CC BY
2
Для корреспонденции
Требух Марина Дмитриевна - младший научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» Адрес: 109240, Российская Федерация, г. Москва, Устьинский проезд, д.2/14 Телефон: (495) 698-53-97 E-mail: trebukh@ion.ru https://orcid.org/0000-0002-4077-1593
Требух М.Д., Тышко Н.В., Садыкова Э.О., Никитин Н.С., Гмошинский И.В.
Изучение влияния биомассы личинок черной львинки (Hermetia illucens) на иммунный статус крыс
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, 109240, г. Москва, Российская Федерация
Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 109240, Moscow, Russian Federation
Совершенствование научно-исследовательских алгоритмов оценки безопасности пищевой продукции нового вида в настоящее время является одним из значимых направлений гигиены питания. В рамках изучения влияния насекомых НвттвИа Шисвт на иммунный статус крыс был использован стандартный протокол аллергологических исследований, применяемых при медико-биологической оценке генно-инженерно-модифицированной пищевой продукции, дополненный показателями цитокинового профиля и патоморфологической характеристикой лимфоидной ткани иммунокомпетентных органов. Цель исследования - изучение влияния на иммунный статус крыс биомассы личинок черной львинки (НвттвЫа Шисвт) в эксперименте на модели индуцированного анафилактического шока.
Финансирование. Научно-исследовательская работа по подготовке рукописи проведена при финансировании Российского научного фонда (проект № 20-16-00083-П), https://rscf.ru/project/23-16-45007/. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Тышко Н.В., Гмошинский И.В.; сбор и обработка данных - Требух М.Д., Никитин Н.С.; статистическая обработка данных - Требух М.Д.; написание текста - Требух М.Д., Тышко Н.В., Садыкова Э.О., Никитин Н.С.; редактирование, утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи - все авторы. Благодарность. Авторы искренне благодарят сотрудников лаборатории иммунологии ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»: доктора медицинских наук, профессора, главного специалиста Ригера Н.А. и кандидата биологических наук, научного сотрудника Тимонина А.Н. за помощь, оказанную при выполнении исследований.
Для цитирования: Требух М.Д., Тышко Н.В., Садыкова Э.О., Никитин Н.С., Гмошинский И.В. Изучение влияния биомассы личинок черной львинки (Hermetia illucens) на иммунный статус крыс // Вопросы питания. 2024. Т. 93, № 2. С. 41-51. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-2-41-51 Статья поступила в редакцию 13.12.2023. Принята в печать 05.03.2024.
Contribution. Concept and design of the study - Tyshko N.V., Gmoshinski I.V.; collecting and processing data - Trebukh M.D., Nikitin N.S.; statistical data processing - Trebukh M.D.; text writing - Trebukh M.D., Tyshko N.V., Sadykova E.O., Nikitin N.S.; editing, approval of the final version of the article, responsibility for the integrity of all parts of the article - all authors.
Funding. The research was funded by the Russian Science Foundation (Project No. 20-16-00083-П), https://rscf.ru/project/23-16-45007/. Conflict of interest. The authors have no conflict of interest to declare.
Acknowledgement. The authors would like to sincerely thank the staffs of the Laboratory of Immunology of the Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety: Doctor of Medicine, Professor, Chief Specialist Rieger N.A. and Candidate of Biological Sciences, Researcher Timo-nin A.N. for the help in carrying out the research.
For citation: Trebukh M.D., Tyshko N.V., Sadykova E.O., Nikitin N.S., Gmoshinski I.V. Impact of black soldier fly (Hermetia illucens) larvae biomass on the immune status of rats. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2024; 93 (2): 41-51. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-2-41-51 (in Russian)
Received 13.12.2023. Accepted 05.03.2024.
Impact of black soldier fly {Hermetia illucens) larvae biomass on the immune status of rats
Trebukh M.D., Tyshko N.V., Sadykova E.O., Nikitin N.S., Gmoshinski I.V.
Материал и методы. Влияние биомассы личинок черной львинки (Hermetia illucens) изучено в 29-дневном эксперименте на растущих (в период 43-72 дней жизни) крысах-самцах линии Вистар, получавших с рационом биомассу Hermetia illucens - основная группа (n=29) и изокалорийный полусинтетический казеиновый рацион - контрольная группа (n=29). Комплексную оценку аллергенного потенциала биомассы Hermetia illucens в эксперименте на модели индуцированного анафилактического шока у крыс проводили с использованием расширенного пула изучаемых показателей иммунного статуса: тяжести активного анафилактического шока (летальность, число тяжелых реакций анафилаксии, анафилактический индекс); цитокинового профиля (содержание провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, а также регуляторов клеточного и гуморального иммунного ответа), иммуноглобулинов класса IgG1, IgG4 до и после введения разрешающей дозы овальбумина (4 мг на 1 кг массы тела), а также патоморфологических характеристик лимфоидной ткани основных иммунокомпетентных органов (тимус, селезенка, пейеровы бляшки тонкой кишки). Результаты. Показано достоверное снижение тяжести реакции системной анафилаксии в основной группе. Сравнительная оценка цитокинового профиля сыворотки крыс [гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулиру-ющий фактор, интерферон у, интерлейкин (ИЛ) 10, ИЛ-12(р70), ИЛ-13, ИЛ-1а, ИЛ-1/5, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, фактор некроза опухоли а], а также уровня иммуноглобулинов класса IgG1, IgG4 до и после введения разрешающей дозы овальбумина не выявила достоверных различий у крыс контрольной и основной групп. Отмечено снижение концентрации проаллергических цитокинов в сыворотке крови крыс основной группы: ИЛ-4 - в 1,3, ИЛ-10 - в 1,1 и ИЛ-13 - 1,2 раза, не достигающее уровня статистической значимости (р>0,05), а у животных, перенесших легкую степень анафилактической реакции, соответственно в 1,8; 1,4 и 1,4раза (р>0,05). Морфологические исследования органов иммунной системы межгрупповых различий не выявили.
Заключение. Аллергологические исследования личинок черной львинки (Hermetia illucens) в эксперименте на крысах, во время которого была воспроизведена модель системной анафилаксии и изучены показатели иммунного статуса: тяжесть активного анафилактического шока, цитокиновый профиль, иммуноглобулины класса IgG1, IgG4 и морфологическая структура иммунокомпетентных органов, не выявили никакого аллергенного действия изученного продукта. Ключевые слова: пищевая продукция нового вида; биомасса личинок черной львинки (Hermetia illucens); аллергологи-ческие исследования; цитокиновый профиль; иммуноглобулины; морфология иммунокомпетентных органов; анафилаксия
The improvement of the novel foods' safety assessment algorithms is currently one of the food hygiene significant areas. Within the studying of Hermetia illucens insects' effect, the standard in vivo allergological research integrated in the protocol of medical and biological evaluation of genetically modified food has been used. The protocol was supplemented with cytokine profile indicators and pathomorphologic characteristics of immunocompetent organs' lymphoid tissue.
The purpose of the research was to study the effect of black soldier fly (Hermetia illucens) larvae biomass on the rats' immune status in the experiment on the induced anaphylactic shock model.
Material and methods. The effect of black soldier fly (Hermetia illucens) larvae biomass was studied in a 29-day experiment on growing (43-72 days of life) male Wistar rats fed with Hermetia illucens biomass - main group (n=29) and semi-synthetic casein diet -control group (n=29). The complex assessment of allergenic potential of Hermetia illucens biomass was carried out in the experiment on the induced anaphylactic shock model in Wistar rats. An expanded pool of immune status indicators was studied including active anaphylactic shock severity (lethality, number of severe anaphylaxis reactions, anaphylactic index); cytokine profile (content of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines, as well as regulators of cellular and humoral immune response); IgG1 and IgG4 level before and after administration of ovalbumin permissive dose (4 mg/kg b.w.). In addition to this pathomorphologic characteristics of lymphoid tissue of the main immunocompetent organs (thymus, spleen, Payer's patches) have been obtained. Results. The significant systemic anaphylaxis reaction decrease in the main group has been shown. Comparative assessment of the serum cytokines (GM-CSF, IFN-y, IL-10, IL-12(p70), IL-13, IL-1a, IL-10, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, TNF-а) as well as the level of immunoglobulins of the IgG1, IgG4 class before and after administration of ovalbumin permissive dose did not reveal significant differences in rats of the control and main groups. In the main group, there was a decrease in blood serum proallergic cytokines: the level of IL-4 reduced by 1.3 fold, IL-10 - 1.1 and IL-13 - 1.2 fold (p>0.05), and in animals with mild anaphylactic reaction - by 1.8, 1.4 and 1.4 times, respectively (p>0.05). The morphologic studies of the immune system organs showed no intergroup differences. Conclusion. Thus, allergological studies of black soldier fly (Hermetia illucens) larvae in the experiment with the use of systemic anaphylaxis rat model and determination of immune status indicators (anaphylactic shock severity, cytokine profile, IgG1 and IgG4 level, morphologic structure of immunocompetent organs) did not reveal any allergenic effect of the studied product. Keywords: novel foods; black soldier fly (Hermetia illucens) larvae biomass; allergological studies; cytokine profile; immunoglobulins; morphology of immunocompetent organs; anaphylaxis
Современные мировые тренды направлены на расширение продовольственной базы за счет пищевой продукции нового вида, полученной с использованием альтернативных источников (генно-инженерно-модифи-цированных организмов, водорослей, микроскопических грибов, насекомых и др.). Накопленный практический и теоретический опыт в области пищевой токсикологии и аллергологии, а также смежных разделов биологии позволяет не только прогнозировать вероятные риски для здоровья, связанные с потреблением продукции нового вида, но и своевременно актуализировать
систему оценки безопасности, исключая саму возможность возникновения риска. Совершенствование научно-исследовательских и экспертных алгоритмов обеспечения пищевой безопасности, в том числе в части идентификации потенциальных вредных факторов, поступающих с пищей, вносит существенный вклад в решение задач Приоритетного направления развития науки, технологий и техники в Российской Федерации (Стратегия научно-технологического развития Российской Федерации, утвержденная Указом Президента РФ от 28.02.2024 № 145).
Обеспечение качества и безопасности пищевых продуктов нового вида в России регулируется на государственном уровне, действующая система мер предусматривает глубоко эшелонированную защиту здоровья потребителей нынешнего и будущих поколений и включает надежную систему оценки безопасности, эффективную систему контроля за оборотом, мониторинг воздействия на человека и окружающую среду, предоставление достоверной информации потребителям (Закон РФ «О защите прав потребителей» от 07.02.1992 № 2300-1; Федеральный закон «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» от 30.03.1999 № 52-ФЗ; Федеральный закон «О качестве и безопасности пищевых продуктов» от 02.01.2000 № 29-ФЗ; Федеральный закон «О техническом регулировании» от 27.12.2002 № 184-ФЗ; Указ Президента РФ от 21.01.2020 № 20 «Об утверждении Доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации»; TP ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции»; TP ТС 022/2011 «Пищевая продукция в части ее маркировки»).
Оценка безопасности нового продукта выполняется в рамках процедуры его государственной регистрации, важным этапом которой является изучение аллергенного потенциала такого продукта. Международный опыт в области аллергологических исследований пищевой продукции нового вида, обобщенный в руководствах Европейского агентства по безопасности пищи, Организации экономического сотрудничества, Комиссии Кодекс Алиментариус, Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций и Всемирной организации здравоохранения [1-5], предлагает целый ряд подходов к изучению аллергенности, в числе которых сравнение нативных белков продукта с известными аллергенами (с использованием баз данных, содержащих информацию о трехмерной структуре и функции известных аллергенов и родственных им белков); определение потенциальной аллергенности в иммунохимических исследованиях in vitro с использованием IgE, выделенных из сыворотки крови сенсибилизированных пациентов или модельных животных; определение устойчивости к воздействию протеолитических ферментов (пепсина, панкреатина), температуры, кислотности [6]; протеомные, метаболомные, транскриптомные методы [7].
Российский подход к экспериментальной оценке потенциальной аллергенности до недавнего времени предполагал выполнение 2 блоков исследований in vivo на лабораторных животных, получающих с рационом изучаемый продукт в аггравированном количестве: оценку иммуномодулирующих и сенсибилизирующих свойств нового продукта проводили на мышах линий СВА и C57BI/6, аллергенного потенциала - на модели системной анафилаксии с изучением тяжести активного анафилактического шока и интенсивности гуморального иммунного ответа у крыс линии Вистар [7-9].
Дальнейшее развитие отечественных подходов направлено на совершенствование существующих и поиск новых моделей, позволяющих повысить прогно-
стическую значимость исследований. Появление современных направлений и методов оценки иммунного статуса обусловило возможность комплексной оценки аллергенного потенциала пищевой продукции нового вида путем расширения перечня анализируемых показателей, в частности за счет цитокинового профиля (провоспалительные и противовоспалительные цито-кины, регуляторы клеточного и гуморального иммунного ответа), иммуноглобулинов класса IgG1, IgG4, а также патоморфологических исследований лимфоидной ткани основных иммунокомпетентных органов (рис. 1). Разработанные подходы были успешно апробированы в серии экспериментов по оценке безопасности потенциально аллергенных объектов (всего изучено более 1000 единиц информации) [10, 11].
Цель работы - изучение влияния на иммунный статус крыс биомассы личинок черной львинки (Hermetia illucens) в эксперименте на модели индуцированного анафилактического шока.
Материал и методы
Материалом для исследований была сухая измельченная биомасса личинок черной львинки (Hermetia illucens). Комплексную оценку аллергенного потенциала биомассы Hermetia illucens в эксперименте на модели индуцированного анафилактического шока у крыс линии Вистар осуществляли с использованием расширенного пула изучаемых показателей иммунного статуса: тяжести активного анафилактического шока (летальность, число тяжелых реакций анафилаксии, анафилактический индекс), цитокинового профиля (содержание провоспалительных и противовоспалительных цитоки-нов, а также регуляторов клеточного и гуморального иммунного ответа), иммуноглобулинов класса IgG1, IgG4 до и после введения разрешающей дозы овальбумина (ОВА), а также патоморфологических характеристик лимфоидной ткани основных иммунокомпетентных органов (тимус, селезенка, пейеровы бляшки тонкой кишки).
29-дневный эксперимент проведен на растущих (в период 43-72 дней жизни) крысах-самцах линии Вистар поколения F3, являющихся потомками 2 поколений животных, получавших с рационом биомассу Hermetia illucens на протяжении всего периода онтогенетического развития - основная группа (n=29) и полусинтетический казеиновый рацион (ПКР) в течение всего периода исследований - контрольная группа (n=29) [12]. Измельченную биомассу личинок Hermetia illucens включали в рацион крыс основной группы с учетом содержания белков, жиров и углеводов во вводимом продукте при соблюдении принципа изокалорий-ности и идентичности химического состава [12].
Масса тела животных контрольной группы в начале эксперимента составляла 164±4 г, основной - 165±2 г. Крысы содержались в пластиковых клетках с древесной подстилкой (по 2 особи в клетке), в отапливаемом (при температуре от 20 до 24 °С) и вентилируемом помещении
Комплексная оценка аллергенного потенциала пищевой продукции нового вида на модели индуцированного анафилактического шока у крыс линии Вистар Complex medical and biological evaluation of the allergenic potential on the induced anaphylactic shock model of Wistar rats
Изучение цитокинового профиля Cytokine profile investigation
• Про-и противовоспалительные цитокины Pro- and anti-infllammatory cytokines',
• Thl-регуляторы клеточного и Th2-регуляторы гуморального иммунного ответа (GM-CSF, ИФН-у, ИЛ-10, ИЛ-12(р70), ИЛ-13, ИЛ-1а, ИЛ-Iß, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ФНОа)
Th1 regulators of the cellular immune response and Th2 regulators of humoral immune response (GM-CSF, IFN-y, IL-10, IL-12(p70), IL-13, IL-1a, IL-1ß, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, TNF-a)
Оценка тяжести системной анафилаксии Systemic anaphylaxis severity evaluation
• Частота тяжелых реакций Severe reactions frequency;
• анафилактический индекс anaphylactic index;
• циркулирующие специфические иммуноглобулины (IgG1 + IgG4) до введения разрешающей дозы овальбумина
circulating specific immunoglobulins (IgG1 + IgG4) before shocking dose of ovalbumin
О
Патоморфологические исследования иммунокомпетентных органов Pathomorphological studies of immunocompetent organs
• Тимус / Thymus;
• селезенка / spleen;
• тонкая кишка / small intestine
Иммуноглобулины / Immunoglobulins \
Циркулирующие неспецифические IgG1, IgG4 после введения разрешающей дозы овальбумина Immunoglobulins circulating non-specific immunoglobulins IgG1, IgG4 after shocking dose of ovalbumin )
Рис. 1. Расширенный перечень показателей, изучаемых в рамках комплексной оценки аллергенного потенциала пищевой продукции нового вида на модели индуцированного анафилактического шока у крыс линии Вистар (изменения, внесенные в стандартный протокол исследований, выделены пунктиром)
Fig. 1. Expanded list of parameters investigated within the framework of complex evaluation of allergenic potential of novel food on the induced anaphylactic shock model of Wistar rats (changing of the standard research protocol are highlighted with dashed lines)
с естественным освещением, доступ к корму и воде - ad libitum. На протяжении эксперимента вели ежедневные наблюдения за внешним видом, поведением, поедаемо-стью корма и общим состоянием животных, массу тела крыс измеряли еженедельно. Работу с животными проводили в соответствии с Правилами по уходу и использованию лабораторных животных (https://grants.nih.gov/grants/ olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf), ГОСТ 33215-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур» и ГОСТ 33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами».
Модель системной анафилаксии воспроизводили согласно [13] с незначительными модификациями.
Сенсибилизацию животных ОВА проводили на 1, 3 и 5-й дни эксперимента (рис. 2): крысам обеих групп внутрибрюшинно вводили по 100 мкг ОВА куриного яйца (5-кратно перекристаллизованный препарат), адсорбированного на 10 мг гидроксида алюминия. На 22-й день эксперимента дополнительно вводили еще 10 мкг ОВА в тех же условиях для индукции вторичного иммунного ответа. На 29-й день крыс взвешивали, отбирали 0,2 мл крови из хвостовой вены до введения разрешающей дозы ОВА для определения гуморального иммунного ответа (сумма фракций циркулирующих специфических IgG1 и IgG4), после чего вводили внутривенно разрешающую дозу ОВА (4 мг на 1 кг массы тела в 0,5 мл изотонического апирогенного 0,15 М ЫаС!). За развитием симптомов активного анафилактического шока наблюдали
ОВА 100 мкг в/б OVA 100 w ip
ОВА 10 мкг в/б - бустерная доза (индукция вторичного иммунного ответа)
OVA 10 ^g ip - booster dose (induction of secondary immune response)
Рис. 2. Модель индуцированного анафилактического шока у крыс линии Вистар | Fig. 2. The model of induced anaphylactic shock in Wistar rats [8]
ОВА 4 мг на 1 кг массы тела в/в - разрешающая доза (индукция анафилактического шока) OVA 4 цg/kg b.w. iv - shocking dose (induction of anaphylactic shock)
Таблица 1. Тяжесть активного анафилактического шока и интенсивность гуморального иммунного ответа крыс-самцов линии Вистар Table 1. Active anaphylactic shock severity and intensity of humoral immune response in male Wistar rats
Показатель Indicator Группа животных / Group of animals P
контрольная / control n=29 основная / main n=29
Тяжесть активного анафилактического шока, количество животных, абс. (%) Active anaphylactic shock severity, number of animals, abs. (%)
Нет реакции /No response 2 (6,9) 1 (3,4) >0,05f
+ 6 (20,7) 12 (41,4) >0,05f
++ 6 (20,7) 10 (34,5) >0,051"
+++ 1 (3,4) 0 (0) >0,05f
++++ 14 (48,2) 6 (20,7) <0,05t
Анафилактический индекс / Anaphylactic index 2,66 1,93 <0,05#
Сумма антител (1дй1и IgG4) в сыворотке крови (до введения разрешающей дозы), M±m, мг/мл (n) The sum of the serum antibodies (IgG1 and IgG4) (before shocking dose), M±m, mg/ml (n)
Средняя по группе / Group Mean 3,73±0,35 (29) 3,82±0,25 (29) >0,05#
В зависимости от тяжести анафилактического шока Depending on the anaphylactic shock severity + 3,42±0,84 (6) 3,55±0,32 (12) >0,05#
++ 3,74±0,51 (6) 3,86±0,40 (10) >0,05#
++++ 4,03±0,55 (14) 4,19±0,81 (16) >0,05#
Логарифм концентрации IgG антител к ОВА в сыворотке крови (до введения разрешающей дозы), M±m (n) The serum IgG antibodies concentration logarithm to OVA (before shocking dose), M±m (n)
Средняя по группе / Group Mean 0,52±0,04 (29) 0,56±0,03 (29) >0,05#
В зависимости от тяжести анафилактического шока Depending on the anaphylactic shock severity + 0,47±0,10 (6) 0,49±0,05 (12) >0,05#
++ 0,55±0,06 (6) 0,56±0,05 (10) >0,05#
++++ 0,59±0,06 (14) 0,62±0,07 (16) >0,05#
Сумма антител (1дй1и IgG4) в сыворотке крови выживших крыс (после введения разрешающей дозы), M±m, мг/мл The sum of the serum antibodies (IgG1 and IgG4) of the surviving rats (after shocking dose), M±m, mg/ml (n) n)
Средняя по группе / Group Mean 0,32±0,04 (15) 0,27±0,04 (23) >0,05#
В зависимости от тяжести анафилактического шока Depending on the anaphylactic shock severity + 0,31±0,06 (6) 0,21 ±0,05 (12) >0,05#
++ 0,33±0,07 (6) 0,30±0,05 (10) >0,05#
П р и м е ч а н и е. * - двусторонний t-критерий Стьюдента; # - непараметрический критерий Манна-Уитни; f - точный U-тест Фишера.
N o t e. * - two-sided Student's t-test; # - Mann-Whitney non-parametric test; f - Fisher's exact U-test.
в течение последующих 24 ч. Тяжесть реакции оценивали в баллах в соответствии со шкалой: + (1) - озноб, одышка, ++ (2) - слабость, атаксия, цианоз конечностей, +++ (3) - судороги, паралич, ++++ (4) - летальный исход. Величину анафилактического индекса рассчитывали как среднее арифметическое балльных оценок тяжести анафилаксии по группе по данным наблюдения через 24 ч после введения разрешающей дозы [8, 14]. У всех выживших животных отбирали материал для исследований органов иммунной системы (тимус, селезенка, тонкая кишка с пейеровыми бляшками), а также кровь для иммуноферментного определения титра антител IgG1 и IgG4 (использованы наборы CEA074RA и SEA234RA, Cloud-Clone Corp., Китай) и цитокинового профиля сыворотки [гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), интерферон у (ИФН-у), интерлейкин (ИЛ) 10, ИЛ-12ф70), ИЛ-13, ИЛ-1 а, ИЛ-1р, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, фактор некроза опухоли а (ФНОа)] с использованием мультиплексной панели Bio-Plex Pro™ Rat Cytokine 12-Plex (Bio-Rad) cat#171К1002М.
Приготовление и окрашивание гистологических препаратов осуществляли общепринятыми методами [15]. Изучение гистологических препаратов проводили
с помощью светового микроскопа Axio Imager Z1 ^arl Zeiss, ФРГ), для фотосъемки использовали цифровую фотокамеру AxioCam HRc ^arl Zeiss, ФРГ).
Статистическую обработку данных проводили с использованием программы IBM SPSS Statistics 23 (IBM, США). Характер распределения количественных признаков определяли с помощью многомерного х2-критерия, равенство дисперсий - с помощью F-критерия. Оценку статистической значимости различий средних величин проводили методом однофакторного дисперсионного анализа. Статистический анализ включал проверку нормальности полученных данных по методу Колмогорова-Смирнова, однородность дисперсий проверяли с помощью теста Левена. Дополнительно проверяли гипотезу о различии распределений указанных показателей с помощью непараметрического рангового U-кри-терия Манна-Уитни. Гипотезу об однородности распределения значений массы животных и величины ответа антител для 2 групп в совокупности проверяли с помощью теста на остаточную дисперсию (критерий ANOVA). Достоверность различия долевых показателей тяжести анафилактического шока (процент летальности, процент тяжелых реакций) проверяли с использованием точного U-теста Фишера и х2. Достоверность различия
Таблица 2. Уровень цитокинов в сыворотке крови крыс-самцов линии Вистар, выживших после введения разрешающей дозы овальбумина (M±m), пг/мл
Table 2. Serum cytokine levels of surviving male Wistar rats after ovalbumin shocking dose (M±m), pg/ml
Показатель Indicator Контрольная ПКР Control semi-synthetic casein diet (n=15) « & Легкая реакция «+» Mild reaction «+» Средняя реакция «++» Average reaction «++» е se = 5 ^ S
= fe ej н р ni n OI_ ■—- ° 5 контрольная группа control group (n=6) основная группа main group (n=12) контрольная группа control group (n=6) основная группа main group (n=10) £ = § Д Ре Ref (
Провоспалительные цитокины / Pro-inflammatory cytokines
ИЛ-1а / IL-1a 0,105±0,016 0,112±0,009 0,137±0,033 0,106±0,012 0,079±0,019 0,120±0,016 0,001-0,464
ИЛ-Iß / IL-1ß 0,089±0,030 0,051 ±0,012 0,065±0,022 0,070±0,022 0,144±0,068 0,032±0,009 0,001-1,678
ИЛ-6 / IL-6 0,643±0,070 0,594±0,051 0,704±0,144 0,518±0,066 0,615±0,101 0,665±0,080 0,016-2,444
ФНОа / TNF-a 0,380±0,046 0,373±0,032 0,425±0,079 0,337±0,039 0,328±0,085 0,421±0,052 0,008-0,970
GM-CSF 0,115±0,033 0,091±0,023 0,104±0,038 0,123±0,038 0,169±0,071 0,057±0,021 0,002-0,842
Th-i-регуляторы клеточного иммунного ответа / Th1 regulators of the cellular immune response
ИЛ-2 / IL-2 1,127±0,255 1,152±0,212 1,191 ±0,358 0,864±0,187 1,254±0,595 1,456±0,393 0,001-9,707
ИЛ-12(р70) IL-12(p70) 0,213±0,044 0,187±0,024 0,314±0,074 0,144±0,021 0,170±0,074 0,230±0,056 0,008-2,217
ИФН-у / IFN-y 0,398±0,052 0,354±0,031 0,432±0,106 0,331 ±0,042 0,366±0,084 0,370±0,051 0,029-1,248
^-регуляторы гуморального иммунного ответа / Th2 regulators of humoral immune response
ИЛ-4* / IL-4* 0,127±0,018 0,097±0,014 0,135±0,037 0,074±0,015 0,120±0,030 0,126±0,025 0,001-0,921
ИЛ-5 / IL-5 0,843±0,076 0,865±0,063 0,890±0,149 0,804±0,071 0,786±0,129 0,940±0,118 0,008-3,546
ИЛ-10 / IL-10 0,097±0,013 0,083±0,008 0,105±0,026 0,073±0,009 0,096±0,019 0,096±0,015 0,001-0,291
ИЛ-13* / IL-13* 0,684±0,068 0,557±0,064 0,783±0,124 0,545±0,065 0,626±0,112 0,556±0,124 0,003-1,401
П р и м е ч а н и е. * - противовоспалительные цитокины. N o t e. * - anti-inflammatory cytokines.
распределения животных в 2 группах по тяжести реакции анафилаксии, выраженной в баллах, устанавливали с помощью х2. Во всех случаях различия признавались достоверными (нуль-гипотеза отвергалась) на уровне значимости р<0,05.
Результаты и обсуждение
На протяжении периода наблюдений крысы обеих групп имели нормальный внешний вид и поведение, поедаемость корма не имела различий между группами, масса тела животных контрольной группы в конце эксперимента (72-й день жизни) находилась в пределах физиологических колебаний и составляла 325±3 г, основной - 318±5 г (р>0,05).
Анализ распределения животных 2 групп по тяжести реакции анафилаксии свидетельствует о достоверном снижении тяжести реакции системной анафилаксии на модельный антиген в основной группе, где тяжелые реакции регистрировались в 2,5 раза реже, чем в контрольной группе (табл. 1). Показатели интенсивности гуморального иммунного ответа - концентрация специфических иммуноглобулинов (^1 + ^4) у крыс контрольной и основной групп до введения разрешающей дозы ОВА не имели статистически значимых различий и не демонстрировали очевидной зависимости от состава рационов (р>0,05) (см. табл. 1). При оценке распределения титров антител внутри каждой группы в зависимости от тяжести анафилактического шока, развившегося у крыс после введения разрешающей
дозы ОВА, не было выявлено статистически значимых различий данного показателя внутри каждой группы, однако отмечена тенденция к повышению титра антител в ряду повышения тяжести анафилактического шока (+)^(++)^(++++) (см. табл. 1). Значения суммы антител IgG1 и IgG4 на следующий день после введения разрешающей дозы также не имели значимых различий между контрольной и основной группами, при распределении внутри группы по степени тяжести анафилактического шока повышение титра антител в ряду усиления шока было практически неразличимо (см. табл. 1).
Для анализа цитокинового профиля крыс контрольной и основной групп был использован референсный контроль, сформированный в процессе собственных экспериментальных исследований на животных 1 вида, пола и возраста с использованием 1 тест-системы (Bio-Plex Pro™ Rat Cytokine 12-Plex) и оборудования, согласно рекомендациям [16, 17]. Следует отметить, что рефе-ренсный контроль включает достаточно широкий диапазон концентраций интерлейкинов, который в полной мере согласуется с данными литературы, свидетельствующими о методологических проблемах при определении четких границ нормы [16-18].
Сравнительная оценка содержания цитокинов в сыворотке крови крыс контрольной и основной групп - регуляторов клеточного (ИЛ-2, ИЛ-12(р70), ИФН-у) и гуморального (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, ИЛ-13) иммунного ответа, не выявила значимых различий. При этом в основной группе отмечено некоторое снижение концентрации цитокинов, отвечающих за формирование иммунного ответа 2-го типа, соответствующего аллергическому
Рис. 3. Тимус: А - контрольная группа; Б - основная группа
Окрашивание гематоксилином и эозином, х100. 1 - трабекула; 2 - мозговое вещество; 3 - корковое вещество.
Fig. 3. Thymus: А - control group; B - main group
H&E, x100. 1 - connective tissue septae; 2 - medulla; 3 - cortex.
варианту реагирования иммунной системы ИЛ-13^ ИЛ-4^ИЛ-10 [19, 20]. При распределении уровней цито-кинов внутри каждой группы в зависимости от тяжести анафилактического шока, развившегося у крыс после введения разрешающей дозы ОВА, не было выявлено ни статистически значимых различий изученных показателей внутри каждой группы, ни сколько-нибудь зна-
чимой корреляции величин анализируемых показателей и интенсивности анафилактического шока. Отмечено снижение концентрации проаллергических цитокинов в сыворотке крови крыс основной группы: ИЛ-4 - в 1,3, ИЛ-10 - в 1,1 и ИЛ-13 - 1,2 раза, не достигающее уровня статистической значимости (р>0,05), а у животных, перенесших легкую степень анафилактической реакции,
Рис. 4. Селезенка: А - контрольная группа; Б - основная группа
Окрашивание гематоксилином и эозином, х100. 1 - белая пульпа; 2 - красная пульпа.
Fig. 4. Spleen: А - control group; B - main group H&E, x100. 1 - white pulp; 2 - red pulp.
Рис. 5. Пейерова бляшка: А - контрольная группа; Б - основная группа
Окрашивание гематоксилином и эозином, х100. 1 - герминативный центр; 2 - мантийная зона; 3 - межфолликулярная зона.
Fig. 5. Peyer's patch: А - control group; B - main group
H&E, x100. 1 - germinal center; 2 - mantle zone; 3 - interfollicular zone.
соответственно в 1,8, 1,4 и 1,4 раза (р>0,05) (табл. 2). Показано, что в развитии аллергической реакции участвуют разные Т-хелперные клоны, однако основными медиаторами формирования и прогрессирования аллергического воспаления выступают проаллергические ТИ2 типа - ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13, которые приводят к активации гуморального иммунного ответа, также играя важную
роль в развитии анафилактической реакции, относящейся к 1-му типу [19]. Аллергическая реакция регулируется цитокиновым каскадом [20], согласно данным литературы, цитокины ТИ2 необходимы во время продукции антиген-специфических IgG [16, 19-23], при этом эффекторами аллергического воспаления служат тучные клетки, которые непосредственно участвуют
Рис. 6. Тимус. Исторический контроль
Окрашивание гематоксилином и эозином, х100. 1 - расширенная трабекула; 2 - мозговое вещество; 3 - корковое вещество.
Рис. 7. Селезенка. Исторический контроль
Окрашивание гематоксилином и эозином, х100. 1 - белая пульпа; 2 - красная пульпа; 3 - делимфотизация.
Fig. 6. Thymus. Historical control
H&E, x100. 1 - expanded connective tissue septae; 2 - medulla; 3 - cortex.
Fig. 7. Spleen. Historical control
H&E, x100. 1 - white pulp; 2 - red pulp; 3 - depletion of white and red pulp.
в дифференцировке ТИ-клеток в ТИ2-клетки, секретируя ИЛ-4, ИЛ-10 и ИЛ-13 и отвечая за развитие аллергии и воспалительной реакции [24, 25]. Среди перечисленных цитокинов важнейшим считается плейотропный проаллергический и противовоспалительный ИЛ-4 -главный индуктор образования ТИ2 и активатор аллергических реакций, продуцируемый тучными клетками и переключающий синтез на ^4 [26, 27]. ИЛ-4 в комбинации с ИЛ-10 индуцирует образование иммуноглобулинов класса ^4, не являясь переключающим фактором для него, ИЛ-10 усиливает продукцию ^4. ИЛ-4 вместе с ИЛ-10 оказывает существенное влияние на развитие, выживание, активность тучных клеток, их гомеостаз и количество в тканях, ингибируя локальное накопление, которые, выступая в роли ключевых игроков в воспалительных процессах, приводят к усилению воспалительных событий [19, 26, 27]. ИЛ-13 обладает схожей с ИЛ-4 биологической активностью, ИЛ-4 отвечает за стимулирование выработки ИЛ-13 тучными клетками, оба цитокина играют важную роль в стимуляции и поддержании аллергической реакции [28-30].
Морфологические исследования органов иммунной системы не выявили различий между группами (рис. 3-6). Структура тимуса у крыс контрольной и основной групп сохранена, деление на дольки, корковое и мозговое вещества четко выражены, капсула и междольковые трабекулы не утолщены (рис. 3А, Б). Гистологическое строение селезенки без особенностей, красная и белая пульпа выражена отчетливо, красная пульпа полнокровна (рис. 4А, Б). Тонкая кишка типичного строения, пейеровы бляшки нормального размера, без очаговых изменений, четко определяются герминативный центр (более светлый), мантийная и межузелковая зоны (рис. 5А, Б). Вместе с тем результаты предыдущих исследований потенциально аллергенных объек-
Сведения об авторах
тов демонстрировали нарушения в лимфоидной ткани на фоне сенсибилизации, чаще всего проявлявшиеся в тимусе расширением трабекул за счет увеличения тучных клеток, цитоплазма которых заполнена гранулами секрета. Данное явление было наиболее выражено вдоль сосудов соединительной ткани междольковых трабекул (рис. 6). Незначительные изменения также были выявлены в морфологической картине селезенки: в лимфоидных фолликулах уменьшалась плотность расположения лимфоцитов, что приводило к умеренной делимфотизации фолликулов (рис. 7) [10, 11]. Исследованиями [31-34] в рамках оценки безопасности объектов с неизвестной аллерген ностью показаны аналогичные патоморфологические изменения в иммунных органах, характерные для реакций гиперчувствительности при антигенной стимуляции в сенсибилизированном организме лабораторных животных.
Следовательно, патоморфология иммунокомпетентных органов (тимус, селезенка, пейеровы бляшки тонкой кишки), наряду с расширенным перечнем показателей иммунного статуса, может быть включена в пул показателей, изучаемых при оценке аллергенного потенциала пищевой продукции нового вида.
Заключение
Таким образом, комплексные исследования влияния насекомых Hermetia illucens на иммунный статус крыс с использованием стандартного протокола аллерголо-гических исследований, дополненного показателями цитокинового профиля и патоморфологической характеристикой лимфоидной ткани иммунокомпетентных органов, не выявили никакого аллергенного действия изученного продукта.
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация):
Требух Марина Дмитриевна (Marina D. Trebukh) - младший научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: trebukh@ion.ru https://orcid.org/0000-0002-4077-1593
Тышко Надежда Валерьевна (Nadezhda V. Tyshko) - доктор медицинских наук, заведующий лабораторией оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: tnv@ion.ru
https://orcid.org/0000-0002-8532-5327
Садыкова Эльвира Олеговна (Elvira O. Sadykova) - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: seo@ion.ru
https://orcid.org/0000-0001-5446-5653
Никитин Николай Сергеевич (Nikolay S. Nikitin) - младший научный сотрудник лаборатории оценки безопасности биотехнологий и новых источников пищи E-mail: nikolay_sergeevich87@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-5091-0991
Гмошинский Иван Всеволодович (Ivan V. Gmoshinski) - доктор биологических наук, главный научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий E-mail: gmosh@ion.ru https://orcid.org/0000-0002-3671-6508
Литература
1. EFSA Panel on GMO (Genetically Modified Organisms). Guidance 18. on allergenicity assessment of genetically modified plants // EFSA
J. 2017. Vol. 15, N 2. Article ID 4862. DOI: https://doi.org/10.2903/ j.efsa.2017.4862
2. EFSA GMO Panel (Genetically Modified Organisms). Workshop on 19. allergenicity assessment — prediction // EFSA Supporting Publications. 2021. Vol. 18, N 8. Article ID 6826E. DOI: https://doi.org/10.2903/ sp.efsa.2021.EN-6826 20.
3. EFSA GMO Panel (Genetically Modified Organisms). Scientific Opinion on development needs for the allergenicity and protein safety assessment of food and feed products derived from biotechnology // EFSA J. 2022. Vol. 20, N 1. Article ID 7044. DOI: https://doi. org/10.2903/j.efsa.2022.7044 21.
4. Safety evaluation of foods derived by modern biotechnology, concepts and principles Organization for Economic Co-operation and Development. Paris : OECD, 1993. 74 p. ISBN: 9264138595.
5. Foods derived from modern biotechnology. Codex Alimentarius. 2nd 22. ed. Rome : Commission Joint FAO/WHO Food Standards Programme, Food and Agriculture Organization, 2004. 51 p. ISBN: 978-92-5105914-2.4. 23.
6. Мозгова Г., Макеева Е., Дромашко С. Генно-инженерные организмы и здоровье // Наука и инновации. 2014. Т. 141, № 11. С. 58-63.
7. Tutelyan V.A. Genetically Modified Food Sources. Safety Assessment
and Control. USA : Elsevier, 2013. 338 p. DOI: https://doi.org/10.1016/ 24. j.carbpol.2014.06.012 ISBN: 978-0-12-405878-1.
8. МетодическиеуказанияМУ2.3.2.3388-16.Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения с комбинированными 25. признаками. Москва : Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителя и благополучия человека, 2016. 27 с.
9. Тутельян В.А. Обеспечение безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов для производства пищевых 26. продуктов // Вестник Российской академии наук. 2017. Т. 87, № 4.
С. 342-347. DOI: https://doi.org/10.7868/S0869587317040090
10. Требух М.Д. Иммунный статус крыс линии Вистар в исследованиях пищевой продукции нового вида: подходы к анализу данных // Вопросы питания. 2023. Т. 92., № 5S. С. 48. DOI: https:// 27. doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5s-034
11. Trebukh M.D., Nikitin N.S., Shestakova S.I., Sadykova E.O. Improvement of immunological research methodology in the system of novel food 28. safety assessment // International Congress: Biotechnology: State of the
Art and Perspectives. Moscow, 31 October — 01 November, 2022. 2022. P. 196-197. DOI: https://doi.org/10.37747/2312-640X-2022-20-195-197
12. Тышко Н.В., Жминченко В.М., Никитин Н.С., Требух М.Д., 29. Шестакова С.И., Пашорина В.А. и др. Комплексные исследования биологической ценности белка личинки Hermetia illucens // Вопросы питания. 2021. Т 90, № 5. С. 49-58. DOI: https:// 30. doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-5-49-58
13. Brostoff J., Challacombe S.J. Food Allergy and Intolerance. USA : W.B. Saunders, 2002. 977 p. ISBN: 9780702020384. 31.
14. Weigle W., Cochrane G., Dixon F. Anaphylactogenic properties of soluble antigen-antibody complexes in the guinea pig and rabbit // J. Immunol. 1960. Vol. 85, N 5. P. 469-477.
15. Коржевский. Д.Э. Морфологическая диагностика. Подготовка 32. материала для гистологического исследования и электронной микроскопии. Санкт-Петербург : Литрес, 2022. 128 с. ISBN: 5040046227, 9785040046225.
16. Арсентьева Н.А., Тотолян А.А. Методические сложности при 33. определениисодержаниянекоторыхцитокиноввпериферической крови практически здоровых лиц // Медицинская иммунология. 2018. Т. 20, № 5. С. 763-774. DOI: https://doi.org/10.15789/1563-0625-2018-5-763-774 34.
17. Radonjic-Hoesli S., Pavlov N., Simon H.U., Simon D. Are blood cyto-kines reliable biomarkers of allergic disease diagnosis and treatment responses // J. Allergy Clin. Immunol. 2022. Vol. 150, N 2. P. 251—258. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jaci.2022.06.008
Platchek M., Lu Q., Tran H., Xie W. Comparative analysis of multiple immunoassays for cytokine profiling in drug discovery // SLAS Discov. 2020. Vol. 25, N 10. Р. 1197-1213. DOI: https://doi. org/10.1177/2472555220954389
Симбирцев А.С. Цитокины в иммунопатогенезе аллергии // РМЖ. Медицинское обозрение. 2021. Т. 5, № 1. С. 32-37. DOI: https://doi.org/10.32364/2587-6821-2021-5-1-32-37 Kordulewska N.K., Cieslinska A., Fiedorowicz E., Jarmoiowska B., Piskorz-Ogorek K., Kostyra E. Cytokines concentrations in serum samples from allergic children — multiple analysis to define biomarkers for better diagnosis of allergic inflammatory process // Immunobiology. 2018. Vol. 23, N 11. P. 648—657. DOI: https://doi.org/10.1016/j.imbio.2018.07.010 Симбирцев А.С., Тотолян А.А. Цитокины в лабораторной диагностике // Клиническая лабораторная диагностика : национальное руководство : в 2 т. Т. II / под ред. В.В. Долгова, В.В. Меньшикова. Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2013. С. 193—217. ISBN: 978-5-9704-2129-1. Морозова О.В., Оспельникова Т.П. Цитокины при аллергических заболеваниях // Молекулярная медицина. 2022. Т. 20, № 2. С. 3—10. DOI: https://doi.org/10.29296/24999490-2022-02-01 Николаева А.М., Бабушкина Н.П., Рябов В.В. Некоторые про- и противовоспалительные цитокины, полиморфные варианты их генов и постинфарктное ремоделирование сердца // Российский кардиологический журнал. 2020. Т. 25, № 10. C. 232—239. DOI: https://doi.org/10.15829/1560-4071-2020-4007 Hwang K.A., Hwang Y.J., Song J. Anti-allergic effect of Aster yomena on ovalbumin-sensitized mouse and RHL-2H3 cells via Th1/Th2 cyto-kine balance // J. Funct. Foods. 2018. Vol. 44. Р. 1—8. DOI: https://doi. org/10.1016/j.jff.2018.02.026
Nedelkopoulou N., Dhawan A., Xinias I., Gidaris D., Farmaki E. Inter-leukin 10: the critical role of a pleiotropic cytokine in food allergy // Allergol. Immunopathol. (Madr.). 2020. Vol. 48, N 1. P. 401—408. DOI: https://doi.org/10.1016/j.aller.2019.10.003
Chenglong L., Chen C., Yan X., Gu S., Jia X., Fu W. et al. Assessment of immune responses and intestinal flora in BALB/c mice model of wheat food allergy via different sensitization methods // Food Sci. Hum. Well. 2023. Vol. 12, N 3. Р. 871—881. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.fshw.2022.09.016
El Ansari Y. S., Kanagaratham C., Oettgen H.C. Mast cells as regulators of adaptive immune responses in food allergy // Yale J. Biol. Med. 2020. Vol. 93, N 5. P. 711—718. PMID: 33380933. Shankar A., McAlees J.W., Lewkowich I.P. Modulation of IL-4/ IL-13 cytokine signaling in the context of allergic disease // J. Allergy Clin. Immunol. 2022. Vol. 150, N 2. P. 266—276. DOI: https://doi. org/10.1016/j.jaci.2022.06.012
McLeod J.J., Baker B., Ryan J.J. Mast cell production and response to IL-4 and IL-13 // Cytokine. 2015. Vol. 75, N 1. P. 57—61. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.cyto.2015.05.019
Oettgen H.C. Mast cells in food allergy: Inducing immediate reactions and shaping long-term immunity // J. Allergy Clin. Immunol. 2023. Vol. 151, N 1. P. 21—25. DOI: https://doi.org/10.1016/joaci.2022.10.003 Nunes V., Andrade C.M., Guerra P.V., Khouri M.I., Galantini M.P.L., da Silva R. A.A. et al. A new experimental model to study shrimp allergy // Immunol. Lett. 2023. Vol. 260. Р. 73—80. DOI: https://doi. org/10.1016/j.imlet.2023.06.007
Стручко Г.Ю., Меркулова Л.М., Кострова О.Ю., Михайлова М.Н., Москвичев Е.В. Морфологическое и иммуногистохимическое исследование тимуса в норме и после применения полиокси-дония // Вестник Чувашского университета. 2012. № 3. С. 525—531. Toyoshima S., Wakamatsu E., Ishida Y., Obata Y., Kurashima Y., Kiyono H., Abe R. The spleen is the site where mast cells are induced in the development of food allergy // Int. Immunol. 2017. Vol. 29, N 1. P. 31—45. DOI: https://doi.org/10.1093/intimm/dxx005 Алексеева Н.Т., Кварацхелия А.Г., Соколов Д.А., Бахмет А.А., Попов М.В., Вердиян Г.Г. и др. Функциональная морфология иммунных структур селезенки при действии повреждающих факторов // Журнал анатомии и гистопатологии. 2021. Т. 10, № 3. С. 91—97. DOI: https://doi.org/10.18499/2225-7357-2021-10-3-91-97
References
EFSA Panel on GMO (Genetically Modified Organisms). Guidance on allergenicity assessment of genetically modified plants. EFSA J. 2017; 15 (2): 4862. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2017.4862 EFSA GMO Panel (Genetically Modified Organisms). Workshop on allergenicity assessment — prediction. EFSA Supporting Publications. 2021; 18 (8): 6826E. DOI: https://doi.org/10.2903/sp.efsa.2021. EN-6826
EFSA GMO Panel (Genetically Modified Organisms). Scientific Opinion on development needs for the allergenicity and protein safety assessment of food and feed products derived from biotechnology. EFSA J. 2022; 20 (1): 7044. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2022.7044 Safety evaluation of foods derived by modern biotechnology, concepts and principles Organization for Economic Co-operation and Development. Paris: OECD, 1993: 74 p. ISBN: 9264138595.
3
2
4
5. Foods derived from modern biotechnology. Codex Alimentarius. 2nd ed. Rome: Commission Joint FAO/WHO Food Standards Programme, Food and Agriculture Organization, 2004: 51 p. ISBN: 978-92-5105914-2.4. 21.
6. Mozgova G., Makeeva E., Dromashko S. Genetically engineered organisms and health. Nauka i innovatsii [Science and Innovation]. 2014; 141 (11): 58-63. (in Russian)
7. Tutelyan V.A. Genetically Modified Food Sources. Safety Assessment 22. and Control. USA: Elsevier, 2013: 338 p. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.carbpol.2014.06.012 ISBN: 978-0-12-405878-1.
8. Methodological guidelines MU 2.3.2.3388-16. Medico-biological safety 23. assessment of genetically engineered modified organisms of plant origin
with combined traits. Moscow: Federal'naya sluzhba po nadzoru v sfere zashchity prav potrebiteley i blagopoluchiya cheloveka, 2016: 27 p. (in Russian)
9. Tutelyan V.A. Ensuring the safety of genetically engineered and modi- 24. fied organisms for food production. Vestnik Rossiiskoy akademii nauk [Bulletin of the Russian Academy of Sciences]. 2017: 87 (4): 342-7. DOI: https://doi.org/10.7868/S0869587317040090 (in Russian)
10. Trebukh M.D. Immune status of Wistar rats in food studies of a new 25. species: approaches to data analysis. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2023; 92 (5S): 48. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2023-92-5s-034 (in Russian)
11. Trebukh M.D., Nikitin N.S., Shestakova S.I., Sadykova E.O. Improve- 26. ment of immunological research methodology in the system of novel food safety assessment. In: International Congress: Biotechnology: State of the Art and Perspectives. Moscow, 31 October - 01 November, 2022. 2022: 196-7. DOI: https://doi.org/10.37747/2312-640X-2022-20-195-197 27.
12. Tyshko N.V., Zhminchenko V.M., Nikitin N.S., Trebukh M.D., Shesta-kova S.I., Pashorina V.A., et al. The comprehensive studies of Hermetia illucens larvae protein's biological value. Voprosy pitaniia [Problems of 28. Nutrition]. 2021; 90 (5): 49-58. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2021-90-5-49-58 in Russian)
13. Brostoff J., Challacombe S.J. Food Allergy and Intolerance. USA: W.B. Saunders, 2002: 977 p. ISBN: 9780702020384. 29.
14. Weigle W., Cochrane G., Dixon F. Anaphylactogenic properties of soluble antigen-antibody complexes in the guinea pig and rabbit.
J Immunol. 1960; 85 (5): 469-77. 30.
15. Korzhevsky D.E. Morphological diagnostics. Preparation of material for histological examination and electron microscopy. Saint Petersburg: Litres, 2022: 128 p. ISBN: 5040046227, 9785040046225. (in Russian) 31.
16. Arsent'eva N.A., Totolyan A.A. Methodological issues of determining concentrations of some cytokines in peripheral blood from healthy individuals. Meditsinskaya immunologiya [Medical Immunology]. 2018;
20 (5): 763-74. DOI: https://doi.org/10.15789/1563-0625-2018-5-763- 32. 774 (in Russian)
17. Radonjic-Hoesli S., Pavlov N., Simon H.U., Simon D. Are blood cyto-kines reliable biomarkers of allergic disease diagnosis and treatment responses. J Allergy Clin Immunol. 2022; 150 (2): 251-8. DOI: https:// doi.org/10.1016/j.jaci.2022.06.008 33.
18. Platchek M., Lu Q., Tran H., Xie W. Comparative analysis of multiple immunoassays for cytokine profiling in drug discovery. SLAS Discov. 2020; 25(10): 1197-213. DOI:https://doi.org/10.1177/2472555220954389
19. Simbirtsev A.S. Cytokines and their role in immune pathogenesis of 34. allergy. RMZh. Meditsinskoe obozrenie [RMJ. Medical Review]. 2021;
5 (1): 32-7. DOI: https://doi.org/10.32364/2587-6821-2021-5-1-32-37 (in Russian)
20. Kordulewska N.K., Cieslinska A., Fiedorowicz E., Jarmoiowska B., Piskorz-Ogorek K., Kostyra E. Cytokines concentrations in serum
samples from allergic children - multiple analysis to define biomarkers for better diagnosis of allergic inflammatory process. Immunobiology. 2018; 23 (11): 648-57. DOI: https://doi.org/10.1016Zj.imbio.2018.07.010 Simbirtsev A.S., Totolyan A.A. Cytokines in laboratory diagnostics. In V.V. Dolgov, V.V. Men'shikov (eds). Clinical Laboratory Diagnostics: National Manual. In 2 vols. Vol. II. Moscow: GEOTAR-Media. 2013 193-217. ISBN: 978-5-9704-2129-1. (in Russian)
Morozova O.V., Ospel'nikova T.P. Cytokines in allergic diseases. Molekulyarnaya meditsina [Molecular Medicine]. 2022; 20 (2): 3-10. DOI: https://doi.org/10.29296/24999490-2022-02-01 (in Russian) Nikolaeva A.M., Babushkina N.P., Ryabov V.V. Some pro- and anti-inflammatory cytokines, their genetic polymorphism and postinfarct cardiac remodeling. Rossiyskiy kardiologicheskiy zhurnal [Russian Journal of Cardiology]. 2020; 25 (10): 232-9. DOI: https://doi. org/10.15829/1560-4071-2020-4007 (in Russian) Hwang K.A., Hwang Y.J., Song J. Anti-allergic effect of Aster yomena on ovalbumin-sensitized mouse and RHL-2H3 cells via Th1/Th2 cytokine balance. J Funct Foods. 2018; 44: 1-8. DOI: https://doi. org/10.1016/j.jff.2018.02.026
Nedelkopoulou N., Dhawan A., Xinias I., Gidaris D., Farmaki E. Interleukin 10: the critical role of a pleiotropic cytokine in food allergy. Allergol Immunopathol (Madr). 2020; 48 (1): 401-8. DOI: https://doi. org/10.1016/j.aller.2019.10.003
Chenglong L., Chen C., Yan X., Gu S., Jia X., Fu W., et al. Assessment of immune responses and intestinal flora in BALB/c mice model of wheat food allergy via different sensitization methods. Food Sci Hum Well. 2023; 12 (3): 871-81. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.fshw.2022.09.016
El Ansari Y. S., Kanagaratham C., Oettgen H.C. Mast cells as regulators of adaptive immune responses in food allergy. Yale J Biol Med.
2020; 93 (5): 711-8. PMID: 33380933.
Shankar A., McAlees J.W., Lewkowich I.P. Modulation of IL-4/ IL-13 cytokine signaling in the context of allergic disease. J Allergy Clin Immunol. 2022; 150 (2): 266-76. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.jaci.2022.06.012
McLeod J.J., Baker B., Ryan J.J. Mast cell production and response to IL-4 and IL-13. Cytokine. 2015; 75 (1): 57-61. DOI: https://doi. org/10.1016/j.cyto.2015.05.019
Oettgen H.C. Mast cells in food allergy: Inducing immediate reactions
and shaping long-term immunity. J Allergy Clin Immunol. 2023; 151
(1): 21-5. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jaci.2022.10.003
Nunes V., Andrade C.M., Guerra P.V., Khouri M.I., Galantini M.P.L.,
da Silva R.A.A., et al. A new experimental model to study shrimp
allergy. Immunol Lett. 2023; 260: 73-80. DOI: https://doi.org/10.1016/
j.imlet.2023.06.007
Struchko G.Yu., Merkulova L.M., Kostrova O.Yu., Mikhaylova M.N., Moskvichev E.V. Morphological and immunohistochemical study of the thymus in the norm and after the use of polyoxidonium (literature review). Vestnik Chuvashskogo universiteta [Bulletin of Chuvash University]. 2012; (3): 525-31. (in Russian)
Toyoshima S., Wakamatsu E., Ishida Y., Obata Y., Kurashima Y., Kiyono H., Abe R. The spleen is the site where mast cells are induced in the development of food allergy. Int Immunol. 2017; 29 (1): 31-45. DOI: https://doi.org/10.1093/intimm/dxx005
Alekseeva N.T., Kvaratskheliya A.G., Sokolov D.A., Bakhmet A.A., Popov M.V., Verdiyan G.G., et al. Functional morphology of the immune structures of the spleen under the influence of damaging factors. Zhurnal anatomii i gistopatologii [Journal of Anatomy and Histopa-thology]. 2021; 10 (3): 91-7. DOI: https://doi.org/10.18499/2225-7357-2021-10-3-91-97 (in Russian)
