактерии-продуценты. Молочнокислые бактерии продуцируют широкий спектр бактериоцинов, способных задерживать рост или полностью уничтожать развитие микроорганизмов, вызывающих порчу плодов и овощей.

Поиск природных консервантов, отвечающих требованиям потребителей и производителей — актуальный вопрос и для нашей страны. К сожалению, изучение бактериоцинов в России ведется в недостаточной степени [1].

В связи с тем что генетически обусловленная возможность синтеза бактериоцинов у микробов наиболее полно экспрессируется при оптимально подобранных условиях культивирования, достижение максимальной продукции антимикробного вещества требует экспериментального подбора питательных сред и режимов культивирования [2]. Благодаря биосинтезу штаммами молочнокислых бактерий биологически активных компонентов (органических кислот, бакте-

Таблица 1

Основные метаболиты, выделяемы отдельными штаммами

риоцинов, ферментов, витаминов), культуральная жидкость имеет те только антимикробные, но и защитно-профилактические свойства [3].

Эффективность антимикробных препаратов в отношении штаммов, вызывающих микробную порчу, обусловлена комплексом факторов, в числе которых физические, физико-химические и биологические. Эти факторы действуют совместно, блокируют рост микробной клетки и прорастание спор [4].

Таким образом, проблема поиска и изучения свойств новых штаммов-продуцентов бактериоцинов, перспективных для последующего создания препаратов и технологических вспомогательных средств для использования в пищевой промышленности, а также подбор питательных сред и оптимальных условий культивирования для синтеза бактериоцинов является актуальной.

Цель исследования — скрининг бактериоцинпроду-цирующих штаммов молочнокислых бактерий с целью создания препарата с антимикробными свойствами для использования при хранении плодоовощной продукции.

Объектами исследования являлись 12 штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий, которые в предварительных исследованиях охарактеризованы как бактериоцинпродуцирующие.

Экспериментальная часть. Анализ качественного состава метаболитов, образуемых исследуемыми штаммами на среде MRS, представлен в табл. 1.

При проведении скрининга высокопродуктивных штаммов молочнокислых бактерий использовали следующие критерии:

• высокая кислотообразующая активность и преимущественное образование молочной кислоты;

• активное использование лактозы;

• антагонистические свойства в отношении посторонней микрофлоры.

Образование молочной кислоты является одним из основных критериев отбора штаммов. Чем выше показатели образования молочной кислоты, тем выше биосинтетическая активность штамма. Выращивание молочнокислых бактерий проводили в колбах с 120 см3 неосветленной творожной сыворотки с добавлением 1 % сухих солодовых ростков. В динамике роста бактерий измеряли потребление лактозы и накопление молочной кислоты. Для нейтрализации молочной кис-

Штамм продуцент Основные метаболиты

Lactobacillus delbrueckii «ВД» Молочная кислота (ЬА)

L. acidophilus ВКМ1660 (Т) ЬА, ацидоцин, ацидофилин

L. acidophilus var. cocoideus ВНИИПБТМ-94 1_А. ацидоцин, ацидофилин

L. easel subsp. casei 17 |_А, казеицин

L. plantarum ВНИИПБТ 578/26 1_А, плантации, плантоцирин,сальварицин

L. plantarum ВНИИПБТ 314 1_А, плантации

L. delbrueckii subsp. bulgaricus BKM 1923 1_А, булгарин

Lactococcus lactis subsp. lactis 24/48 1_А. низин, лактококцин

Lactococcus lactis subsp. lactis 119/05 1_А, низин, лактококцин

Lactococcus lactis subsp. lactis 1500/12 ЬА, низин, лактококцин

Lact. lactis subsp. lactis МГУ 1_Д низин

(ВКПМ-4591)

Lactobacillus brevis 1 1_А, бревин

Таблица 2

Количество бактериоцинов, образуемых отобранными штаммами

Щ Содержание органических кислот, % Ц Содержание бактериоцинов, мг/дм3

Отбор культур продуцентов органических кислот и бактериоцинов (на 48 часов роста)

Культура Количество бактериоциноподобных веществ, мг/дм3

Lactobacillus plantarum 578/26 7,91

Lactococcus lactis subsp. lactis 1500/12 4,27

Lactobacillus acidophilus 1660 8,25

Таблица 3

Оценка антимикробной активности штамма Lactobacillus acidophilus ВКМ 1660 по отношению к тест-культурам

Зоны угнетения роста, мм

Тест-культуры Lactobacillus acidophilus 1660 Lactobacillus plantarum 578/26 Lactococcus lactis subsp. lactis 1500/12

Вас. mesentericus (4 шт.) 25,0±3,0 22,5±3,0 20,5±3,0

Вас. subtUis (3 шт.) 25,0±3,0 21,0±3,0 21,0+3,0

Klebsiella pneumoniae 26,0±3,0 23,5±3,0 2305+3,0

Salmonella typhimurium 26,5±3,0 25,0±3,0 25,0+3,0

Shigella flexneri 27,5±3,0 25,0+3,0 24,0±3,0

Mycobacter smegmatis 20 27,5±3,0 25,0+3,0 23,0±3,0

Nocardia asteroides (2 шт.) 30,0+3,0 25,0±3,0 25,0±3,0

лоты использовали мел. Полученные результаты представлены на рис. 1.

Результаты по отбору штаммов-продуцентов представлены на рис. 1.

Из данных таблицы видно, что наиболее эффективно процесс кислотообразования и накопления бактериоцинов осуществляют культуры Lactobacillus acidophilus 1660, Lactobacillus plantarum 578/26, Lactococcus lactis subsp. lactis 1500/12. Эти культуры отобраны для дальнейших исследований.

Далее провели количественное определение количества синтезируемых бактериоцинов на среде MRS. Культивирование проводили в течение 120 ч при 37 °С, доза засева — 10% 24-суточной культурой посевного материала. Контролем служил очищенный коммерческий препарат низаплина в концентрации 12,5 мг/л (табл. 2).

В дальнейших исследованиях установлено, что при совместном культивировании отобранных штаммов количество бактериоцинов может быть увеличено

—, nrvniunininra ТТТ1ТПТАТТТ.1ТПЙ Г>ГМ»7ТЫ И ппгтбоппм

условий культивирования.

Антимикробную активность культуральной жидкости штаммов изучали по методу лунок путем измерения диаметра зоны задержки роста тест-культур. Выращивание тест-культур микроорганизмов осуществляли согласно рекомендациям, указанным в паспортных данных. Через 24 ч инкубации измеряют величину зоны угнетения роста тест-штаммов. Результаты замеров зон задержки роста для штамма Lactobacillus acidophilus ВКМ 1660 представлены в табл. 3.

Зоны задержки роста тест-культур были в пределах 20—30 мм. Это подтвердило наши предположения о выделении культурами в среду антимикробных

веществ. На основании проведенной экспериментальной работы сделан вывод о возможности использования в качестве защитно-профилактических препаратов культуральной жидкости отобранных штаммов.

На основании экспериментальных исследований создан консорциум из отобранных штаммов молочнокислых бактерий. При совместном культивировании консорциума в культуральной жидкости накапливаются L-молочная кислота, растворимые белки, ката-лазно-пероксидазные и лактатдегидрогеназные комплексы. Кроме того, обнаружены цитохромоксидаз-ные системы, а также витамины группы В.

Выводы

1. Провели скрининг молочнокислых бактерий по кислотообразующей активности и накоплению бак-териоциноподобных веществ. В качестве наиболее перспективных отобраны культуры Lactobacillus acidophilus 1660, Lactobacillus plantarum 578/26, Lactococcus lactis subsp. lactis 1500/12, синтезирующие соответственно 8,25; 7,91 и4,2/мг/дм-' ЬЗКТериоци-нов.

2. Установлено, что метаболиты отобранных культур обладают выраженными антимикробными свойствами, особенно в отношении бактериальных форм микроорганизмов, а также угнетают рост возбудителя порчи овощей и фруктов Nocardia asteroides.

Научно-исспедовательская (поисково-аналитическая) работа по подготовке рукописи проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках Программы Фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013-2020 годы (тема № 0529-2016-0047)

Литература

1. Римарева, Л. В. Комплексные биоконсерванты органического происхождения на основе консорциумов проби-отических культур / Л. В. Римарева, Г. С. Волкова, Е.В. Куксова // Сборник научных трудов. «Вопросы питания». - М.: ГЭОТОР-Медиа, 2016. - С. 209-210.

2. Харитонов, Д. В. Некоторые особенности замораживания микроорганизмов в среде жидкого азота / Д. В. Харитонов // Сборник научных трудов. «Научное обеспечение молочной промышленности (ВНИМИ-80)». — М.: ВНИМИ, 2009. - С. 393-397.

3. Дубровский, A.A. Применение бактериоционов в технологии маринованных мясных полуфабрикатов / А. А. Дубровский // Биотехнологии и ресурсосберегающие инженерные системы. — 2016. — С. 43-45.

4. Корж, А. П. Прикладные биотехнологии — инструмент развития мясной отрасли / А. П. Корж // Мясной ряд. — 2016. - № 4. - С. 22-26.

5. Поляков, В. А. Белковые биологически активные продукты на основе кислотообразующих микроорганизмов и использование их при кормлении различных видов животных и птиц / В. А. Поляков В. А. [и др.] // Материалы III Международной научно-технической конференции. - Воронеж, 2009. - С. 288-290.

References

$4 V.

13-я международная выставка технологий производства пива и напитков

Shanghai New International Expo Centte (SNIEC). Шанхай. Китаи

23-26 октября, 2018

Ведущая выставка Азии, посвященная индустрии напитков и жидких продуктов питания

1.

2.

4.

5.

Rimareva, L.V Kompleksnye biokonservanty organicheskogoproisho-zhdenija na osnove konsorciumov probioticheskih kul'tur [Complex preservatives organic origin on the basis of consortiums of probi-otic cultures] / L.V. Rimareva, G.S. \folkova, E.V. Kuksova // Sbomik nauchnyh trudov; Afoprosy pitanija». Moscow, GJeOTOR-Media, 2016, p. 209-210.

Haritonov, D. V. Nekotorye osobennosti zamorazjiivaruja mikroor-ganizmov v srede zhidkogo azota [Some features of freezing microorganisms in a liquid nitrogen environment] / D. V. Haritonov // Sbornik nauchnyh trudov. «Nauchnoe obespechenie molochnoj promyshlennosti (VNIMI-80)». Moscow, VMIMI, 2009. p. 393-397.

Dubrovskij, A. A. Primenenie bakteriocionovv tehnologii marinovan-nyh mjasnyh polufabrikatov [The use of bacteriocins in the technology of pickled meat products] / A. A Dubrovskij I I Biotehnologii i resursosberegajushhie inzhenernye sistemy, 2016, p. 43—45. Korzh, A P. Prikladnye biotehnologii — instrument razyitija mjasnoj otrasli [Applied biotechnologies — a tool for the development of the meat industry] / A. P Korzh // Zhurnal «Mjasnoj ijad», 2016, no. 4, p. 22-26.

Poljakov, V. A Belkovye biologichecki aktivnye produkty na ocnove kiclotoobrazujushhih mikmorganizfnov i icpohzovanie ih pri kormenii razlichnyh vidovzhiwtnyh iptic [Protein biologically active products based on acid-forming microorganisms and their use in feeding various species ofanimals and birds]/V.A. Poljakov V.A. [etal]// Materialy III Mezhdunarodnoj nauchno-tehnicheckoj konferencii. \foronezh, 2009, p. 288-290.

t

w

ГЛАВНОЕ СОБЫТИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ИНДУСТРИИ

"" yTFlT^hf XI МЕЖДУНАРОДНАЯ ВЫСТАВКА'"

• ©ComplEX LABComplEX

АНАЛИТИКА ЛАБОРАТОРИЯ БИОТЕХНОЛОГИИ HI-TECH

Припоядарж*«: Ц gfamcrepcni

Организаторы: I Í 1ЛТ

:

МЕЖДУНАРОДНАЯ ВЫСТАВКА КОМПЛЕКСНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ ЛАБОРАТОРИЙ

АНАЛИТИЧЕСКОЕ, ЛАБОРАТОРНОЕ, ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОРУДОВАНИЕ

ИННОВАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ КОМПЛЕКСНЫЕ РЕШЕНИЯ И УСЛУГИ ДЛЯ ЛАБОРАТОРИИ

ТОРГОВЫХ МАРОК, МИРОВЫХ БРЕНДОВ

270 17-19 35

ОКТЯБРЯ 2018

6500 Украина, Киев 300 * ■ i

, НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИХ МВЮПМЯТИЙ

МЕЖДУНАРОДНОЕ УЧАСТИЕ И ПОСЕЩЕНИЕ

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ И БИЗНЕС ПРОГРАММЫ, МАСТЕР-КЛАССЫ НА ДЕЙСТВУЮЩЕМ ОБОРУДОВАНИИ

По вопросам участия в выставке: а -380144] 206-10-16 LH -380144! 206-10-97 J lab lmt.kiev.ua, lab 2 Imt.klev.ua

По вопросам участия в научно-практической программе: ¡Я-380!44 206 10-99

^marketing :labcomp!ex.com

www.labcomplex.com

Организаторы

China National United Equipment Group Co.. Ltd. Китайская ассоциация по производству оборудования легкой промышленности

Соорганизаторы

Beijing Zhongqing Hefi international Exhibition Co. Messejaiiehchen Shanghai Co., Ltd.

KOHT8№ ПЧ^^Ж ■

Tel. P

E-mail: сЬЬвгаЩ!ВпР Website: ebb.drinktoc.com

Скрининг бактериоцинпродукцирующих штаммов молочнокислых бактерий для создания препарата с антимикробными свойствами

Ключевые слова

антимикробные свойства; бактериоцины; биосинтез;

молочнокислые бактерии. Реферат

Проблема поиска и изучения свойств новых штаммов-продуцентов бактериоцинов, перспективных для последующего создания препаратов и технологических вспомогательных средств для использования в пищевой промышленности, а также подбор оптимальных условий культивирования для синтеза бактериоцинов является актуальной. Молочнокислые бактерии продуцируют широкий спектр бактериоцинов, способных задерживать рост или полностью уничтожать развитие микроорганизмов, вызывающих порчу плодов и овощей. Проведен скрининг молочнокислых бактерий по кислотообразующей активности и накоплению бактериоциноподобных веществ. Изучен качественный состав метаболитов, образуемых исследуемыми штаммами на среде MRS, обнаружены характерные бактериоцины: ацидоцин, ацидофилин, плантарицин, сальварицин, низин, лакгококкцин. В качестве наиболее перспективных отобраны культуры Lactobacillus acidophilus 1660, Lactobacillus

plantarum 578/26, Lactococcus lactis subsp. lactis 1500/12, синтезирующие соответственно 8,25; 7,91 и 4,27мг/дм3 бактериоцинов. Установлено, что метаболиты отобранных культур обладают выраженными антимикробными свойствами, особенно в отношении бактериальных форм микроорганизмов, а также угнетают рост возбудителя порчи овощей и фруктов Nocardia asteroides. В дальнейших исследованиях установлено, что при совместном культивировании отобранных штаммов количество бактериоцинов может быть увеличено методом оптимизации питательной среды и подбором условий культивирования. При совместном культивировании консорциума в культуральной жидкости накапливаются L-молочная кислота, растворимые белки, каталазно-пероксидазные и лактатдегидрогеназные комплексы. Кроме того, обнаружены цитохромоксидазные системы, а также витамины группы В. Создан консорциум из отобранных штаммов молочнокислых бактерий для создания препаратов с антимикробными свойствами.

Авторы

Волкова Галина Сергеевна, канд. техн. наук ВНИИ пищевой биотехнологии —

филиал ФИЦ питания, биотехнологии и безопасности пищи

111033, Москва, ул. Самокатная, д. 46, galina.volkova@bk.ru

Белекчи Анастасия Петровна, студент

Московский государственный университет

пищевых производств

125080, Москва, Волоколамское ш., д. 11,

Abelekchil 994 ©gmail.com

Screening of Bacteriocin-Producing Strains of Lactic Acid Bacteria to Create a Drug with Antimicrobial Properties

Key words

antimicrobic properties; bakteriotsina; biosynthesis; lactic bacteria.

Abstract

The problem of finding and studying the properties of new strains-producers of bacteriocins, promising for the subsequent creation of drugs and technological AIDS for use in the food industry, as well as the selection of optimal cultivation conditions for the synthesis of bacteriocins is relevant. Lactic acid bacteria produce a wide range of bacteriocins that can delay growth or completely destroy the development of microorganisms that cause damage to fruits and vegetables. Screening of lactic acid bacteria by acid-forming activity and accumulation of bacteriocin-like substances was carried out. Studied the qualitative composition of the metabolites formed by the studied strains in MRS medium, showed the characteristic bacteriocins: acidosis, acidophilus, plantaricin, salivaricin, nisin, Lactococcus. As the most promising selected culture 1660 Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum 578/26, producer Lactococcus lactis subsp. lactis 1500/12, synthesizing respectively 8.25; 7.91 and 4.27 mg/dm3 bacteriocins. It is established that metabolites of the selected cultures possess the expressed antimicrobial properties, especially concerning bacterial forms of microorganisms, and also oppress growth of the causative agent of spoilage of vegetables and fruits Nocardia asteroids. In further studies, it was found that with the joint cultivation of the selected strains, the number of bacteriocins can be increased by optimizing the nutrient medium and selecting the cultivation conditions. When the consortium is jointly cultivated, L-lactic acid, soluble proteins, catalase-peroxidase and lactate dehydrogenase complexes accumulate in the culture liquid. In addition, discovered zitohromoksidasy systems, as well as b vitamins Created by a consortium of selected strains of lactic acid bacteria to create drugs with antimicrobial properties.

Authors

Volkova Galina Sergeevna, Candidate of Technical Sciences The All-Russian Research Institute of Food Biotechnology — branch of Federal State Budgetary Institution of Science of the Federal Research Center of Food and Biotechnology and Food Safety,

4B, Samokatnaya St., Moscow, 111033, Russia, galina.volkova@bk.ru

Belekchi Anastasija Petrovna, Student

Moscow State University of Food Production,

11, Volokolamsk sh„ Moscow, 125080, Abelekchi1994@gmail.com