CC BY
98БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
УДК 573.6.086.835:579.8
Консорциум бактерий как основа создания пробиотических добавок для животноводства
Л. Р. АРИФУЛЛИНА, студент
Московский государственный университет пищевых производств Г. С. ВОЛКОВА, канд. техн. наук
ВНИИ пищевой биотехнологии — филиал ФИЦ питания, биотехнологии и безопасности пищи, Москва
В условиях промышленного производства продуктов животноводства значительно усилилась техногенная и микробиологическая нагрузка на организм сельскохозяйственных животных и птицы. Повышение изменчивости бактерий и вирусов, быстрое развитие их устойчивости к различным антибиотическим веществам, появление среди условно-патогенных микроорганизмов штаммов с выраженной вирулентностью — все эти факторы нарушают саморегуляцию кишечного биоценоза. При этом среди причин отхода молодняка основное место занимают болезни желудочно-кишечного тракта, возбудителями которых является условно-патогенная микрофлора [1].
В области профилактики и лечения кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц перспективны пробиотики — препараты на основе живых культур микроорганизмов, предназначенные для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта, профилактики и лечения заболеваний, связанных с дисбиотическим состоянием. Они, в отличие от антибиотиков, могут применяться длительными курсами, не вызывая побочных действий [2].
Пробиотические штаммы микроорганизмов являются неадгезивными транзисторными представителями микрофлоры кишечника. Пробиотики обладают высокой ферментативной активностью, регулируют и стимулируют пищеварение, а также оказывают проти-
Таблица 1
Оценка антимикробной активности штамма Lactobacillus plantarum ВНИИПБТ 578/25 по отношению к тест-культурам
Тест-организмы Зоны угнетения роста, мм
КЖ с биомассой Фильтрат КЖ
Pseudom. aeruginosa 30,0±3 25,0±3
Staph. aureus 25,0±3 17,0±3
Bac. mesentericus (4 шт.) 25,0±3 22,5±3
Bac. subtilis (3 шт.) 25,0±3 21,0±3
Bac. licheniformis 30,0±3 15,0±3
Bac. sphaericus 30,0±3 10,0±3
Proteus vulgaricus 25,0±3 23,5±3
Klebsiella pneumoniae 26,0±3 23,5±3
Salmonella typhimurium 26,5±3 25,0±3
Shigella flexneri 27,5±3 25,0±3
Echerichia coli (3 шт.) 27,5±3 25,0±3
Mycobacter smegmatis 20 (NSDO) 27,5±3 25,0±3
Nocardia asteroides (2 шт.) 30,0±3 30,0±3
воаллергенное, антитоксическое действие и повышают неспецифическую резистентность макроорганизма. Антагонизм в отношении широкого круга патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и самостоятельная элиминация из желудочно-кишечного тракта делают конструирование лечебно-профилактических препаратов из пробиотических бацилл особенно перспективным [3].
Многие бактерии, в том числе молочнокислые и пропионовокислые, синтезируют антибиотические вещества белково-пептидной природы, убивающие родственные виды или штаммы, или тормозящие их рост, или имеющие более широкий спектр антибактериального действия. Эти вещества с весьма специфическим действием получили название бактериоцинов. В настоящее время изучаются пути и способы направленного синтеза бактериоцинов с целью получения биологическим путем различных модификаций уже известных бактериоцинов, но с более ценными свойствами, или же новых природных сбалансированных бактериоциногенных комплексов, безопасных для использования в качестве биоконсервантов.
Цель работы — изучение процессов биосинтеза штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий для создания консорциума микроорганизмов с наибольшей выработкой бактериоцинов [4].
Экспериментальная часть. Выбор микроорганизмов, входящих в консорциум, основан на уже имеющихся экспериментальных данных динамики роста и процесса кислотообразования бактериями разных родов — Lactobacillus и Propionibacterium, которые показывают, что Lactobacillus обладают высокой скоростью роста, а кислотообразование проходит интенсивнее и за более короткий срок. Поэтому были выбраны следующие штаммы бактерий:
♦ Lactobacillus plantarum ВНИИПБТ 578/25;
♦ Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii В-103/27.
Это неподвижные палочки, грамположительные,
неспорообразующие, аэротолерантные, растущие при рН 5,0—7,2, с оптимальной температурой роста 32...45 °С.
На первом этапе исследований проводили оценку антимикробной активности штамма Lactobacillus plantarum ВНИИПБТ 578/25 по отношению к тест-культурам (табл. 1). Для засева чашек Петри использовали суточные тест-культуры бактерий и дрожжей, а также применяли 5-суточные культуры грибов в виде суспензии клеток в физиологическом растворе
Таблица 2
Антимикробный спектр действия штамма L. plantarum 578125 и консорциума L. plantarum 578125 + Pr. freudenreichii subsp. shermanii В-103127
Тест культуры Зоны угнетения роста, мм
Lactobacillus plantarum 578/25 (фильтрат) Lactobacillus plantarum 578/25 (КЖ) L. plantarum + Pr. freudenreichii subsp. shermanii (фильтрат)
Bacillus lichinoformis 15,0 20,0 30,0
B. mesentericus (шт. 1) 22,5 25,0 26,2
B. mesentericus (шт. 2) 24,0 25,0 25,5
B. sporoginesis 6,0 20,0 28,0
Bacillus subtilis 25,0 25,0 26,0
Escherichia coli 25,0 25,0 27,5
Escherichia coli шт. 76/1 18,0 20,5 23,0
Klebsiella pneumonia 23,5 26,0 29,0
Mycobacterium smegmatis 24,0 27,7 31,0
Pseudomonas aeruginosa 24,0 25,5 30,0
Proteus vulgaris 23,5 24,0 27,0
Proteus mirabilis 18,0 20,0 22,0
Salmonella tuphimurium 25,0 26,5 28,7
Shigella flexneri 25,0 27,5 28,0
Staphylococcus aureus 19,8 22,0 24,0
Nocardia asteroides 30,0 30,0 31,5
Candida utilis 15,0 16,5 18,0
Aspergillus niger 10,0 20,0 25,0
(110 клеток/см3 (по бактериальному стандарту мутности), из расчета 0,1 см3 суспензии на чашку Петри).
На основании проведенной экспериментальной работы сделан вывод о возможности использования в качестве защитно-профилактических препаратов, как биомассы бактерий отобранных штаммов, так и отдельно культуральной жидкости.
Следующий этап работы состоял в изучении антимикробного действия культуральной жидкости селекционированных культур, а также сконструированных консорциумов микроорганизмов на тест-культуры.
Результаты этого этапа приведены на примере куль-туральной жидкости с биомассой и фильтрата культу-ральной жидкости (КЖ) L. plantarum ВНИИПБТ 578/25, а также фильтрата культуральной жидкости консорциума штаммов L. plantarum ВНИИПБТ 578/25 / Pr. freudenreichii subsp. shermanii В-103/27 (табл. 2).
Установлено, что вещества, выделяемые клетками культур L. plantarum 578/25 и Pr. freudenreichii subsp. shermanii В-103/27 в культуральную жидкость, обладают выраженными антимикробными свойствами, особенно в отношении бактериальных форм микроорганизмов, а также интенсивно угнетают рост дрожжей и плесневых грибов, в том числе Nocardia asteroides, возбудителя порчи овощей и фруктов. При этом выявлено, что препарат фильтрата культуральной жидкости, полученный при совместном культивировании культур L. plantarum ВНИИПБТ 578/25 и Pr. freudenreichii subsp. shermanii В-103/27, в 1,3—2,0 раза был эффективнее, чем препарат из фильтрата культуральной жидкости и культуральной жидкости с биомассой, полученных после ферментации L. plantarum ВНИИПБТ 578/25.
Это говорит о том, что культуры консорциума экстра-целлюларно выделяют в среду при своем росте отличные друг от друга бактерицидные комплексы, которые при совместном использовании против нежелательной микрофлоры действуют синергически. По-видимому, один из видов бактериоцинов действует на мембранные оболочки клеток, нарушая их проницаемость, а другой вид — на репродуктивные механизмы клеток, нарушая их генный аппарат.
Далее исследовали влияние качества посевного материала культур L. plantarum 578/25 и Pr. shermanii В-103/27, взятых на различных стадиях развития.
Для этого в динамике было изучено развитие культур на глюкозной стандартной среде (просчитывалось количество клеток в камере Горяева и нарастание кислотности среды). Полученные данные представлены в табл. 3.
Из данных табл. 3 видно, что молочнокислое и про-пионовокислое брожение имеет явный двухфазный характер, то есть вначале идет интенсивное размножение клеток культур, а активное кислотообразование приходится на фазу замедления роста культуры и переход в стационарную фазу развития.
Из этих данных понятнее становится эффект совместного культивирования бактерий. Молочнокислые бактерии, имея в два раза выше скорость роста, быстрее потребляют из среды сахара, превращая их в лак-тат, который, в свою очередь, быстрее и лучше пропи-оновокислыми бактериями сбраживаются до пропио-новой кислоты.
Сопоставление динамики роста и процесса кисло-тообразования бактериями разных родов — Lactobacillus и Propionibacterium — показало, что Lactobacillus
Таблица 3
Динамика развития культур L. plantarum 578/25 и Pr. shermanii В-103/27
Время культивирования, час L. plantarum 578/25 Pr. shermanii В-103/27
Число бактерий, х106/см3 Кислотность, см3 0,1 н NaOH/см3 среды Число бактерий, х106/ см3 Кислотность, см3 0,1 н NaOH/см3 среды
0 3,0 Следы 1,0 —
12 16,0 0,8 3,2 0,4
24 40,0 2,3 15,8 1,0
36 80,3 3,2 25,6 1,8
48 101,5 4,2 40,1 2,8
72 100,0 4,2 65,0 2,8
96 98,6 4,0 70,6 3,2
обладают высокой скоростью роста, а кислотообра-зование происходит более интенсивно и за короткий срок. Изучение роста пропионовокислых бактерий на различных источниках углерода и энергии показало, что рост бактерий и выделение пропионовой кислоты происходит быстрее, когда культивирование ведется на среде с лактатом натрия или кальция. При этом продолжительность ферментационного цикла заметно сокращается, а количество накопившейся биомассы бактерий и кислоты в среде значительно выше, чем при культивировании продуцента на других субстратах.
В последующей серии опытов изучалось совместное культивирование молочнокислых и пропионово-кислых бактерий, результаты которого представлены в табл. 4. Процесс ферментации проводили в периодическом режиме в анаэробных условиях на среде с творожной сывороткой при температуре 40 °С и рН 6,0-6,5.
Из экспериментальных данных, представленных в табл. 4, видно, что совместное культивирование двух разных в таксономическом отношении видов бактерий, внесенных в среду в определенной временной последовательности, приводит к сокращению ферментационного цикла (на двое суток) и количественному увеличению выхода кислот (на 55,4%) по сравнению с контролем (культивирование одних пропионовокис-лых бактерий).
Поэтому при получении кормовых добавок широкого спектра целесообразно проводить совместное культивирование молочнокислых и пропионовокис-лых бактерий. По своим физиолого-биохимическим данным молочнокислые бактерии имеют более высокие адаптивные свойства, чем пропионовокислые бактерии, более широкий спектр углеводов сбраживается ими до молочной кислоты [5].
При обработке экспериментальных данных по совместному культивированию монокультур и консорциума подтверждена необходимость стадии подбора бактериальных культур для создания комплексных поли-штаммовых добавок с пробиотическими свойствами для повышения общей биосинтетической активности консорциума.
Результаты исследований являются предварительными и будут дополнены новыми экспериментальными данными при последующей работе.
Таблица 4
изменение кислотности при совместном культивировании
Культура Цикл культивирования, сутки
Pr. shermanii В-103/27 7,0
Pr. shermanii В-103/27, L. plantarum 578/25 6,0
Pr. shermanii В-103/27, L. plantarum 578/25 (внесена через 1 сутки культивирования) 6,5
L. plantarum 578/25, Pr. shermanii В-103/27 (внесена через 1 сутки культивирования) 5,0
Выводы
1. Получение защитно-профилактических добавок антимикробного действия на основе биосинтеза кислотообразующих бактерий является перспективным.
2. На основе скриннинга продуцентов отобраны высокоактивные штаммы кислотообразующих бактерий и их ассоциации.
3. Изучена антимикробная активность пробиотических штаммов. Подтверждено предположение о выделении культурами в среду антибиотических веществ и антиокислительных ферментных комплексов, обладающих антимикробными свойствами.
4. Установлено, что молочнокислое и пропионовокис-лое брожение имеет явный двухфазных характер. Молочнокислые бактерии, имея в два раза выше скорость роста, быстрее потребляют из среды сахара, превращая их в лактат, который, в свою очередь, быстрее и лучше пропионовокислыми бактериями сбраживается до пропионовой кислоты.
5. Совместное культивирование молочнокислых и пропионовокислых бактерий, внесенных в среду в определенной временной последовательности, приводит к сокращению ферментационного цикла (на двое суток) и количественному увеличению выхода кислот (на 55,4%) по сравнению с контролем (культивирование одних пропионовокислых бактерий).
Научно-исследовательская (поисково-аналитическая) работа по подготовке рукописи проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках Программы Фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013-2020 годы (тема № 0529-2016-0047)
Литература
1. Исхакова, А. Р. Эффективность использования пробио-тиков при выращивании гусят-бройлеров / А. Р. Исхакова // Уфа: Российский электронный научный журнал, 2016. — № 1 (19). — С. 230-238.
2. Сверчкова, Н. Пробиотические препараты для ветеринарии и кормопроизводства / Н. Сверчкова [и др.] // Беларусь: Наука и инновации, 2016. — № 159 (5). — С. 38-39.
3. Иванова, А. Б. Фармакологическая характеристика про-биотиков на основе Bacillus subtilis и эффективность их применения в птицеводстве: дис. ... д-ра вет. наук / А. Б. Иванова. — СПб., 2008. — С. 3.
4. Нурушев, М. Ж. О проекте создания природного консерванта пищевых продуктов на основе бактериоцинов молочнокислых бактерий в Казахстане / М. Ж. Нурушев [и др.] // Астана: Вестник ЕНУ им. Л. Н. Гумилева, 2011. — № 4. — С. 175-180.
5. Волкова, Г. С. Разработка и внедрение биотехнологии обогащенных белковых кормовых продуктов / Г. С. Волкова, Е. В. Куксова // М.: Пищевая промышленность, 2012. — № 7. — С. 12-13.
References
1. Ishakova, A.R. Jeffektivnost' ispol'zovanija probiotikov pri vyrashhivanii gusjat-brojlerov [Efficient use of probioyics in gosling broiler breeding]. Ufa: Rossijskij jelektronnyj nauchnyj zhurnal Publ., 2016, no. 1 (19), pp. 230-238.
2. Sverchkova, N. Probioticheskie preparaty dlja veterinarii i kor-moproizvodstva [Probiotic preparations for veterinary and feed production]. Belarus': Nauka i innovacii Publ., 2016, no. № 159 (5), pp. 38-39.
3. Ivanova, A.B. Farmakologicheskaja harakteristika probiotikov na osnove Bacillus subtilis i jeffektivnost' ih primenenija v pticevodstve: dis. d-ra vet. nauk [Pharmacological characteristics of probiotics based on Bacillus subtilis and their efficacy in poultry. SPb, 2008, p. 3.
4. Nurushev, M.Zh. O proekte sozdanija prirodnogo konservanta pishhevyh produktov na osnove bakteriocinov molochnokislyh bakterij v Kazahstane [About the project of creating a natural food preservative based on bacteriocins of lactic acid bacteria in Kazakhstan]. Astana: Vestnik ENU im. L.N. Gumileva Publ., 2011, no. 4, pp. 175-180.
5. Volkova, G.S. Razrabotka i vnedrenie biotehnologii obogash-hennyh belkovyh kormovyh produktov [Developing and Implementing Biotechnology of Protein Enriched Feedstuff]. Moscow, Pishhevaja promyshlennost' Publ., 2012, no. 7, pp. 12-13.
фШ^:. - :
Ш^У^ЗНИЙиЕййЗЛ V1 1
SOLIDS
RUSSIA
i 29-30 мая 2018 Экспоцентр Москва
Конференция и выставка по технологиям и транспортировке сыпучих материалов
www.solids-russia.ru
Консорциум бактерий как основа создания пробиотических добавок для животноводства
Ключевые слова
бактериоцины; животноводство; кишечная микрофлора; кормовая добавка; пробиотики; пробиотическая кормовая добавка.
Реферат
В настоящее время одним из условий интенсификации животноводства в России является применение концепции рационального кормления животных, предусматривающей применение полноценных кормов, обеспечивающих оптимальное использование генетического потенциала продуктивности животных и получение от них качественной продукции, благополучной в ветеринарно-санитарном отношении. В данной статье рассмотрены данные о набирающих популярность биологических препаратах для животных — пробиотических добавках к кормам с антибиотическими веществами белково-пептидной природы — бактериоцинами. В мире изучаются пути и способы направленного синтеза бактериоцинов с целью получения биологическим путем различных модификаций уже известных бактериоцинов, но с более ценными свойствами, или же новых природных сбалансированных бактериоциногенных комплексов, безопасных для использования в качестве биоконсервантов. Цель работы — конструирование консорциума молочнокислых и пропионово-кислых бактерий с наибольшей выработкой бактериоцинов для производства добавок кормового назначения. Работы выполнялись в ВНИИПБТ — филиале ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии». В работе изучена антимикробная активность выбранных пробиотических штаммов, динамика развития культур Lactobacillus plantarum 578/25 и Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii ВКМ В-103/27, исследованы целесообразность и преимущества совместного культивирования посевного материала культур Lactobacillus plantarum 578/25 и Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii ВКМ В-103/27 наряду с их одиночным культивированием. При обработке экспериментальных данных по совместному культивированию монокультур и консорциума подтверждена необходимость стадии подбора бактериальных культур для создания комплексных полиштаммовых добавок с пробиотическими свойствами для повышения общей биосинтетической активности консорциума. Результаты исследований являются предварительными и будут дополнены новыми экспериментальными данными при последующей работе.
Авторы
Арифуллина Лилия Равилевна, студент Московский государственный университет пищевых производств,
125080, Москва, Волоколамское ш., д. 11, jedliliya@gmail.com Волкова Галина Сергеевна, канд. техн. наук ВНИИ пищевой биотехнологии —
филиал ФИЦ питания, биотехнологии и безопасности пищи, 111033, Москва, ул. Самокатная, д. 4б, galina.volkova@bk.ru
Consortium of Bacteria as a Basis for Creating Probiotic Additives for Livestock Production
Key words
animal; bacteriocins; feed supplement; microflora of intestine; probiotics; probiotic feed additive.
Abstract
Currently, one of the conditions for the intensification of animal husbandry in Russia is the application of the concept of rational feeding of animals that require the application of complete feed ensuring optimum utilization of the genetic potential productivity of animals and to receive their quality products, safe in veterinary and sanitary relation. This article discusses information about the growing popularity of biological drugs for animal — probiotic supplementation to animal feeds with antibiotic substances of protein nature peptide — bacteriocins. Currently studying ways and means of directed synthesis of bacteriocins, with the aim of obtaining biologically different modifications of known bacteriocins, but with more valuable properties, or new natural balanced bacteriocinogenic complexes, safe to use as preservatives. The aim of this work is the design of a consortium of lactic and propionic acid bacteria with the highest production of bacteriocins production of additives for feed purposes. The work was carried out in VNIIPBT. In this study, we investigated antimicrobial activity of the selected probiotic strains, the dynamics of crop development Lactobacillus plantarum 578/25 and Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii VKM 103/27 investigated the feasibility and benefits of joint cultivation of microorganisms Lactobacillus 578/25 plantarum and Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii VKM 103/27 along with their single cultivation. The experimental data on the joint cultivation of monocultures and the consortium confirmed the need for the stage of selection of bacterial cultures to create complex additives with probiotic properties, to improve the overall biosynthetic activity of the consortium. The research results are preliminary and will be supplemented with new experimental data in the subsequent work.
Authors
Arifullina Lilija Ravilevna, Student Moscow state university of food production, 11 Volokolamskoe sh., Moscow, 125080, Russia, jedliliya@gmail.com
Volkova Galina Sergeevna, Candidate of Technical Sciences The All-Russian Research Institute of Food Biotechnology — branch of Federal State Budgetary Institution of Science of the Federal Research Center of Food and Biotechnology and Food Safety,
4B Samokatnaya St., Moscow, 111033, Russia, galina.volkova@bk.ru
