CC BY
9
при 40° до объема 0,2 мл. Эфирные экстракты наносили на пластинки для хроматографии с тонким слоем алюминия, скрепленным гипсом. Параллельно с пробой на пластинки наносили «свидетель» — технический препарат карбина. В качестве подвижного растворителя использовали смесь гексан-хлороформ 5:5. После подсушивания хроматограм-мы проявляли 2% раствором азотнокислого серебра в 25% едком натре. Затем нагревали пластинки над электроплиткой в течение 2—4 мин. На хроматограмме проявлялись темные пятна, соответствующие кар-бину (1=0,24—0,43) и экстрактивным веществам фильтров = ==0,07—0,1 и =0,76—0,9). Некоторые данные представлены в таблице.
Ранее нами было установлено, что карбин при идентификации на пластинке образует 2 темноокрашенных пятна, причем Яг пятна, находящегося ближе к старту, соответствует химически чистого карбина. Другие карбаматы (севин, диптал, эптам, унден) и хлорсодержа-щие пестициды (гексахлорциклогексан, хлортен, гептахлор, аллипур и ДДТ) определению карбина этим методом не мешают. Чувствительность 5 мкг.
Выводы
1. Предложен спектрофотометрический метод определения карбина в воздухе (чувствительность определения 2 мкг) и метод мокрого сжигания по общему хлору (чувствительность 5 мкг).
2. Показана возможность определения карбина с помощью тонкослойной хроматографии. Чувствительность определения 5 мкг.
ЛИТЕРАТУРА
Алексеева М. В. Завод, лабор., 1949, № 6, с. 679. — Беленький М. Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Л., 1963. — Быхов-ская М. С., Гинзбург С. Л., Хализова О. Д. Методы определения вредных веществ в воздухе и других средах. Л., 1960. — Войтенко Г. А., Ляденко М. Ф.. Я ким В. С. Профилактика отравлений пестицидами — производными карбаминовой кислоты. Киев, 1965. — Мельников М. Н. Химия гербицидов и регуляторов роста растений. М., 1962.— Новые инсектофунгициды и гербициды. М„ 1960, с. 187. — Кли-с е н к о М. А., Лебедева Т. А. Методическое письмо об определении хлорорганичес-ких пестицидов в воздухе, пищевых продуктах и биологических средах. Киев, 1962.
Поступила 26/У1 1966 г.
УДК 614.777:576.851.48:543.39
К МЕТОДИКЕ УСКОРЕННОГО ОБНАРУЖЕНИЯ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ В ВОДЕ ПРИ ПОМОЩИ РАДИОИЗОТОПА С14
Л. Е. Корш, В. Ф. Жевержеева, С. Г. Егорова Институт общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина АМН СССР, Москва
Современные достижения физики, химии, биологии позволяют значительно ускорить бактериологический анализ. Проведенные в последние годы эксперименты свидетельствуют об успешном использовании радиоактивных изотопов в микробиологии и иммунологии. Значение изотопных индикаторов в исследовании биохимичеоких процессов, происходящих в бактериальных ;клетках, уже отмечалось (М. Н. Мейсель, и др.).
В 1956 г. Levin и соавторы применили радиоактивный углерод (С14) для контроля зараженности воды бактериями группы кишечной палочки. Используя современную чувствительную радиометрическую
аппаратуру, они смогли обнаружить наличие газа в первые часы его образования и таким образом определить менее чем 20 бактериальных клеток за 1 час. Авторы предполагают, что ¡предложенный ими метод специфичен для кишечной палочки, так как другие неколиорганизмы, обитающие в воде, выделяют углекислый газ в значительно меньшем количестве (исключение составляют только лишь 2 вида: Pseudomonas и Alcaligenes), причем, по их данным, радиоактивность СОг находится в прямой зависимости от количества бактерий, присутствующих в воде. Вопросы радиационной микробиологии в санитарной охране водоемов подробно освещены В. М. Жоговой. Радиочувствительность кишечной палочки и ее зависимость от характера питательной среды, на которой она выращена, показаны рядом авторов (Б. Н. Ильин; В. М. Жогова;
Рис. 1. Экспериментальные чашечки с адсорбирующими прокладками.
Я. Л. Шехтман и соавторы, и др.). Однако в отечественной литературе нам не удалось найти указаний на применение радиоизотопного метода в санитарной практике для индикации бактериального загрязнения воды. В связи с этим мы ставим задачу изучить возможность применения в санитарной бактериологии при определении кишечной палочки в воде метода, предложенного Левиным и соавторами (1956) и основанного на измерении метаболически выделяемой бактериями СОг, меченной радиоизотопом С14.
Исследования были проведены с использованием культуры кишечной палочки штамма № 113. Бактерии культивировали в среде, состоящей из следующих компонентов: бульона Хоттингера (100 мл), глюкозы (3 г) и водного раствора формиата натрия, меченного С14 (12 мл). Активность 1 мл среды составляла 2,4-Ю-7 (Си—1,2-10~7)Си. Эта величина установлена опытным путем. Она является предельной, не влияет на размножение кишечной палочки и достаточна для подсчета активности на примененных счетчиках. Среду накануне опыта встряхивали на качалке в бутылочках, заткнутых ватной пробкой, в течение 6 часов с целью уменьшения содержания С14Ог, образующегося в стерильной среде.
Опыты ставили по следующей схеме. Среду с изотопом пипеткой разливали в стерильные чашечки (рис. 1), затем туда вносили воду, зараженную кишечной палочкой, и смешивали ее со средой. Чашечки плотно закрывали стерильными стеклами и ставили в термостат. Контролем на неметаболический газ служила среда с изотопом и стерильной водой. Контролем радиоактивного фона являлась среда с опытной водой без изотопа. Посевы инкубировали при 42° З'/г часа. Затем чашечки
вынимали из термостата, стекла быстро меняли на крышечки, внутрь которых заранее помещали адсорбирующую прокладку, смоче-нную несколькими каплями насыщенного водного раствора гидроокиси бария. Плотно закрытые чашечки вторично помещали в термостат на 30 мин. для поглощения С02, меченной С14, выделяемой бактериями в процессе их жизнедеятельности. После полной 4-часовой инкубации чашечки опять вынимали из термостата, строго на горизонтальной поверхности перемешивали среду для лучшего выделения и поглощения С1402 прокладками, после чего прокладки подсушивали под инфракрасной лампой в течение 15 мин. (до полного высыхания) и затем определяли их активность. Измеренная активность с вычетом стерильного контроля и фона указывала на зараженность воды бактериями кишечной палочки. Анализ продолжался около 5—6 часов с учетом времени подсчета. Каждое отдельное определение радиоактивности длилось 5 мин. На каждую концентрацию испытуемых бактерий в воде делали по 3—5 параллельных посевов.
Необходимо отметить, что изотоп С14 обладает очень мягким р-из-лучением. Это создает определенные трудности при измерении образцов, так как требует применения не обычного радиометрического оборудования, а специальных установок. В последние годы для измерения активности препаратов, содержащих в своем составе радиоуглерод, предложен ряд способов. Мы измеряем активность образцов на газопроточном счетчике отечественного производства типа СОТ-25-БФЛ, изготовленном экспериментальной мастерской Сельскохозяйственной академии им. К- А. Тимирязева. Общий вид установки счетчика представлен на рис. 2. Основным компонентом газового наполнения счетчика служит абсолютно чистый гелий, а в качестве гасящего компонента используются пары абсолютного спирта с абсолютным эфиром. Ошибка измерений не превышает ±3%.
В результате серии опытов была установлена возможность использования радиоизотопа С14 для обнаружения кишечной палочки в воде. Радиоактивный углерод, вносимый в питательные среды в указанных выше концентрациях, можно учитывать на газопроточном счетчике СОТ-25-БФЛ с довольно хорошей эффективностью счета. Различное количество бактерий, вносимых в среду с изотопом, дает и различное количество импульсов в минуту (см. таблицу).
Однако такая закономерность обеспечивалась не всегда. В ряде опытов отмечались значительные проскоки активности в параллельных определениях одной и той же пробы воды. Проанализировав все этапы разрабатываемой нами методики, мы пришли к заключению, что такие проскоки могут быть объяснены суммой нескольких ошибок, присущих методу, в частности ошибки от неравномерного количества испытуемой воды, зараженной бактериями, а также количества среды с изотопом,
Рис. 2. Общий вид установки газопро точного счетчика СОТ-25-БФЛ.
вносимых в экспериментальные чашечки, ошибки от неравномерного смачивания адсорбирующей прокладки гидроокисью бария и тем самым неодинаковым улавливанием Си02 в различных образцах параллельных проб и небольшими колебаниями счета импульсов различных проб самим счетчиком. Ошибка от неравномерного внесения бактерий и изотопа снижается за счет очень точного отмеривания испытуемой воды и изотопной среды, лучше всего с применением микропипетки. Неодинаковая адсорбция С1402 может быть сведена до минимума, если использовать прокладки с очень гладкой поверхностью и равномерной волокнистостью. Третья ошибка должна быть учтена при обработке получае-емых материалов, в случае проведения счета не менее 3—5 параллельных посевов испытуемой воды и 3—5 контролей.
Судя по результатам наших экспериментальных исследований, большой помехой в разработке метода служит выделение неметаболического газа в значительном количестве в отдельных эпизодических определениях. Кстати, на это указывал и автор метода. Неметаболический фон объясняли по-разному. Во-первых, отмечали роль окислительно-восстановительных реакций, протекающих в питательной среде, включая форми-ат натрия, меченный С14, и следы металлических ионов, попадающих в среду со стенок опытных чашек. Во-вторых, указывали на возможность разрушения химических связей формиата натрия радиацией из собственного распада. Кроме того, подчеркивали роль состава питательной среды и особенно ее рН.
В результате многих опытов мы установили, что существенное влияние на выделение неметаболического газа оказывает рН среды и количество ее (среды) в каждой опытной чашечке. Наиболее оптимальными для выделения метаболического газа и уменьшения неметаболического являются поддержание рН в пределах 7,4—7,6 и количество среды, не превышающее 2 мл. Однако вопрос о снижении неметаболического газа еще окончательно не решен и представляет собой один из важных в разрабатываемой методике. Остается неясной природа механизма этого фона, для чего необходимо более углубленное изучение химизма процессов, происходящих в питательной среде во время инкубации посева.
Очень важен также вопрос об используемой аппаратуре. Газопроточные счетчики, в частности СОТ-25-БФЛ, примененные нами, являются чувствительными, хорошими приборами для улавливания С14. Но работа с ними т.ребует специальной инженерно-технической подготовки. Мы попытались для подсчета С14 использовать также торцовый счетчик Т-25-БФЛ отечественного производства со слюдяным окном 0,9—1 мг/см2. Большим преимуществом этого счетчика следует считать простоту в обращении с ним и стабильность получаемых результатов; отрицательная ¡сторона — малая эффективность счета. Для повышения эффективности счета радиоактивных препаратов мы испытали различные фильтрующие ¡материалы: фильтры «СФ», фильтры из синтетического материала марки ФПП-15-1,7 и ватманскую хроматографическую бумагу № 15. Эффективность счета с фильтрами «СФ» оказалась низкой. Хороший результат дали прокладки из материала ФПП-15-1,7 и ватманской бумага. Прокладки из ФПП-15-1,7 ¡при подсушивании иногда скручиваются, что во время подсчета импульсов влечет за собой нарушение геометрии образца и повышает величину обратного рассеивания. Это в свою
Зависимость метаболической активности от количества бактерий (в различных опытах)
Количество бактерий в 1 мл среды Активность (в имп/мин)
20 8
100 16
200 59
150 20
500 50
850 90
1 650 109
1 500 3 000 109 304
очередь вызывает разброс отдельных параллельных определений и таким образом оказывает значительное влияние на величину импульсов. Преимущество прокладок из ватманской бумаги в ее ровной и гладкой поверхности, а также равномерной смачиваемости и впитываемости.
Одна из задач радиоизотопного метода заключается в его количественной калибрации. Быстрое количественное определение бактерий — одна из наиболее трудных задач санитарной бактериологии. Из тех способов индикации фекального загрязнения, которыми мы владеем сейчас, нет такого точного количественного метода, который можно было бы
избрать как стандарт для калибровки радиоизотопного. Тем не менее для того, чтобы подойти к количественной оценке разрабатываемого метода и определить плотность бактерий в каждой чашечке, мы в качестве контроля избрали метод мембранных фильтров. Для этого при постановке опыта отбирали из каждой опытной чашечки стерильной пипеткой определенное количество среды (0,1—0,5 мл), предварительно смешанное с испытуемой во-Рис. 3. Соответствие между количеством бак- дой, и фильтровали ее через терий и выделенной им радиоактивностью мембранный фильтр (без филь-вимп/мин). тровального аппарата). Мемб-
ранные фильтры помещали на розоловый агар и посевы инкубировали при 37° в течение 18—20 часов с последующим подсчетом.
Данные о соответствии подсчитанных таким образом бактерий и выделенному ими углекислому газу, выраженные в импульсах в минуту, представлены на рис. 3. Результаты эти указывают на определенную закономерность между количеством бактерий, находящихся в испытуемой воде, и выделяемым ими углекислым газом.
Выводы
1. Экспериментальными исследованиями установлена возможность использования радиоизотопа С14 для ускоренного обнаружения в воде кишечной палочки.
2. С помощью газопроточного счетчика отечественного производства СОТ-25-БФЛ можно улавливать С14 в питательной среде в концентрации Ю-7 Си с хорошей эффективностью счета.
3. Торцовый счетчик отечественного производства с толщиной слюдяного окна 0,9—1 мг/ам2 дает .меньшую эффективность счета. Но такие его преимущества, как простота в обращении с ним и стабильность получаемых результатов, делают его перспективным с учетом использования метода в практических условиях.
4. Применение адсорбирующих прокладок из синтетического материала марки ФПП-15-1,7 и хроматографической ватманской бумаги № 15 повысило эффективность счета радиоактивного углерода в несколько раз. Такое увеличение указывает на значительный потенциал чувствительности радиоизотопного теста.
ЛИТЕРАТУРА
Ж о г о в а В. М. Вопросы радиационной микробиологии в санитарной охране водоемов. М., 1964. — Мей се ль М. Н. В кн.: Изотопы в микробиологии. М., 1955, с. 5. — Ш е х т м а н Я. Л., Плохой В. Н., Филиппова Г. В. В кн.: Действие иони-
Моличество бактерий (в /уи/г)
зирующих излучений на животный организм. Киев, 1958, с. 162.— Levin G. V., Harrison V". В., Hess W. С., J. Am. Water Works Ass., 1956, v. 41, p. 75. — L e -v i n G. V., H a r r i s о n V. В., H e s s W. C. et al. Am. J. publ. Hlth, 1956, v. 46, p. 1405.
Поступила 9/VIII 1966 r.
УДК 614.77! +614.777]-074 + 614.3!:639.2]:576.851.553
К МЕТОДИКЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ПРОБ ПОЧВЫ, ВОДЫ И РЫБЫ НА НАЛИЧИЕ CL. BOTULINUM
Л. М. Шишулина Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии, Москва
I
4 В настоящем сообщении изложены результаты исследования проб
почвы, воды, рыбы и рыбной муки на наличие возбудителя ботулизма при различных температурах культивирования и методах обработки материала перед посевом.
Каждую пробу почвы или рыбной муки суспендировали в 1 % растворе пептонной воды, затем одну часть полученной суспензии засевали на среду Китт — Тароцци без предварительного прогрева, а другую часть —после прогрева на водяной бане при 80° в течение 30 мин. Первый посев инкубировали при 25°, второй — при 34°. При исследовании воды и рыбы, а также 10 проб почвы каждый образец засевали без предварительного прогрева на 2 флакона с обогатительной средой. Параллельные посевы каждой пробы культивировали при 25 и 34°. Токсичность культур определяли биологическим методом на белых мышах. Типоопецифичность всех токсичных (культур устанавливали методом ^ нейтрализации токсина противоботулиническими и противостолбнячной
сыворотками. Исследовано 5728 проб, в том числе 4175 проб почвы, 92 пробы воды, 265 проб рыбной муки и 1196 проб рыб. При исследовании проб у части токсичных культур выявлена неспецифическая активность для возбудителей ботулизма и столбняка. Внутрибрюшинное введение белым мышам 0,5 мл культуральной жидкости, разведенной пептонной водой в соотношении 1:2, вызывало гибель животных, чему предшествовала атипичная для ботулизма и столбняка клиника заболевания, а реакция нейтрализации поливалентной противоботулинической и противостолбнячной сывороткой была отрицательной. Часть проб имела очень слабую (sS4DSM в 1 мл) и нерегулярно обнаруживаемую активность, вследствие чего в опыте реакции нейтрализации не удавалось получить четких результатов (погибало по 1 из 2 белых мышей). Заражение животных культурами 20 проб, отнесенных нами к группе «слабоактивных», вызывало клиническую картину заболевания, сходную с ботулизмом. В таких случаях реакция нейтрализации поливалентной противоботулинической сывороткой была положительной, но в опыте 4| нейтрализации моновалентными противоботулиническими сыворотками
животные на протяжении всего срока наблюдения оставались здоровыми. Нередко активность первоначальной неочищенной культуры, полученной при посеве почвы, была обусловлена несколькими видами патогенных микроорганизмов: в 26 посевах — С1. botulinum и микроорганизмы с «неспецифической активностью», в 54 культурах — С1. botulinum и CI. tetani, в 2 посевах — Cl. botulinum, CI. tetani и микроорганизмы с «неспецифической ¡активностью», в 1 посеве — Cl. tetani и микроорганизмы с «неспецифичеокой активностью». Сочетание Cl. botulinum с микроорганизмами с «неспецифической активностью» отмечалось и при исследовании рыбы.
