CC BY
488 BIOLOGICAL SCIENCES / <<C@LL©(MUM~J0U®MAL>>#3(I27)),2©]]9
УДК 581.19:577.157
Абдуллаева Н. Ф.
Зульфугарлы B-Ш.
Гюльахмедов С.Г.
Кулиев А.А.
Бакинский Государственный Университет
ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРНЫХ УСЛОВИЙ НА БИОСИНТЕЗ И СЕКРЕЦИЮ БАКТЕРИОЦИНА
ШТАММА LACTOBACILLUS PENTOSUS M3
Abdullayeva N.F.
Zulfuqarli V.Sh.
Gulahmadov S. Q.
Kuliyev А.А.
Baku State University
THE EFFECT OF TEMPERATURE CONDITIONS ON THE BIOSYNTHESIS AND SECRETION OF A BACTERIOCIN-LIKE INHIBITORY SUBSTANCE BY THE STRAIN LACTOBACILLUS
PENTOSUS M3
Аннотация
Исследовано влияние температурных условий на биосинтез и секрецию бактериоциноподобного ин-гибирующего вещества штамма Lactobacillus pentosus M3, изолированного из образца сыра «Шекинский мотал». Для биосинтеза бактериоцина и роста культуры штамма продуцента наименее благоприятной температурой являлась температура в пределах от 10-150С и высокие температурные значения в пределах от 40-450С. Для секреции антимикробной субстанции в культуральную жидкость наиболее оптимальной температурой была 300С.
Abstract
The effect of temperature conditions on the biosynthesis and secretion of a bacteriocin-like inhibitory substance by the strain Lactobacillus pentosus M3, isolated from a sample of Sheki Motal cheese, was studied. For bacteriocin biosynthesis and culture growth of a producer strain, the least favorable temperature was a temperature ranging from 10-15 ° C and high temperature values ranging from 40-45 ° C. For secretion of the antimicrobial substance into the culture fluid, the most optimal temperature was 30 ° C.
Ключевые слова: бактериоциноподобные ингибирующие вещества, антимикробные субстанции, бактериоцины, молочнокислые бактерии.
Key words: bacteriocine like inhibitory substances, antimicrobial substances, bacteriocins, lactic acid bacteria.
Введение
За последние годы наблюдается повышенный интерес к использованию бактериоцинов или, как их называют в литературе и повседневной практике, "естественных" антибиотиков, образуемых лактобактериями. Одним из главных аспектов данного интереса является возросший спрос потребителей к качеству продуктов питания и их безопасности для человечества [3, с.4]. Широко используемые химические консерванты и антибиотики, увеличивающие срок хранения продуктов питания вызывают большие опасения [7, с.6]. Использование молочнокислых бактерий (МКБ) и их метаболитов, обладающих антимикробными свойствами, является одним из активно разрабатываемых альтернативных подходов к консервированию продуктов питания. Как известно, МКБ тесно ассоциированы с пищевыми продуктами и имеют "GRAS" (Generally Recognized As Safe) статус, что определяет их как безопасные для здоровья человека и животных [11, с.7].
Исследования в данном направлении с традиционными кисломолочными продуктами Азербайджана впервые были начаты нами, сотрудниками
кафедры биохимии и биотехнологии Бакинского государственного университета (БГУ) ещё в 2005 году [13, с.3]. Влияние бактериоцинов на рост чувствительных бактерий может иметь как бактерио-статический, так и бактерицидный характер. Эти явления обнаруживаются только при секреции активного компонента на среду обитания чувствительных клеток. Однако, несмотря на способность бактерий синтезировать бактериоцины, вследствие их адсорбции на поверхность продуцента, иногда они не обнаруживаются в культуральной жидкости. При этом степень адсорбции сильно зависит от концентрации водородных ионов в среде [2, с.5; 5, с.6; 12, с.9].
L. pentosus M3 впервые изолирован сотрудниками нашей кафедры из традиционного образца сыра «Мотал», приобретенного из Шеки. Бакте-риоцин данного штамма подавляет рост ряда грамположительных и грамотрицательных бактерий, что указывает на его прикладной потенциал [8, с.5; 11, с.4; 13, с.3]. В работе исследована термозависимость биосинтеза и секреции бактерио-цина штаммом L. pentosus M3.
«C©yL©qyiym=J©yrMaL»#3i27),2©19 / BIOLOGICAL SOUNdS
Материалы и методы
Выделение чистых культур проводили на твёрдых средах MRS и гидролизованном молоке с содержанием 1,5% агара. Полученные культуры поддерживали при -200 в обезжиренном молоке с добавлением 40% глицерина. Антимикробную активность определяли методом диффузии в агар [6, е.3]. В агар среде, засеянной клетками тест-культуры, прорезались лунки диаметром 10 мм и в каждую из них добавляли по 200 мкл культураль-ной жидкости потенциального продуцента. После чего образцы помещали в термостат и выдерживали в течение ночи при оптимальной температуре роста тест-культуры. Антибактериальную активность культуральной жидкости оценивали посредством анализа критического разбавления [1, с.8]. Активность бактериоциноподобного ингибирую-щего вещества определяли как величину, обратную наивысшему разбавлению культуральной жидкости, проявляющую зону ингибирования индикаторных штаммов более чем на 2 мм и выражали в произвольных единицах, делённых на миллилитр культуральной жидкости (ПЕ^мл-1) [4, с. 11; 9, с.6].
Скрининг активных штаммов проводили методом реплик [5, с.4]. 1 г сыра гомогенизировали в физиологическом растворе с последующим разведением суспензии до 10-9 степени. Затем из пробирок разных степеней разбавления брали 1 мл суспензии и вносили в 15 мл MRS-среды, содержащей 1,5% агар при температуре 500С, разливали в чашку Петри и инкубировали при 300 в течение 48 часов. Затем на нее наслаивали суспензию L.bulgaricus 340. Ее приготовляли путем инокули-ровании (200 мкл) в 10 мл MRS-среды (содержащей 0,7% агар), до конечной клеточной концентрации приблизительно 1.5*105 КОЕ/мл (КОЕ -колоний образующие единицы) и инкубировали при 370С в течение 24 часов. Активными считали колонии штамма, образующие наибольшую зону ингибирования роста. Они были использованы для дальнейших исследований [1, с. 10-11].
Динамику продуцирования бактериоцина изучали при температурных условиях 100С, 300С, 370С и 450С, при неконтролируемых условиях рН. Через каждый определенный интервал времени проверяли рН и рост клеток путем измерения оптической плотности суспензии (ОП при 600 нм).
Результаты и их обсуждение
На рисунке 1 отображена динамика продуцирования бактериоцино-подобного ингибирующего вещества штаммом Lactobacillus pentosus M3 при
9_
разных температурных условиях. Как видно из рисунка, низкие (10-150С) и высокие (40-450С) температурные условия неблагоприятно воздействуют на процесс биосинтеза бактериоцина (рис. А и В). Так, при 100С, активность прослеживается после 10 часов культивирования и то, только в мизерных количествах (10 ПЕ/мл). Дальнейшее культивирование штамма в течение последующих 10 часов не отражалось на активности бактерио-цина и оставалось на низком уровне. При температуре равной 450С антимикробная активность бак-териоцина была существенно выше той, наблюдаемой, при 100С и составила 60 ПЕ на каждый мл культуральной жидкости, что значительно выше предыдущей. При этом активность наблюдалась намного раньше, уже после 6 часов с начала культивирования штамма. Динамика биосинтеза бакте-риоцина штаммом Lactobacillus pentosus M3 изучена также при температуре 300С (рис.Б). Эксперименты показали, что наиболее оптимальной температурой для биосинтеза бактериоцина является 300С. Антимикробная активность достигала своего максимального значения в конце экспоненциальной фазы роста клеток и составила 240 ПЕ/мл, что на 60 единиц больше активности, наблюдаемой при 370С (данные не показаны).
При одинаковых интервалах времени наименьшая оптическая плотность культуральной жидкости была обнаружена в культуре, выращенной при 100С, а наиболее высокая - в культуре при 300С. Оптимальная температура роста и биосинтеза бактериоцина штаммом Lactobacillus pentosus M3 равна 300С. Низкие и высокие показатели температуры отрицательно влияют на данные процессы. Судя по всему, эти температурные условия неблагоприятны для всех метаболических процессов, включая и биосинтез антимикробных субстанций. По литературным данным, представители рода Lactobacillus обычно хорошо растут при 300С и 370С. Однако, в зависимости от вида, оптимальной температурой роста и биосинтеза бактериоци-на может быть как 300С, так и 370С [5, 8, 11]. По литературным данным, между характером действия продуцируемых бактериоцинов и видовой специфичностью бактериоциногенных штаммов корреляция не наблюдается. Однако степень адсорбции бактериоцинов при нейтральных значениях рН на поверхность клеток-продуцентов может варьировать от 75% до 100% [4, с.12; 7, с.5; 12, с.9].
о
Оптическая плотность (ОП 600 нм)
Оптическая плотность (620 нм)
л.
а
■а
о
рН културальной жидкости
рН культуральной жидкости
Антимикробная активность (ПЕ/мл)
Антимикробная активность (ПЕ/мл)
«C©yL©qyiym=J©yrMaL»#3î27),2©19 / BIOLOGICAL SCIENCES
11
Список литературы
1. Гюльахмедов С.Г. Антибактериальная активность молочнокислых бактерий, выделенных из традиционных молочных продуктов Апшерон-ского полуострова Азербайджана. - Баку. 2005. -С.59-65.
2. Стоянова Л.Г., Сультимова Т. Д., Нетрусов А. И. Влияние фосфата и углеводов на синтез низина Lactococcus lactis subsp. lactis штамм 194. -Баку. 2003. - С.17-22.
3. Abriouel H., Lucas R., Ben Omar N., et al. Potential applications of the cyclic peptide enterocin AS-48 in the preservation of vegetable foods and beverages // Probiotics and Antimicrobial Proteins. 2010. -V.2. - P.77-89.
4. Schilinger U. //In: Bills, D.D., Kung, S. (eds). Biotechnology and Food Safety. ButterworthHeinemann. - Boston. 1990. - Р.624.
5. Todorov S., Furtado D., Saad S., et al. Potential beneficial properties of bacteriocin-producing lactic acid bacteria isolated from smoked salmon // J Appl Microbiol. 2011. -V.110. - P.971-986.
6. Jamuna M., Babusha S., Jeevaratnam K. Inhibitory efficacy of nisin and bacteriocins from Lacto-bacillus isolates against food spoilage and pathogenic organisms in model food systems // Food Microbiol. 2005. -V.22. - P.449-454.
7. Schirru S., Todorov S., Favaro L., et al. Sardinian goat's milk as source of bacteriocinogenic potential protective cultures // Food Control. 2012. -V.25. -P. 309-320.
8. Riley M., Chavan M. Bacteriocins: ecology and evolution. Springer. - New York. 2007. -P.125.
9. De Vuyst L., Vandamme E.J. Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria. //In: De Vuyst & Vandamme (eds). Microbiology, Genetics and Application. Chapman & Hall. -New York. 1994. - P.312.
10. Ruiz-Moyano S, Martin A, Benito M., et al. Safety and functional aspects of preselected lactoba-cilli for probiotic use in Iberian dry-fermented sausages // Meat Sci. 2009. -V.83. - P.460-467.
11. Reid G., Burton J. Use of Lactobacillus to prevent infections by pathogenic bacteria // Microb.Infect. 2002. -V.4. -P.319-324.
12. Powell J., Witthuhn R., Todorov S., Dicks L. Characterization of bacteriocin ST8KF produced by a kefir isolate Lactobacillus plantarum ST8KF // Int Dairy J. 2007. -V.17. -P.190-198.
13. Gulahmadov S., Batdorj B., Dalgalarrondo M., et al. Characterization of bacteriocin-like inhibitory substances (BLIS) from lactic acid bacteria isolated from traditional Azerbaijani dairy products // European Food Rec. Tech. 2006. -V.224. -P.229-235.
UDC: 582.575.95
Eshpanov V.S., Anuarbekova A.S., Bitakova A.K.,
Kazakh University of Technology and Business
Sarsembay M. V. gymnasium № 22 Astana, Republic of Kazakhstan
USING THE CAPABILITIES OF SCANNING ELECTRON MICROSCOPY TO STUDY THE STRUCTURE AND CHEMICAL COMPOSITION OF THE EGGSHELL
Abstract
This article analyzes the deficiency of calcium in the human body. Conducted research methods. The results of the obtained data of the X-ray microanalysis system are shown. Proven beneficial property of calcium on the human body.
Key words: Source of biocalcia, malnutrition, minerals, eggshell, human body
According to who, every third person in the world suffers from malnutrition. More and more people lean on fast food in all its manifestations. And increasingly, the formula "we are what we eat" plays against us: statistics on obesity, diabetes, cardiovascular diseases, atherosclerosis are growing.
At the end of the XX century, the human need for food as an energy source has decreased dramatically -from three to four to two thousand kilocalories per day. But the" demand " of the body for vitamins, minerals and other useful elements remained the same. On the day a person needs to get about 170 different chemical compounds, most of which are not synthesized in our body[1,c.194].
It turns out that, on the one hand, we have to eat less food in calories, and on the other hand - more in
the content of micro-and macronutrients. How to restore balance?
The human body can not carry out a full life without calcium. Its deficiency can cause serious problems in the musculoskeletal system, heart, nervous system, vascular damage, destruction of dental and muscle tissues. Restoration of the reserve is so important for the body element contributes to a great source of calcium, which has a natural origin-eggshell[2,c.81].
Object of study: eggshell.
Research methods: after pre-boiling the eggshell, to disinfect its surface from microbial contamination, after cooking and washing the shell:
1. lay out on a paper or clean kitchen towel to dry together with the film, which remains on it;
