Изучение производственных свойств отдельных штаммов молочнокислых бактерий для создания пробиотиков Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

ТЕМА НОМЕРА

БИОТЕХНОЛОГИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

УДК 637:1/.3(045) DOI 10.24411/0235-2486-2020-10024

Изучение производственных свойств отдельных штаммов молочнокислых бактерий для создания пробиотиков

Г.С. Волкова*, д-р техн. наук; Е.В. Куксова, канд. техн. наук; Е.М. Серба, д-р биол. наук, чл.-корр. РАН ВНИИ пищевой биотехнологии - филиал ФИЦ питания, биотехнологии и безопасности пищи, Москва

Дата поступления в редакцию 31.01.2020 * galina.volkova@bk.ru

Дата принятия в печать 27.03.2020 © Волкова Г.С., Куксова Е.В., Серба Е.М., 2020

Реферат

В статье приведены результаты экспериментальных исследований по отбору и селекции новых штаммов пробиотических бактерий с повышенным уровнем синтеза органических кислот и высокой скоростью роста для использования в различных технологиях пищевой промышленности в качестве пробиотиков. Проанализированы 19 штаммов молочнокислых бактерий по уровню накопления органических кислот, проведена селекционная работа с наиболее перспективными штаммами. Установлено, что при длительных пассажах коллекционные штаммы остаются стабильными по свойствам кислотообразования. Штаммы охарактеризованы по культурально-морфологическим признакам и биохимическим свойствам. Отобраны 5 штаммов молочнокислых бактерий с повышенным уровнем синтеза органических кислот и высокой скоростью роста, являющиеся высокопродуктивными по накоплению биомассы: Lactobacillus acidophilus ВКМ 1660, Lactobacillus acidophilus var. coccoideus ВНИИПБТ М-94, Lactobacillus plantarum ВКМ 578/26, Lactobacillus casei subsp. rhamnosus, Lactococcus lactis subsp. lactis 1500/12. Получены экспериментальные данные биосинтетической способности отобранных штаммов в лабораторных условиях. Установлены уровни максимального накопления молочной кислоты до 4,22 %, удельные скорости роста 0,32-0,84 ч-1, максимальная плотность популяции до 2,2х109КОЕ/см3. Показано, что наибольшее кислотообразование культур достигается при внесении 23-30 % посевного материала. Штаммы молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus var. coccoideus М-94/2 и Lactobacillus casei subsp. rhamnosus L-2 депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина под номерами ВКМ В-3403D и ВКМ В-3402D соответственно (свидетельства о депонировании 119-2-02.1-2118 и 119-2-02.1-2117). Производственные характеристики изученных штаммов могут быть использованы технологами пищевых производств для создания новых продуктов питания с пробиотическими свойствами.

Ключевые слова

пробиотики, молочнокислые бактерии, органические кислоты, плотность популяции Для цитирования

Волкова Г.С., Куксова Е.В., Серба Е.М. (2020) Изучение производственных свойств отдельных штаммов молочнокислых бактерий для создания пробиотиков // Пищевая промышленность. 2020. № 3. С. 8-11.

Study of production properties of individual strains of lactic acid bacteria for probiotics

G.S. Volkova*, Doctor of Technical Sciences; E.V. Kuksova, Candidate of Technical Sciences; E.M. Serba, Doctor of Biological Sciences, Corresponding Member of RAS

The All-Russian Research Institute of Food Biotechnology - Branch of the Federal Research Center for Nutrition, Biotechnology and Food Safety, Moscow

Received: January 31, 2020 * galina.volkova@bk.ru

Accepted: March 27, 2020 © Volkova G.S., Kuksova E.V., Serba E.M., 2020

Abstract

The article presents the results of experimental studies on selection and selection of new strains of probiotic bacteria with increased level of organic acid synthesis and high growth rate for use in various food industry technologies as probiotics. 19 strains of lactic acid bacteria were analyzed by the level of accumulation of organic acids, selection work with the most promising strains was carried out. It has been found that in long passages, collection strains remain stable in acid formation properties. Strains are characterized by cultural-morphological signs and biochemical properties. 5 strains of lactic acid bacteria with increased level of synthesis of organic acids and high growth rate were selected, as well as being highly productive in biomass accumulation: Lactobacillus acidophilus BCM 1660, Lactobacillus acidophilus var. coscoideus VNIIPBT M-94, Lactobacillus plantarum VCM 578/26, Lactobacillus casei subsp. rhamnosus, Lactococcus lactis subsp. lactis 1500/12. Experimental data of biosynthetic capacity of selected strains under laboratory conditions are obtained. Levels of maximum accumulation of lactic acid up to 4.22 %, specific growth rates 0.32-0.84 h-1, maximum population density - up to 2.2x109 CFU/cm3 are established. It is shown that the greatest acid formation of cultures is achieved with application of 23-30 % of seed material. Lactic acid bacteria strains Lactobacillus acidophillus var. coccoideus М-94/2u Lactobacillus casei subsp. rhamnosus L-2 deposited in the All-Russian Collection of Microorganisms (VCM) of the Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms named after G.K. Skryabin under the numbers: VCM B-3403D and VCM B-3402D respectively. (Deposit certificates 119-2-02.1-2118 and 119-2-02.1-2117). Production characteristics of studied strains can be used by food production technologists to create new food products with probiotic properties.

Key words

probiotics, lactic acid bacteria, organic acids, population density For citation

Volkova G.S., Kuksova E.V., Serba E.M. (2020) Study of production properties of individual strains of lactic acid bacteria for probiotics // Food processing industry = Pischevaya promyshlennost'. 2020. No. 3. P. 8-11.

FOOD BiOTECHNOLOGY

Введение. В настоящее время устойчиво растет интерес к изучению молочнокислых бактерий. В большей степени это связано с развитием молочной промышленности в мире вообще и в России в частности и, как следствие этого, с производством новых кисломолочных продуктов, а также с поиском новых штаммов молочнокислых бактерий, пригодных для использования в составе заквасок [1-3].

Молочные продукты являются важнейшим компонентом в рационе питания человека. На их долю приходится до 20 % удовлетворения потребности человека в белке и до 30% в жире. Молочнокислые бактерии выделяют из различных источников: из кисломолочных продуктов, частей растений, в частности цветов, а также с поверхности ягод, овощей и фруктов. Однако штаммы молочнокислых бактерий, выделенные из природных источников, отличаются по стабильности проявляемых свойств. Ценными считаются штаммы, длительно сохраняющие биохимическую активность, зависящую не только от внешних факторов (состава питательной среды, в частности молока, температуры и т. д.), но и от соотношения между биохимически активными и неактивными клетками в популяциях микроорганизмов, что определяет жизнеспособность культуры, ее практическую ценность [4-6].

Актуальным является эффективное проведение всех этапов выделения и идентификации штаммов молочнокислых микроорганизмов с последующим использованием их в составе заквасок для производства кисломолочной продукции.

Цель исследования - изучение биологических особенностей и важнейших производственно-ценных свойств чистых культур молочнокислых бактерий с целью повышения эффективности их использования в качестве пробиотиков.

Материалы и методы. Объектами исследований служили штаммы-продуценты органических кислот родов Lactobacillus и Lactococcus (19 штаммов) из коллекции микроорганизмов ВНИИ пищевой биотехнологии.

В качестве субстрата для молочнокислого брожения использовалась питательная среда MRS-1. Условия культивирования - анаэробно, оптимум рН 6,5-6,8, температура культивирования 28-48 °С. Культивирование продуцентов проводили в колбах объемом 750 см3 со 100 см3 питательной среды.

В процессе ферментации производили нейтрализацию кислот раствором 0,1 н NaOH.

Изучение морфологических, физиологических, биохимических и технологических свойств исследуемых штаммов проводили стандартными методами: определение титруемой кислотности - по ГОСТ 3624, определение биомассы молочнокислых бактерий с использованием колориметра КФК-2 нефелометрически, количество биомассы в пробе определяли по калибровочной кривой с учетом разведений, микроскопирование препаратов -по ГОст 9225, определение количества микроорганизмов в посевном материале и культуральной жидкости проводили методом предельных разведений, определение активной кислотности по-тенциометрически на приборе «Экотест 120».

Результаты и обсуждение. Основное требование, предъявляемое к продуценту, - возможно больший выход органических кислот к массе сброженного углевода и высокая скорость ферментации. Результаты исследований по отбору продуцентов приведены в табл. 1.

Из табл. 1 следует, что наиболее активно образовывали молочную кислоту штаммы Lactobacillus acidophilus ВКМ 1660, Lactobacillus acidophilus var. coocoideus ВНИИПБТ М-94, Lactobacillus plantarum ВКМ 578/26, Lactobacillus casei subsp. rhamnosus - у них выход молочной кислоты от использо-

ванной лактозы был равен или выше 50 %.

При определении свойств сбраживания различных углеводов изучаемыми культурами полученные результаты совпадали с данными определителя Берджи и других авторов (Сорокин и др., 1973; Гриневич, 1981; Банникова и др., 1987; Базаров, 1979; Банникова, 1975). Для более детального изучения имеющихся штаммов нами проведено определение морфологических, культу-ральных и физиологических свойств.

По литературным данным известно, что природные молочнокислые бактерии уступают по своей первоначальной биологической активности специально селекционированным штаммам молочнокислых бактерий. Однако они быстрее адаптируются к условиям брожения в среде с высоким осмотическим давлением.

Проведена селекционная работа с отобранными штаммами-продуцентами для повышения их кислотообразующей способности. Использовали метод ступенчатой селекции на средах с высокими концентрациями молочной кислоты, отобраны активные варианты Lactobacillus acidophilus var. co€coideus ВНИИПБТ М-94/2 и Lactobacillus casei subsp. rhamnosus L-2. С этими культурами были проведены более детальные эксперименты по биосинтезу молочной кислоты. Изучен процесс накопления молочной кислоты отобранными штаммами бактерий. Результаты представлены на рис. 1 и в табл. 2.

Таблица 1

Характеристика штаммов-продуцентов по кислотообразованию

Штамм-продуцент T, °с Выход кислот %

Lactobacillus acidophilus ВКМ 1660 (Т) 48 50,4

L. acidophilus var. co^oi'deus ВНИИПБТ М-94 48 50,0

Lactobacillus brevis ВНИИПБТ К-1 37 43,8

Lactobacillus casei subsp. rhamnosus 37 52,0

Lactobacillus delbrueckii «ВД» 48 45,0

Lactobacillus delbrueckii ВНИИПБТ-52 48 30,0

Lactobacillus delbrueckii ВКМ 1596 (Т) 48 30,0

L. delbrueckii subsp. bulgaricus ВКМ 1923 40 49,0

L. delbrueckii subsp. bulgaricus ВКМ 1924 45 49,5

Lactobacillus delbrueckii ВКМ 1954 48 34,5

Lactobacillus helveticus ВКМ 842 40 48,5

Lactobacillus helveticus ВКМ 1147 40 48,8

Lactobacillus plantarum ВНИИПБТ314 37 45,0

Lactobacillus plantarum ВКМ 578/26 35 50,0

Lactococcus lactis subsp. lactis 24/48 30 30,5

Lactococcus lactis subsp. lactis 119/05 30 33,0

Lactococcus lactis subsp. lactis 1500/12 30 36,5

Lactococcus lactis subsp. lactis ВКПМ-4591 28 35,0

Lactococcus lactis subsp. lactis ВКПМ- 6793 28 33,7

БИОТЕХНОЛОГИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

ТЕМА НОМЕРА

° 5 Î

о о

2 5

Ф [Ц S (и X Ci

4 Я 12 16 20 24 28 32 Время культивирования, ч

36

5 3

Ж *

Is

К g"

и

Ç 1

-Lactobacillus acidophilus BKM 1660

■ Lactobacillus acidophilus var. coccoideus ВНИИПБТ M-94

■ Lactobacillus casei subsp. rhamnosus

■ Lactobacillus plantarum BKM 578/26

4 8 12 16 20 24 2Я 32 36

Время культивирования, ч

-Lactococcus lactis subsp. lactis 24/48 -Lactococcus lactis subsp. lactis 1500/12

Рис. 1. Динамика накопления молочной кислоты штаммами молочнокислых бактерий -палочковидные формы (А) и кокковые формы (Б)

Б

А

Таблица 2

Кинетические показатели роста отобранных штаммов молочнокислых бактерий и образование молочной кислоты на 36 ч роста

Штамм Удельная скорость роста, ч-1 Время выхода популяции в стационарную фазу, ч Количество молочной кислоты, г/л

L. acidophilus ВКМ 1660 0,32±0,10 18,2±2,3 29,0±1,4

L. acidophilus var. coŒoideus М-94 0,39±0,10 17,5±2,1 31,5±1,9

L. casei subsp. rhamnosus 0,45±0,11 21,2±2,1 42,2±2,1

L. plantarum ВКМ 578/26 0,37±0,10 22,7±2,2 35,5±1,8

Lact. lactis subsp. lactis 1500/12 0,84±0,14 20,7±1,3 36,5±1,8

Таблица 3

Влияние концентрации посевного материала на накопление молочной кислоты штаммом Lactobacillus acidophilus var. co«oideus М-94

Концентрация посевного материала, % Количество молочной кислоты, г/л

Время культивирования, ч

24 48 36

5 2,0±0,1 15,2±0,7 22,0±0,8

10 5,4±0,2 16.6±0,7 25,2±1,0

30 8,0±0,3 20,6±0,8 21,0±0,7 30,5±1,5

50 4,6±0,2 14,4±0,7 27,3±1,0

2,5

0,5

■ ■ ■

Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus casei Lactobacillus Lactococcus lactis

acidophilus BKM acidophilus subsp. rhamnosus plantarum BKM subsp. lactis

1660 var. coccoideus 578/26 1500/12 ВНИИПБТ M-94

Рис. 2. Максимальная плотность популяции, млрд КОЕ/см3

Проведенные эксперименты показали, что отобранные штаммы хорошо растут и накапливают до 42,2 г / л молочной кислоты при условии ежедневной подтитровки раствором 0,1н NaOH. Без подтитровки рост молочнокислых бактерий и кислотообразование замедляются при накоплении 2,0% молочной кислоты. Результаты экспериментов по определению кинетических показателей роста и подбору концентрации посевного материала для максимального накопления биомассы отобранных штаммов приведены в табл. 2, 3 и рис. 2.

Из данных табл. 3 следует, что наибольшее кислотообразование культуры достигается при внесении 20-30 % посевного материала.

Произведена передача штаммов в ВКМ для комплексной оценки их свойств и последующего хранения. Были оформлены официальные паспорта на штаммы с подробными характеристиками, и информация о штаммах включена в каталог штаммов ВКМ. Штаммы молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus var. coacoideus М-94/2 и Lactobacillus casei subsp. rhamnosus L-2 депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина под номерами ВКМ B-3403D и ВКМ В-3402D соответственно (свидетельства о депонировании 119-2-02.1-2118 и 119-2-02.1-2117).

В результате экспериментальных исследований отобраны и селекционированы 5 штаммов пробиотических бактерий с повышенным уровнем синтеза органических кислот и высокой скоростью роста для использования в различных технологиях пищевой промышленности в качестве пробиотиков.

Выводы. 1. Проанализирована имеющаяся коллекция микроорганизмов по уровню накопления органических кислот, проведена селекционная работа с наиболее перспективными штаммами. Установлено, что при длительных пассажах коллекционные штаммы остаются стабильными по свойствам кислотообразования. Внесены уточнения в паспорта по характеристикам культурально-морфологических и биохимических свойств.

2. Отобраны 5 штаммов молочнокислых бактерий с повышенным уровнем синтеза органических кислот и высокой скоростью роста, являющиеся высокопродуктивными по накоплению биомассы.

FOOD BiOTEcHNOLOGY

3. Получены экспериментальные данные биосинтетической способности отобранных штаммов в лабораторных условиях. Установлены уровни максимального накопления молочной кислоты до 4,22 %, удельные скорости роста 0,32-0,84 ч-1, максимальная плотность популяции до 2,2хЮ9КОЕ/ см3.

4. Штаммы молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus var. co€coideus М-94/2 и Lactobacillus casei subsp. rhamnosus L-2 депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина под номерами ВКМ В-34С^ и ВКМ В-34С^ соответственно (свидетельства о депонировании 119-2-02.1-2118 и 119-2-02.1-2117).

Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2019-2021 гг. (тема № 0529-2019-0066).

ЛИТЕРАТУРА

1. Рожкова, И.В. Экспериментальный скрининг функционального компонента для кефирного продукта/ И. В. Рожкова, Н. Б. Гаврилова // Вестник Алтайской науки. - 2015. - № 1. - С. 474-479.

2. Шурхно, Р. А. Скрининг природных штаммов молочнокислых бактерий и их таксономическая идентификация/Р. А. Шурхно, С. Г. Вологин, Ф. С. Гибадуллина [и др.] // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - № 2-1.

3. Крумликов, В.Ю. Исследование антибиотической резистентности, культураль-ных и морфологических свойств микроорганизмов, выделенных из национальных казахских напитков // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2016. - № 9. -С. 31-35.

4. Крумликов, В.Ю. Изучение органолеп-тических и физико-химических свойств,

анализ хранимоспособности закваски прямого внесения // Научные исследования: от теории к практике: Материалы IX Международной научно-практической конференции. - Чебоксары: ЦНС «Интерактив плюс», 2016. - № 3 (9). - С. 138-139. ISSN 2413-3957.

5. Грунская, В.А. Подбор микрофлоры и определение состава закваски для ферментированных сывороточных напитков функционального назначения/ В.А. Грунская, Д. С. Габриелян, Е. Ю. Гусева // Научное обеспечение - сельскохозяйственному производству. Том 2. Инженерные науки: сборник трудов ВГМХА. - Вологда-Молочное: ИЦ ВГМХА, 2010. - С. 13-17.

6. Харченко, Н.В. Новые подходы для выделения штаммов бифидобактерий, их молекулярная диагностика и оценка про-биотического потенциала/ Н. В. Харченко, Т. А. Чердынцева, А. И. Нетрусов // Микробиология. - 2015. - Т. 84. - № 3. -С. 1-8.

REFERENCES

1. Rozhkova IV, G a v r i L o v a NB. EksperimentaL'nyj skrining funkcionaL'nogo komponenta dLya kefirnogo produkta [Experimental screening of functional component for kefir product]. Vestnik Altajskoj nauki [Messenger of the Altai science]. 2015. No. 1. P. 474-479 (In Russ.).

2. Shurhno RA, VoLogin SG, GibaduLLi-na FS, Tagirov MSh. Skrining prirodnyh shtammov moLochnokisLyh bakterij i ih taksonomicheskaya identifikaciya [Screening of naturaL strains of Lactic acid bacteria and their taxonomic identification]. Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya [Contemporary Science and Education Issues]. 2015. No. 2-1 (In Russ.).

3. KrumLikov V Yu. IssLedovanie antibioticheskoj rezistentnosti, kuL'turaL'nyh i morfoLogicheskih svojstv mikroorganizmov,

vydelennyh iz nacional'nyh kazahskih napitkov [Investigation of antibiotic resistance, cultural and morphological properties of microorganisms isolated from national Kazakh beverages]. Hranenie i pererabotka sel'hozsyr'ya [Storage and processing of agricultural products]. 2016. No. 9. P. 31-35 (In Russ.).

4. Krumlikov V Yu. Izuchenie orga-nolepticheskih i fiziko-himicheskih svojstv, analiz hranimosposobnosti zakvaski prya-mogo vneseniya [Study of organoleptic and physical-chemical properties, analysis of storage capacity of direct addition starter]. Nauchnye issledovaniya: ot teorii k praktike. Materialy IX Mezhdunarodnoj nauchno-prakticheskoj konferencii. Cheboksary: CNS «Interaktiv plyus» [Scientific research: from theory to practice: Materials IX Intern. nauch-prakt. Cont. Cheboxaries: CNS «Interactive Plus»]. 2016. No. 3 (9). P. 138-139. ISSN 2413-3957 (In Russ.).

5. Grunskaya VA, Gabrielyan DS, Guseva E Yu. Podbor mikroflory i opredelenie sostava zakvaski dlya fermentirovannyh syvorotoch-nyh napitkov funkcional'nogo naznacheniya [Selection of microflora and determination of starter composition for fermented whey drinks of functional purpose]. Nauchnoe obespechenie - sel'skohozyajstvennomu proizvodstvu. T. 2. Inzhenernye nauki: sbornik trudov VGMHA. Vologda-Molochnoe: IC VGMHA [Scientific support - agricultural production. Vol. 2. Engineering sciences: Collection of works of VGMHA. Vologda-Dairy: IC VGMHA]. 2010. P. 13-17 (In Russ.).

6. Harchenko NV, Cherdynceva TA, Netru-sov AI. Novye podhody dlya vydeleniya shtammov bifidobakterij, ih molekulyarnaya diagnostika i ocenka probioticheskogo potenciala [New approaches for isolation of bifidobacteria strains, their molecular diagnosis and evaluation of probiotic potential]. Mikrobiologiya [Microbiology]. 2015. Vol. 84. No. 3. P. 1-8 (In Russ.).

Авторы

Волкова Галина Сергеевна, д-р техн. наук, Куксова Елена Владимировна, канд. техн. наук, Серба Елена Михайловна, д-р биол. наук, чл.-корр. РАН ВНИИ пищевой биотехнологии - филиал ФИЦ питания, биотехнологии и безопасности пищи, 111033, Москва, ул. Самокатная, д. 4Б, ga1ina.vo1kova@bk.ru, uksus-1ena@mai1.ru

Authors

Galina S. Volkova, Doctor of Technical Sciences, Elena V. Kuksova, Candidate of Technical Sciences,

Elena M. Serba, Doctor of Biological Sciences, Corresponding Member of RAS

The All-Russian Research Institute of Food Biotechnology - Branch of the Federal Research Center for Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 4B, Samokatnaya str., Moscow, 111033, galina.volkova@bk.ru, uksus-lena@mail.ru