CC BY
109
УДК 615.331:577.182.44.07
идентификация и отбор культур ьлстососст
ЬЛСШ для защитно-профилактических пищевых и кормовых добавок
Г.С. ВОЛКОВА, кандидат технических наук, зав. лабораторией (e-mail: galina.volkova@bk.ru).
Е.В. КУКСОВА, кандидат технических наук, старший научный сотрудник
Л.В. РИМАРЕВА, доктор технических наук, зам. директора
Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии, ул. Самокатная, 4б, Москва, 111033, Российская Федерация
Резюме. Исследования проводили с целью отбора и идентификации культур Lactococcus lactis subsp. lactis, обладающих более широким спектром антибактериального действия для промышленного получения биоконсерванта на основе бак-териоцинов и L(+)-молочной кислоты. Изучено 7 штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis, из которых выделены 4 штамма с более высокой низинообразующей активностью. Активированные штаммы синтезируют низин на уровне 4200-5200 МЕ/ см3, или 100-130 мкг/см3. Проведена работа по идентификации культур продуцентов - ДНК-фингерпринт штаммов с помощью ПЦР с использованием модифицированных праймеров рибо-сомальных последовательностей, в результате которой обнаружены различия между отобранными культурами и исходным штаммом, депонированным в коллекции. Изученные штаммы чувствительны к антибиотикам, ингибирующим синтез белка и синтез клеточной стенки. Отобранный штамм Lactococcus lactis subsp. lactis В-8023 подавляет рост грамположительных бактерий, включая спорообразующие (диаметр зон угнетения роста 17,5-23 мм), а также ряда грамотрицательных бактерий Alcali-genes faеcalis, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis (диаметр зон угнетения роста 5-10 мм). На основании результатов экспериментов можно предположить, что спектр антибиотического действия зависит от штамм-специфичности культуры Lactococcus lactis subsp. lactis. И, вероятно, штамм В-8023 либо образует другой тип изомера низина, либо, наряду с низином, в незначительных количествах синтезирует ещё один бактериоцин. Полученные данные можно использовать в качестве исходных для создания технологической схемы производства комплексного биоконсерванта для пищевых и кормовых продуктов, различного сельскохозяйственного сырья. Ключевые слова: штаммы молочнокислых бактерий, низин, молочная кислота, бактериоцины, антибиотическое действие. Для цитирования: Волкова Г.С., Куксова Е.В., Римарева Л.В. Идентификация и отбор культур Lactococcus lactis для защитно-профилактических пищевых и кормовых добавок// Достижения науки и техники АПК. 2016. Т.30. № 8. С. 99-101.
В условиях снижения пищевой ценности продуктов питания и сельскохозяйственного сырья всё большую роль играют новые добавки функционального действия, среди которых лучше всего известны органические кислоты и бактериоцины, получаемые путем микробиологического синтеза. Они служат натуральными биоконсервантами и предназначены для использования в качестве защитно-профилактического, антимикробного средства для пищевых продуктов, кормов, продовольственного сырья, упаковочных материалов и тары. Наиболее изучен бакте-риоцин низин (код Е234), разрешённый для применения в качестве биологического консерванта экспертным комитетом по пищевым добавкам FAO/WHO.
Существует несколько форм низинов, которые продуцируют разные штаммы одного подвида Lactococcus lactis subsp. lactis. Однако активность известных природных продуцентов низка (от 579 до 1886 МЕ/мл), а антимикробный спектр действия низина распространяется, в основном, на грамположительные бактерии [1].
Цель нашей работы - отбор и идентификация культур Lactococcus lactis subsp. lactis, обладающих более широким спектром антибактериального действия для промышленного получения биоконсерванта на основе бактериоцинов и L^-молочной кислоты.
Условия, материалы и методы. Объектом исследования послужили штаммы-продуценты бактериоцина низина и L^-молочной кислоты Lactococcus lactis subsp. lactis из коллекции микроорганизмов ВНИИПБТ, ВКМ РАН, ВКПМ ГосНИИгенетика. Штаммы были лиофильно высушены и хранились в ампулах под вакуумом.
Молочнокислые бактерии Lactococcus lactis subsp. lactis выращивали на среде следующего состава (г): гидролизат казеина -10,0; мясной экстракт -10,0; дрожжевой экстракт -5,0; глюкоза - 20,0; ацетат натрия - 5,0; цитрат аммония (дву-замещенный) - 2,0; твин 80 -1,0; К2НРО4 - 2,0; MgSO4-7H2O -0,2; MnSO44H2O - 0,05; вода дистиллированная -1000 мл; рН 6,2-6,5. Среду стерилизовали при 0,5 атм. 20-30 мин.
Для засева чашек Петри использовали суточные тест-культуры бактерий и дрожжей, 5-и суточные культуры грибов в виде суспензии клеток в физиологическом растворе (1-10 клеток/см3 (по бактериальному стандарту мутности), из расчета 0,1 см3 суспензии на чашку Петри). Тест-культуры микроорганизмов выращивали согласно рекомендациям, указанным в паспортных данных.
Наращивание биомассы штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis осуществляли на питательной среде, содержащей (%): глюкозу - 1,0; NaCl - 0,2; KH2PO4 - 2,0; MgSO4 - 0,02; дрожжевой автолизат - 40-45 мг% по аминному азоту.
В качестве основной питательной среды использовали молочную сыворотку и обрат с внесением дополнительных источников органического и минерального питания [2, 3]. Ферментацию питательных сред проводили на стендовых установках в ферментерах «Biostat» B.Braun Melsungen AG (Германия).
Изучаемые культуры восстанавливали из ампул в пробирку с питательной средой, содержащей 12% стерильного обезжиренного молока, добавляли 1% дрожжевого автолизата и выращивали в термостате при 28-300С до образования сгустка, затем делали вторую и третью генерации.
Для нейтрализации кислоты в среде вносили раствор гидроксида натрия, поддерживая рН на уровне 6,6-6,8. Об окончании процесса ферментации судили по прекращению сдвига рН культуральной жидкости.
Изучение бактериоцинобразующей способности культур Lactococcus lactis subsp. lactis осуществляли с 7 штаммами-продуцентами. Наряду с образованием молочной кислоты, они характеризовались различной способностью к биосинтезу бактериоцинов, обладающих более широким спектром антимикробного действия.
После применения методики, повышающей способность продуцентов к низинообразованию, ферментации подготовленных сред и лиофилизации культур, проводили оценку низинобразующей активности культур штаммов, полученных после обработки низином до и после сушки.
Известно, что в процессе ферментации Lactococcus lactis subsp. lactis 85% бактериоцина накапливается в клетках [4, 5]. Поэтому после выращивания культуры и
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
высушивания определяли количество жизнеспособных клеток в наиболее активных штаммах-продуцентах.
Низинообразующую активность исследуемых штаммов определяли методом диффузии в агар с использованием тест-культуры Bacillus coagulans №15. Посев колоний с поверхности агаровой среды с индикатором 0,1% раствора бромкрезолового пурпурного на газон с тест-культурой осуществляли стерильно, отбирали колонии, образующие наибольшую зону просветления.
Определение L-(+) молочной кислоты проводили ферментативным методом с лактатдегидрогеназой с использованием набора реактивов Boehringer Mannheim. Антагонистическую активность культур определяли методом лунок по диаметру зон подавления роста патогенных и условно-патогенных тест-культур.
Активацию низинобразующих штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis осуществляли методом пассирования культуры на среде с обратом с добавлением коммерческого препарата Nisaplin «Aplin & Barrett Ltd».
Подготовленные среды ферментировали с помощью отобранных активных штаммов при температуре 28-300С и рН=6,6-6,8 с подтитровкой 20 %-ным раствором NaOH и перемешиванием культуральной жидкости на протяжении процесса со скоростью 150 об/мин. Для консервации низинообразующих штаммов куль-туральные жидкости стерильно разливали в ампулы, предварительно добавляя 1,5% обрата или желатины, затем лиофильно высушивали при минус 8-12°С.
Идентификацию культур-продуцентов - ДНК-фингерпринт с помощью ПЦР - проводили с целью выявления отличий отобранных штаммов от исходного, депонированного в коллекции. По мнению ряда авторов [5, 6], ПЦР-анализ обеспечивает более полную характеристику исследуемых микроорганизмов. ДНК-фингерпринт штаммов осуществляли в ГосНИИгенетика методом ПЦР с использованием праймеров рибосомальных последовательностей (ribosomal seqúense polymerase chain reaction RS-PCR) и коротких праймеров рибосомальных последовательностей (ribosomal seqúense arbitrare genomic polymerase chain reaction RS/ AG-PCR). Для каждого штамма было сделано три повтора ПЦР. Контроль - культура В-7430 Lactococcus lactis. Условия электрофореза ПЦР: 1,5 %-ный агарозный гель, напряженность электрического поля 5 В/см.
Результаты и обсуждение. Наиболее высокой ни-зинообразующей активностью обладали четыре штамма: Lactococcus lactis subsp. lactis ВКПМ- 7430, Lactococcus lactis subsp. lactis ВКМ-1662, Lactococcus lactis subsp. lactis 1500Т, Lactococcus lactis subsp. lactis 119/05 (табл. 1). Поэтому далее с этими штаммами проводили селекционные работы для повышения низинобразующей активности.
Перед высушиванием культур количество живых клеток штамма 119/05 составляло 1,2109 в 1 см3, штамма 1662 - 3,0 109 в 1 см3, штамма 1500Т - 1,6109 в 1 см3, штамма 7430 - 2,0 109 в 1 см3.
Титр жизнеспособных клеток сразу после лио-фильного высушивания у штамма 119/05 составил
Название оси
Рисунок. Характеристика отобранных штаммов продуцентов низина по антибиотической активности: 1 - до активирования; 2 - после активирования; 3 - активированных штаммов после лиофильного высушивания: □ - 24/48; м - 119/05; □ - 1500Т; - 4591; □ - 7430; ■ - 1662.
0,4-109 в 1 см3, штамма 1662 - 1,0 1 09 в 1 см3, штамма 1500Т - 0,5109 в 1 см3, штамма 7430 - 1.1-109 в 1 см3. После лиофильной сушки их выживаемость была равна соответственно 33,3, 37,5, 31,3 и 50%.
Активированные штаммы синтезировали низин на уровне 4200-5200 МЕ/см3, или 100-130 мкг/см3 (см. рисунок), а также L-молочную кислоту в количестве до 37-40 мг/см3, что служит высоким показателем для промышленных культур [2].
Отобранные культуры продуцентов Lactococcus lactis переданы в коллекцию ВКПМ для комплексной оценки их свойств и хранения с получением следующих номеров: В-1662 - В-8023; 1500Т - В-8024; 119/05 -В-8025и В-2448 - В-8026.
Результаты наших исследований показали, что на основании анализа ПЦР-фрагментов изучаемые штаммы В-8023, В-8024, В-8025, В-8026 можно отличить один от другого, а также от контрольного штамма В-7430. Следовательно, ДНК-фингерпринт с помощью ПЦР можно использовать как специфическую характеристику для их идентификации.
Изученные штаммы чувствительны к антибиотикам, ингибирующим синтез белка и синтез клеточной стенки.
В результате проведённой селекционной работы отобрали высокоактивный штамм-продуцент бакте-риоцина низина Lactococcus lactis БиЬвр. lactis В-8023. Исследование его антибиотических свойств в отношении различных тест-культур показало, что этот штамм
Таблица 1. Антибиотическая активность исследуемых штаммов Ьа&ососсив 1асИв subsp. 1асИв
Темпе- Антибио-
ратура тическая
Штамм-продуцент культи- актив-
вирова- ность, МЕ/см3
ния, 0С
Lactococcus lactis subsp. lactis
24/48 30 1000
Lactococcus lactis subsp. lactis
119/05 30 1600
Lactococcus lactis subsp. lactis
1500Т 30 2200
Lactococcus lactis subsp. lactis
ВКПМ-4591 30 1000
Lactococcus lactis subsp. lactis
ВКПМ- 6793 30 1000
Lactococcus lactis subsp. lactis
ВКПМ- 7430 30 4000
Lactococcus lactis subsp. lactis
ВКМ-1662 30 3500
подавляет рост грамположительных бактерий, включая спорообразующие. Такой спектр действия характерен для низина А, входящего в коммерческий препарат Nisaplin «Aplin & Barrett Ltd» (табл. 2). При этом диаметр зон ингибирования у штамма В-8023 был больше. Кроме того, он незначительно подавлял рост ряда грамотри-цательных бактерий (Alcaligenes faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis).
На основании полученных экспериментальных данных можно предположить, что спектр антибиотического действия зависит от штамм-специфичности культуры Lactococcuslactissubsp. lactis. И, возможно, исследуемый штамм либо образует другой тип изомера низина, либо, наряду с низином, в незначительных количествах синтезирует ещё один бактериоцин [6].
Таким образом, отобранные и идентифицированные штаммы Lactococcus lactis subsp. lactis В-8023, а также В-8024, В-8025, В-8026 могут быть использованы в качестве продуцентов бактериоцинов и молочной кислоты, а их культуральные жидкости обладают пробиотическими и биопротекторными свойствами, что обусловливает возможность применения в качестве компонентов пищевых и биологически активных добавок.
ФГБНУ ВНИИПБТ разработана принципиальная технологическая схема производства комплексного биоконсерванта, содержащего бактериоцины и L-молочную кислоту. На сегодняшний день завершены производственные испытания технологии и разработаны рекомендации по применению биоконсерванта для увеличения сроков хранения различной продукции.
Предложенная технология характеризуется высокими технико-экономическими показателями, обеспечивает комплексную переработку и более полное использование сырья.
Таблица 2. Антимикробный спектр действия штамма Lactococcus lactis subsp. lactis В-8023
Тест-культура Диаметр зон угнетения роста, мм
В-8023 Nisaplin «Aplin & Barrett Ltd»
Bacillus lichinoformis 18,5 18,0
Bacillus mesentericus (шт.1) 19,0 18,0
Bacillus mesentericus (шт.2) 17,5 17,0
Bacillus sporoginesis 19,0 18,5
Bacillus subtilis 22,0 19,0
Bacillus coaculans 22,0 21,0
Micrococcus flavus 23,0 18,0
Escherichia coli 0,0 0,0
Escherichia coli шт.76/1 0,0 0,0
Klebsiella pneumonia 0,0 0,0
Mycobacterium smegmatis 0,0 0,0
Pseudomonas aeruginosa 10,0 0,0
Proteus vulgaris 9,0 0,0
Proteus mirabilis 5,0 0,0
Salmonella tuphimurium 0,0 0,0
Shigella flexneri 0,0 0,0
Staphylococcus aureus 16,5 15,0
Alcaligenes faеcalis 9,5 0,0
Nocardia asteroids 0,0 0,0
Candida utilis 0,0 0,0
Aspergillus niger 0,0 0,0
Выводы. Отобраны и идентифицированы перспективные варианты штаммов Lactococcus lactis БиЬвр. IасП'в В-8023, В-8024, В-8025, В-8026, обладающие высокой продуктивностью по низину (4200-5200 МЕ/см3) и L-молочной кислоте (37-40 мг/см3).
Культуральные жидкости отобранных штаммов обладают широким спектром антибактериального действия и способны ингибировать рост бактериальных тест-культур.
Литература.
1. Сультимова Е.Д., Ботина С.Г., Нетрусов А.И. Выделение и идентификация новых низинообразующих штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis из молока // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т.42. №5. С.505-568.
2. Усовершенствование биотехнологии получения защитно-профилактических препаратов на основе культивирования консорциума кислотообразующих микроорганизмов/Е.В. Куксова, Г.В. Галкина, В.И. Илларионова, Г.С. Волкова, Е.В. Горбатова // Вестник РАСХН. 2005. №8, С. 55-58.
3. Штамм бактерий Lactococcus lactis subsp. lactis ВКПМ-8558, используемый в производстве молочной продукции, и способ получениястартернойкультуры. Пат. 2295563Россия, МПК7С 12N 1/20, AC23C9, ГанинаВ.И., Рожкова Е.В. N2005125605/13. Заявл. 12.08.2005. Опубл. 20.03.2007.
4. Стоянова Л.Г., Левина Н.А. Регуляция синтеза бактериоцина рекомбинантного штамма Lactococcus lactis subsp. lactis F-116 компонентным составом среды // Микробиология. 2006. 75. № 3. С. 171-175.
5. Сультимова Т.Д., Стоянова Л.Г., Ботина С.Г. Скринингбактериоцинпродуцирующих штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis // Тезисы Молодежной школы-конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии». М.: Изд-во Макс-Пресс, 2005. С. 107.
6. Сравнение свойств бактериоцинов некоторых штаммов Lactococcus lactis subsp.lactis /Л.Г. Стоянова, Г.Б. Федорова, Н.С. Егоров, А.И. Нетрусов, Г.С. Катруха//Прикладная биохимия и микробиология. 2007. Т.43. №6. С. 677-684.
IDENTIFICATION AND SELECTION OF LACTOCOCCUS LACTIS CULTURES TO PROTECTIVE AND PREVENTIVE NUTRITIONAL SUPPLEMENTS AND FEEDS
G. S. Volkova, E.V. Kuksova, L.V. Rimareva
All-Russian Research Institute of Food Biotechnology, ul. Samokatnaya, 4b, Moskva, 111033, Russian Federation Summary. The studies were conducted to select and identify the Lactococcus lactis subsp. lactis cultures, possessing wider range of antibacterial action for industrial production of biopreservative based on bacteriocins and L(+)-lactic acid. The researches were conducted with seven strains of Lactococcus lactis subsp. lactis. Four strains with higher nisin-producing activity were allocated. Activated strains synthesize nisin at the level of 4200-5200 ME/cm3 or 100-130 mcg/cm3. The identification of producing cultures (DNA fingerprint of strains by PCR using modified primers of ribosomal sequences) was carried out. It was revealed the difference between the selected cultures and parental strain deposited in the collection. The studied strains were sensitive to antibiotics that inhibited protein synthesis and cell wall synthesis. The selected V-8023 strain of Lactococcus lactis subsp. lactis suppresses the growth of gram-positive bacteria, including spore-forming bacteria (the diameter of zones of growth inhibition was from 17.5 mm to 23.0 mm). The V-8023 strain also suppressed the growth of several gramnegative bacteria - Alcaligenes faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis (the diameter of zones of growth inhibition was from 5.0 mm to 10.0 mm). Based on the experimental results it could be assumed that the spectrum of antibiotic action depended on the strain-specificity of Lactococcus lactis subsp. lactis culture. Probably, V-8023 strain synthesized other type of nisin isomer or synthesized one more bacteriocin in minor amounts along with nisin. Obtained data could be used as a source for the creation of the technological scheme of complex bioconservant production for food and feed products, and various agricultural raw materials. Keywords: strains of lactic bacteria, nisin, lactic acid, bacteriocins, antibiotic action.
Author Details: G. S. Volkova, Cand. Sc. (Tech.), head of laboratory (e-mail: galina.volkova@bk.ru); E.V. Kuksova, Cand. Sc. (Tech.), senior research fellow; L.V. Rimareva, D. Sc. (Tech.), deputy director.
For citation: Volkova G.S., Kuksova E.V., Rimareva L.V. Identification and Selection of Lactococcus lactis Cultures to Protective and Preventive Nutritional Supplements and Feeds. Dostizheniya nauki i tekhnikiAPK. 2016. V.30. No. 8. Pp. 99-101 (in Russ.).
