CC BY
31
ГИГИЕНА ПИТАНИЯ
Для корреспонденции
Гмошинский Иван Всеволодович - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБНУ «НИИ питания» Адрес: 109240, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14 Телефон: (495) 698-53-71 E-mail: gmosh@ion.ru
А.А. Шумакова, В.А. Шипелин, Э.Н. Трушина, О.К. Мустафина, И.В. Гмошинский, Р.А. Ханферьян, С.А. Хотимченко, В.А. Тутельян
#
Токсикологическая оценка наноструктурного диоксида кремния. IV. Иммунологические и аллергологические показатели у животных, сенсибилизированных пищевым аллергеном, и заключительное обсуждение
Toxicological assessment of nanostructured silica. IV. Immunological and allergological indices in animals sensitized with food allergen and final discussioin
A.A. Shumakova, V.A. Shipelin, E.N. Trushina, O.K. Mustafina, I.V. Gmoshinsky, R.A. Khanferyan, S.A. Khotimchenko, V.A. Tutelyan
102
ФГБНУ «НИИ питания», Москва Institute of Nutrition, Moscow
Данная работа является заключительной в серии публикаций по оценке подострой пероральной токсичности наноструктурного диоксида кремния (SiO). Использовали коммерческий нанопорошок SiO2, полученный гидролизом тетрахлорсилана в газовой фазе, с размером первичных наночастиц (НЧ) 5-30 нм. Эксперимент проведен на 95 крысах-самцах линии Вистар исходной массой 150-180 г, разделенных на 6 групп численностью 25 (1-я группа), 26 (2-я группа), 11 (3-6-я группы) особей. Водную дисперсию наночастиц SiO2 после обработки ультразвуком вводили животным 2, 4 и 6-й групп в течение 28 дней внутрижелу-дочно через зонд в дозе 100 мг на 1 кг массы тела в день. Животные 1, 3 и 5-й групп получали деионизованную воду. На 1, 3, 5 и 21-й дни эксперимента крыс 1, 2, 3 и 4-й групп внутрибрюшинно сенсибилизировали модельным пищевым аллергеном овальбумином (ОВА), адсорбированным на гидроксиде алюминия. Внутривенное введение разрешающей дозы ОВА крысам 1-й и 2-й групп выполняли на 29-й день. В этот же период у животных 3-6-й групп отбирали кровь для анализа показателей клеточного иммунитета. Оценивали тяжесть реакции системной анафилаксии, уровень специфических антител класса IgG к ОВА у сенсибилизированных животных, состояние эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов периферической крови с использованием стандартных методов. С помощью проточной цитофлуориметрии оценивали содержание в общей популяции лимфоцитов В-лимфоцитов (CD45RA+), Т-лимфоци-тов (CD3+), Т-хелперов (CD4+), Т-цитотоксических лимфоцитов (CD8+), NK-клеток (CD161a+), активность фагоцитоза нейтрофильных лейкоцитов в отношении частиц латекса, определяли уровни цитоки-нов TNFa и IL-10 в сыворотке крови иммуноферментным методом. В результате показано, что НЧ SiO2, в дозе 100 мг на 1 кг массы тела
А.А. Шумакова, В.А. Шипелин, Э.Н. Трушина и др.
не оказывают достоверного влияния на усиление реакции активного анафилактического шока и уровень специфических антител. Изменения в показателях клеточного иммунитета под действием наноматериала имели сходную направленность у сенсибилизированных и несенсибили-зированных животных и были более выражены у последних. На основе обсуждения полученных результатов вместе с данными предыдущих публикаций сделан вывод, что пероральная максимальная недействующая доза (ЫОАЕЬ) наноструктурного 5102 находится в интервале до 100 мг на 1 кг массы тела в сутки в условиях его ежедневного поступления в течение 1-3 мес.
Ключевые слова: диоксид кремния, наночастицы, крысы, подост-рая токсичность, ЫОАЕЬ, системная анафилаксия, клеточный иммунитет, цитокины, антитела, фагоцитоз
This paper is the final in a series of publications on the assessment of subacute oral toxicity of nanostructured silica (SiO2). Preparation studied was a commercial nanopowder of SiO2, obtained by hydrolysis of tetrachlorosilane in the gaseous phase with the size of primary nanoparticles (NPs) of 5-30 nm. The experiment was conducted in 95 male Wistar rats weighing 150-180 g, divided into 6groups numbering25 (group 1), 26 (group 2), 11 (groups3-6) of animals. The aqueous dispersion of SO2 after sonication was administered to animals of groups 2, 4 and 6 for 28 days by intragastric gavage at a dose of 100 mg/kg of body weight per day. Animals of groups 1,3, and 5 were treated with deionized water. On the 1st, 3d, 5th and 21st day of experiment the rats of groups 1, 2,3 and 4 were sensitized intraperitoneally with hen's egg ovalbumin (OVA) adsorbed to aluminum hydroxide. Intravenous administration of the challenge dose OVA to rats in groups 1 and 2 was carried out on the 29th day. In the same period animals of groups 3-6 were bled for analysis of cellular immunity. There were evaluated the severity of systemic anaphylaxis reaction, the level of specific IgG antibodies to OVA in sensitized animals, state of erythrocytes, platelets and leukocytes of peripheral blood using standard methods. Using flow cytometry there were measured contents of lymphocyte populations of B-lymphocytes (CD45RA+), total T-lymphocytes (CD3+), T-helper cells (CD4+), T-cytotoxic cells (CD8+), NK-cells (CD161a+), phagocytic activity of polymorphonuclear leukocytes in respect of latex particles. Serum levels of TNFa and IL-10 cytokines were determined by ELISA. The result showed that NPs SiO2, at dose of 100 mg/kg body weight had no any marked effect on severity of active anaphylactic shock and level of specific antibodies. The changes in cellular immunity under the influence of nano-material had similar direction in sensitized and non-sensitized animals and were more pronounced in the latter. Based on the discussion of the results, together with data from previous publications it was concluded that oral maximum level without observable adverse effect (NOAEL) of nanostructured SiO2 is located below 100 mg/kg body weight.
Keywords: silica, nanoparticles, rats, subacute toxicity, NOAEL, systemic anaphylaxis, cellular immunity, cytokines, antibodies, phagocytosis
Наноструктурный аморфный диоксид кремния БЮ2 представляет собой крупнотоннажный продукт современной нанотехнологии, широко применяющийся в настоящее время в качестве пищевой добавки. Имеющиеся сведения о возможном неблагоприятном действии этого наноматериала (НМ) на организм лабораторных животных, полученные в ряде работ [1-7], неоднозначны.
Возможной причиной этих расхождений являются различия в свойствах тестированных НМ, которые по своим физико-химическим характеристикам значительно отличались от наноструктурного БЮ2, используемого в пищевой промышленности, а также в недостаточной чувствительности изучаемых биомаркеров токсического действия. В предыдущих публикациях [8-10] нами были пред-
103
ГИГИЕНА ПИТАНИЯ
#
ставлены данные о подострой пероральной токсичности БЮ2 с диаметром наночастиц (НЧ) в пределах 5-30 нм в 92-дневном эксперименте на крысах. При этом был показан дисбаланс иммунного ответа при дозе НМ 100 мг на 1 кг массы тела. Другие возможные эффекты иммунотоксического действия НМ могут проявляться в нагрузочных модельных экспериментах, т.е. в условиях, когда система иммунитета функционирует с напряжением. Так, например, есть основания ожидать усиление под действием НЧ сенсибилизации пищевыми и ато-пическими аллергенами [11]. Целью настоящей работы является оценка влияния подострого перо-рального введения НЧ БЮ2 на показатели клеточного и гуморального иммунитета у крыс в условиях нагрузки модельным пищевым антигеном.
Материал и методы
Наноструктурный БЮ2, представляющий собой порошкообразный продукт газофазного гидролиза тетрахлорсилана высокой чистоты, был приобретен в фирме ООО «Силика» (Россия) под торговым наименованием «Орисил 300» по ТУ 24.1-31695418-002-2003. Согласно представленным в предыдущей публикации [8] данным исследования образца методами трансмиссионной электронной микроскопии, атомно-силовой микроскопии, спектроакустики и динамического лазерного светорассеяния, размер первичных НЧ образца составлял от 5 до 30 нм. Частицы были непрочно агрегированы в порошке в ассоциаты микронного размера, разрушающиеся до частиц размером <100 нм в результате обработки ультразвуком в водной суспензии.
Эксперименты проведены на 95 крысах-самцах линии Вистар исходной массой тела 150-180 г, разделенных на 6 групп численностью 25 (1-я группа), 26 (2-я группа), 11 (3-6-я группы) особей; средняя исходная масса тела животных во всех группах различалась недостоверно. Выбор периода введения НМ животным (28 дней) обусловлен временем развития аллергической сенсибилизации в примененной стандартной модели системной анафилаксии. На протяжении этого срока животные всех групп получали стандартный рацион вивария ФГБНУ «НИИ питания» на основе натуральных пищевых продуктов, сбалансированный по основным макро- и микронутриентам [12]. Крыс размещали в клетках группами по 3 особи; рацион и воду животные получали в режиме свободного неограниченного доступа. 1% водную дисперсию НЧ БЮ2, предварительно обработанную ультразвуком (частота 44 кГц, удельная мощность 1 Вт/мл, время 5 мин, температура +2 °С), вводили крысам 2, 4 и 6-й групп ежедневно внутрижелудоч-но через зонд в дозе 100 мг (10 мл) на 1 кг массы
тела. Крысы 1, 3 и 5-й групп получали в тех же объемах носитель НМ - деионизованную воду. На 1, 3 и 5-й день эксперимента крыс 1, 2, 3 и 4-й групп внутрибрюшинно иммунизировали по схеме [13] дозой 100 мкг 5-кратно перекристаллизованного овальбумина куриного яйца (ОВА), адсорбированного на 10 мг свежеосажденного гидроксида алюминия. На 21-й день вводили дополнительно еще 10 мкг ОВА в тех же условиях для индукции вторичного иммунного ответа.
По окончании периода кормления животных на 29-й день эксперимента у крыс 1-й и 2-й групп отбирали по 0,5 мл крови из хвостовой вены для определения антител, после чего вводили внутривенно по 6 мг на 1 кг массы тела ОВА в стерильном апирогенном 0,15 М NaCl. Раствор белка перед внутривенным введением предварительно фильтровали через мембранный фильтр с порами 0,22 мкм. Развитие симптомов активного анафилактического шока (ААШ) наблюдали в течение 24 ч после введения разрешающей дозы; тяжесть реакции оценивали в соответствии со шкалой: «0» - нет реакции; «+» - озноб, одышка, кожный зуд; «++» - слабость, атаксия, цианоз конечностей; «+++» - судороги, паралич; «++++» - летальный исход. Выживших животных 1-й и 2-й групп выводили из эксперимента путем ингаляции летальной дозы СО2. Крыс 3-6-й групп выводили из эксперимента путем обескровливания из нижней полой вены под глубокой эфирной анестезией. Кровь отбирали дробно в антикоагулянт (0,01% по массе трикалиевой соли ЭДТА) для определения гематологических и имммунологических показателей и в стерильную сухую пробирку для определения в сыворотке цитокинов.
Интенсивность гуморального иммунного ответа к ОВА у крыс 1-й и 2-й групп оценивали по концентрации циркулирующих специфических IgG антител с помощью непрямого твердофазного имму-ноферментного теста (ИФА) на полистироле [14]. Ответ антител анализировали в показателях уровня антител в сыворотке крови (мг/см3), десятичного логарифма концентрации и величины оптической плотности в реакции ИФА за вычетом фона (неспецифической сорбции) контрольного образца. Определение цитокинов IL-10 и TNFa в сыворотке крови крыс 3-6-й групп проводили с использованием коммерческих наборов «Bioscience» («Bender MedSystems GmbH», Австрия) в соответствии с рекомендациями фирмы изготовителя.
Экспрессию рецепторов CD45RA, CD3, CD4, CD8, CD161a на лимфоцитах (Лф) периферической крови крыс 3-6-й групп определяли методом прямого иммунофлуоресцентного окрашивания клеток цельной крови с использованием панели моноклональных антител, конъюгированных с флуоресцентными красителями: FITC, PC7, APC (IO Test, «Beckman Coulter», США). Содержание
104
CD45RA+-^eTOK (B-Лф), CD3+ (Т-Лф) и CD161a+ (естественных киллеров) выражали в процентах от общего числа проанализированных клеток; содержание CD3+CD4+ (Т-хелперов) и CD3+CD8+ (Т-цитотоксических Лф) выражали в процентах от общего числа CD3+-клеток. Рассчитывали имму-норегуляторный индекс (ИРИ), представляющий собой отношение количества CD4+/CD8+ Лф. Измерения проводили на проточном цитофлуориметре FC-500 («Beckman Coulter», США) по стандартной методике [14].
Изучение фагоцитарной активности нейтрофиль-ных лейкоцитов периферической крови выполняли по стандартной методике [15] с помощью набора реагентов «Phagocytosis Assay Kit» (IgG FITC) («Cayman Chemical Company», США). Объектом фагоцитоза служат частицы латекса, опсонизиро-ванные IgG FITC. Клеточную суспензию с добавлением латекса инкубировали с цельной кровью животных в течение 30 мин в двух пробирках. Анализ проб проводили на проточном цитофлуо-риметре по программе Cytomics CXP Software. Популяцию нейтрофильных лейкоцитов выделяли при помощи гейтирования по параметрам малоуглового (FS) и бокового (SS) светорассеяния, после чего оценивали число фагоцитировавших клеток по величине флуоресценции FITC. Анализ проводили дважды: в присутствии и в отсутствие стимулятора фагоцитоза - форбол-12-миристат-13-ацетата (ФМА), после чего рассчитывали индекс стимуляции для каждого изученного образца крови.
Гематологические показатели определяли на гематологическом анализаторе «Coulter AC TTM 5 diff OV» («Beckman Coulter», США) со стандартным набором реагентов («Beckman Coulter», Франция). Определяемые параметры включали количество эритроцитов, лейкоцитов, концентрацию гемоглобина, показатель гематокрита, средний объем эритроцита, среднее содержание гемоглобина в эритроците, среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците, лейкоци-
тарную формулу, количество тромбоцитов, средний объем тромбоцита, относительный объем тромбоцитов в образце цельной крови.
Статистическая обработка результатов эксперимента проведена с использованием пакета программ SPSS 18.0 согласно ANOVA (факторный анализ), f-критерию Стьюдента, непараметрическим ранговым критериям Манна-Уитни и х2; критерию U углового преобразования Фишера для долевых показателей. Различия признавали достоверными при уровне значимости p<0,05.
Результаты и обсуждение
На протяжении 28 дней введения НЧ SiO2 1 крыса погибла во 2-й группе и 1 в 6-й группе. На секции выявлены признаки двусторонней пневмонии, что могло быть связано со случайной аспирацией этими животными вводимой суспензии НЧ SiO2 в дыхательные пути. Остальные животные имели нормальный внешний вид, активность, признаков заболеваемости не выявлено. Как видно из данных, представленных в табл. 1, средняя масса тела крыс 1-й и 2-й групп по окончании эксперимента достоверно не различалась, что свидетельствует об отсутствии влияния НМ на рост животных.
Данные о тяжести реакции системной анафилаксии (% летальных и тяжелых реакций, величина анафилактического индекса), представленные в табл. 1, свидетельствуют, что у животных, получавших в течение месяца НЧ SiO2 в дозе 100 мг на 1 кг массы тела в сутки, наблюдается увеличение тяжести аллергической реакции, которое, однако, остается статистически недостоверным (р>0,05). То же можно отметить и в отношении уровня антител к ОВА, выраженного тремя разными показателями (см. табл. 1). Как следует из данных рис. 1, у животных 2-й группы, получавших наноструктур-ный SiO2, наблюдается меньшее число легких (+) и
Таблица 1. Сравнение показателей активного анафилактического шока и ответа антител у животных 1-й и 2-й групп (М±т)
Показатель Группа животных Достоверность различия, р Примечание
1-я группа (n=24) 2-я группа (л=25)
Масса тела, г 295,5±4,4 284,7±4,2 >0,05* -
ААШ, летальность (4+), % 33,0 48,0 >0,05** -
ААШ, тяжелые реакции (3+ и 4+), % 33,0 48,0 >0,05** Все животные с тяжелой реакцией ААШ погибли
Анафилактический индекс 2,29 2,44 >0,05*** -
Уровень ^ АТ к ОВА, мг/мл 5,53±0,90 6,14±0,98 >0,05* >0,05*** -
Уровень ^ АТ к ОВА, ед. опт. плотности при 492 нм 1,316±0,043 1,345±0,038 >0,05* >0,05*** -
1д [АТ к ОВА] 0,580±0,088 0,637±0,081
П р и м е ч а н и е. * - ^критерий Стьюдента; ** - критерий и углового преобразования Фишера; *** - критерий Манна-Уитни. Вопросы питания. Том 84, № 5, 2015 105
ГИГИЕНА ПИТАНИЯ
#
е
+1
I
со
° о
О о^
# тТ
1- -о
>5 С
аз к
= ■&
6 СЭ 1— ж -аз .а
X £
те;
й о.
* I
о О о ^
• 4 I
со О ■
га ■&
га ' ■&
2 ^ ° | §
е«<
Тяжесть ААШ
6050403020100-
48
38
0
29
33
20
16 16
0
0
I
>х х а 12
X &
>х *
о <в
:т X
а.
(О
а
(О
с
<в
I
>х 5
.
12 5
.
ГО-
СП 5 -О
0
<в <в
5
1
(О
5
.
С
1-я группа 2-я группа
□ 0 □ + ■ ++ 0 ++++
Рис. 1. Распределение животных 1-й и 2-й групп по тяжести реакции активного анафилактического шока, выраженной в баллах
По оси ординат - число животных в %. Тяжесть реакции в баллах: 0; +; ++; ++++.
средней тяжести (++) аллергических реакций, что, однако, компенсируется большим числом отсутствующих реакций (0) в сравнении с 1-й группой, получавшей воду. В целом оба распределения животных по тяжести шока статистически достоверно не различаются (р>0,05) согласно многомерному критерию х2. Таким образом, эффект усиления аллергизации животных модельным пищевым аллергеном ОВА при воздействии наночастиц БЮ2 в дозе 100 мг на 1 кг массы тела оказывается слабо (маргинально) выраженным, и данная доза может быть принята в качестве максимальной недействующей (NOAEL).
Полученный результат качественно совпадает с ранее установленным отсутствием аллергизи-рующего действия при пероральном введении НЧ различных типов на фоне парентеральной сенсибилизации модельным пищевым антигеном. В то же время имеются данные о том, что НЧ БЮ2 при интраназальном и ингаляционном введении мышам и крысам усиливают их аллергическую чувствительность к ОВА [16, 17]. При парентеральном введении некоторые оксидные НЧ активируют калликреин-кининовую систему [18] или являются гистаминолибераторами [19]. Можно предположить, что решающую роль при этом, по-видимому, играет путь введения НМ. Проаллергенное действие ингалируемых НЧ, особенно производимых в промышленных масштабах, несомненно, необходимо учитывать при установлении гигиенических нормативов их безопасного содержания в воздухе рабочей зоны, в то время как для НЧ, содержащихся в пище и питьевой воде, такого рода риски, по-видимому, являются значительно меньшими.
Изучение гематологических параметров у крыс 3-6-й групп, подвергшихся сенсибилизации и воздействию НМ, показало, что средние показа-
106
Таблица 3. Показатели, характеризующие состояние системы клеточного иммунитета у крыс 3-6-й групп (М±т)
Группа животных п Сенсибилизация +/- Доза НМ, мг на 1 кг массы тела Показатель
число CD45RA+-клеток ^-лимфоцитов), % число CD3+- клеток (Т-лимфо-цитов), % число CD3+CD4+-клеток (Т-хелпе-ров), % число CD3+CD8+- клеток (Т-цитоток-сических), % CD4/CD8 число CD161a+-клеток (естественных киллеров), %
3-я 10 + 0 37,5±2,5 47,5±2,6 52,5±4,3 44,85±4,5 1,42±0,29 5,13±0,77
4-я 10 + 100 36,8±3,2 50,8±3,7 49,4±3,2 48,25±3,2 1,10±0,15 5,18±0,44
5-я 10 - 0 36,8±3,3 49,9±2,2 54,2±3,3 43,15±3,2 1,38±0,19 4,32±0,69
6-я 9 - 100 28,7±3,0 56,9±3,0 42,7±3,8 56,35±3,7 0,82±0,12 7,58±0,93
Тест на однородность распределения, А1\ША, р >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,021
Достоверность попарного сравнения для групп, р* 3-4-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
5-6-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 0,035 0,014 0,026 0,011
3-5-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
4-6-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 0,039/0,037
Факторный анализ, А1\ША, р По фактору наличия НЧ >0,05 >0,05 >0,05 0,034 0,033 0,042
По фактору сенсибилизации >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
тели, характеризующие состояние эритроцитов, только очень незначительно (в пределах 3-5%) различались между сравниваемыми группами (данные не показаны). Было отмечено незначительное, но достоверное (р<0,05, АЫОУА) снижение концентрации гемоглобина в крови (на 4%) и в эритроците (на 3%) у сенсибилизированных животных в сравнении с несенсибилизирован-ными. Какого-либо влияния НМ на состояние эритроцитов как у сенсибилизированных, так и у несенсибилизированных животных не выявлено. Исследование лейкоцитарной формулы животных (табл. 2) показало, что сенсибилизация и месячное введение НМ не оказывало ни какого влияния на эти показатели, за исключением достоверного повышения относительного содержания лимфоцитов вследствие сенсибилизации на фоне введения НЧ БЮ2. Исходя из данных табл. 3 можно предположить, что источником такого увеличения является, по-видимому, возрастание числа В-клеток, доля которых в общем пуле у сенсибилизированных животных, получавших НЧ, возрастает. В отсутствие приема НМ подобный эффект не наблюдается.
Основным фактором, достоверно влияющим на параметры тромбоцитов животных (см. табл. 2), является сенсибилизация, тогда как НЧ в значительно меньшей степени влияют на этот показатель так как различие подтверждается по данным АЫОУА, но не при парном сравнении). Можно
заключить, что для системы тромбоцитов NOAEL по наноразмерному БЮ2 в ходе месячного приема составляет не менее 100 мг на 1 кг массы тела.
Основное наблюдение, которое может быть сделано из оценки параметров системы клеточного иммунитета животных (см. табл. 3), состоит в том, что так же, как и в результате 3-месячного введения, 1-месячное зондовое введение НЧ БЮ2 в дозе 100 мг на 1 кг массы тела у несенсибили-зированных животных приводит к достоверному снижению числа Т-хелперов, возрастанию количества Т-цитотоксических Лф и уменьшению ИРИ. Таким образом, подтверждается ранее сделанный вывод о том, что Т-клеточное звено иммунитета, по-видимому, является наиболее чувствительной мишенью воздействия изучаемых НЧ. Однако на фоне сенсибилизации эти изменения оказываются смазанными и приобретают характер статистически недостоверной тенденции. Таким образом, усиление дисбаланса иммунного ответа под действием НЧ БЮ2 в условиях сенсибилизации пищевым белком, во всяком случае, не наблюдается. Заслуживает внимания достоверное (р<0,05) и весьма выраженное (на 75%) возрастание числа естественных киллеров (CD161a+) в результате воздействия НЧ у несенсибилизированных животных. На фоне сенсибилизации данный эффект практически не проявляется. Вместе с тем эти изменения могут рассматриваться как активация клеточного звена врожденного иммунитета под действием НЧ,
107
ГИГИЕНА ПИТАНИЯ
Таблица 4. Фагоцитарная активность нейтрофильных лейкоцитов у животных 3-6-й групп (М±т)
Группа животных Сенсибилизация +/- Доза НМ, мг на 1 кг массы тела п Показатель
фагоцитарная активность индекс стимуляции
3-я + 0 10 92,8+1,1 60,6+9,4
4-я + 100 10 93,3+0,7 50,5+6,5
5-я - 0 9 92,3+1,1 54,0+8,4
6-я - 100 9 91,3+0,8 38,8+2,3
Тест на однородность распределения, А1\ША, р >0,05 >0,05
Достоверность попарного сравнения для групп, р* 3-4-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
5-6-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
3-5-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
4-6-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
Факторный анализ, А1\ША, р По фактору наличия НЧ >0,05 >0,05
По фактору сенсибилизации >0,05 >0,05
#
25,0 20,0 15,0 10,0 5,0 0,0
3-я
4-я 5-я
Группы
а
V.
2
6-я
25,0 20,0
- 15,0
- 10,0
5,0 -| 0,0-
3-я
4-я 5-я
Группы
б
Рис. 2. Уровень цитокинов !1_-10 (а) и Т^а (б) в сыворотке крови крыс 3-6-й групп
По оси абсцисс - номера групп; по оси ординат - концентрация цитокинов, пг/мл, М±т.
I
6-я
т.е. не может быть интерпретировано как неблагоприятное (вредное). Поэтому достаточных оснований для снижения величины NOAEL по данному показателю, по-видимому, нет.
Как следует из данных табл. 4, базальные показатели активности фагоцитоза нейтрофильных лейкоцитов у крыс 3-6-й групп практически не различались. Индекс стимуляции фагоцитоза под действием ФМА проявлял тенденцию к снижению в 6-й группе, получавшей НЧ БЮ2 в отсутствие сенсибилизации; различие с 5-й группой, однако было недостоверным (р>0,05). При сравнении аналогичных групп сенсибилизированных животных (3-й и 4-й) такой эффект практически не был заметен. Факторный анализ показал отсутствие влияния на показатели фагоцитоза со стороны как сенсибилизации, так и приема НМ.
Анализ содержания цитокинов в сыворотке крови животных (рис. 2) показал, что имеется тенденция к снижению концентрации ^-10 при введении НЧ БЮ2 у сенсибилизированных крыс и к возраста-
108
нию уровня TNFa у несенсибилизированных (см. рис. 2). Однако указанные различия были недостоверными (р>0,05). В предыдущей работе [10] было выявлено значительное увеличение уровня TNFa в сыворотке крови крыс, получавших нанострук-турный БЮ2 в дозе 100 мг на 1 кг массы тела в сутки в течение 3 мес; 28-дневный период приема НМ, по-видимому, недостаточен для развития подобного эффекта.
Общий вывод, который может быть сделан из полученных результатов, заключается в том, что 28-дневное введение наноструктурного БЮ2 в максимальной изученной дозе не приводит к достоверному увеличению аллергической чувствительности к ОВА. В то же время наблюдаемые при этом изменения в состоянии иммунной системы: в дисбалансе CD4+- и CD8+-клеток, - во всяком случае не усиливаются в условиях антигенной нагрузки. Таким образом, данные модельного нагрузочного эксперимента не выявляют дополнительных признаков иммунотоксического дейс-
А.А. Шумакова, В.А. Шипелин, Э.Н. Трушина и др.
твия наноструктурного SiO2 и не дают оснований для пересмотра ранее установленной оценки NOAEL.
В заключение необходимо остановиться на общем анализе данных по оценке изменений биологических маркеров токсичности наноструктурного SiO2, наблюдающихся при подострой пероральной экспозиции этим НМ [8-10]. Их сводка представлена в табл. 5. Как видно из этих данных, для ряда выявленных эффектов НМ отсутствует четкая зависимость от дозы, либо наблюдаемые сдвиги не могут быть однозначно интерпретированы как неблагоприятные, что не соответствует существующему определению NOAEL. Исключение составляют эффекты в отношении кле-
точного звена системы иммунитета, для которых, во-первых, существует четкая зависимость от дозы, т.е. они проявляются в максимальной степени при наибольшей дозе НЧ БЮ2, и, во-вторых, их направленность (особенно снижение числа Т-хелперов и увеличение выработки провоспалительного TNFa) свидетельствует о наличии провоспалитель-ного влияния. Отсутствие достоверных сдвигов этих показателей в группе животных, получавших НМ в дозе 10 мг на 1 кг массы тела, позволяет заключить, что величина пероральной NOAEL для наноструктурного БЮ2 находится в интервале до 100 мг на 1 кг массы тела в сутки в условиях его ежедневного поступления в течение 1-3 мес.
Таблица 5. Сводная таблица эффектов подострого пеорального введения наноструктурного SiO2 у крыс в 92- и 28-дневном экспериментах
Показатель Наличие (+) Эффект может (+) Оценка для Примечание
или или не может (-) NOAEL
отсутствие (-) быть интерпрети-
эффекта рован как вредный
Прирост массы тела + - >100 мг/кг -
Относительная масса органов ? Нет зависимос-
ти от дозы НМ
Проницаемость кишечного барьера - - >100 мг/кг -
Система детоксикации ксенобиотиков
Цитохром Р450 - - >100 мг/кг
Цитохром Ь5 CYP 1A1 + - >100 мг/кг >100 мг/кг
CYP 1A2 - - >100 мг/кг
CYP 2B1 + + ? Нет зависимости от дозы НМ
Глутатион-Б-трасфераза УДФ-глюкуронозилтрансфераза + - >100 мг/кг >100 мг/кг
Активность лизосомальных гидролаз:
общая - - >100 мг/кг -
неседиментируемая - - >100 мг/кг
Диеновые конъюгаты ПНЖК плазмы крови + - >100 мг/кг
Активность антиоксидантных ферментов - - >100 мг/кг
Небелковые тиолы печени - - >100 мг/кг -
Биохимические показатели крови
АЛТ + - >100 мг/кг
АСТ - - >100 мг/кг
Альбумин + + ? Нет зависимости от дозы НМ
Белок общий + + ? То же
Глюкоза + + ? То же
Креатинин - - >100 мг/кг
Мочевая кислота - - >100 мг/кг
Щелочная фосфатаза - - >100 мг/кг
Общий гемоглобин - - >100 мг/кг -
Гематологические показатели (эритроциты)
Концентрация гемоглобина - - >100 мг/кг
Общее количество эритроцитов Показатель гематокрита Средний объем эритроцита Содержание гемоглобина в эритроците Концентрация гемоглобина в эритроците + + + - >100 мг/кг >100 мг/кг >100 мг/кг >100 мг/кг >100 мг/кг -
109
ГИГИЕНА ПИТАНИЯ
Окончание табл. 5
Показатель Наличие (+) Эффект может (+) Оценка для Примечание
или или не может (-) NOAEL
отсутствие (-) быть интерпрети-
эффекта рован как вредный
Общее количество лейкоциты лимфоциты + + + + 10-100 мг/кг >100 мг/кг <100 мг/кг При сенсибили-
Прочие показатели - - >100 мг/кг зации
Тромбоциты - - >100 мг/кг -
Окислительное повреждение ДНК (8-oxoG) + - >100 мг/кг -
Апоптоз гепатоцитов - - >100 мг/кг -
Аллергическая чувствительность в реакции ААШ - - >100 мг/кг -
Продукция специфических ^-антител при сенсибилизации - - >100 мг/кг -
Продукция цитокинов Т^а + + 10-100 мг/кг -
Фагоцитарная активность нейтрофильных лейкоцитов - - >100 мг/кг -
Показатели клеточного иммунитета 0045ЯА+ (В-лимфоциты) 00161а+ (естественные киллеры) 003+ (Т-лимфоциты) 003+004+ (Т-хелперы) 003+008+ (Т-цитотоксические) ИРИ (004+/008+) + + + + + + + >100 мг/кг >100 мг/кг >100 мг/кг 10-100 мг/кг 10-100 мг/кг 10-100 мг/кг -
Когнитивная функция (УРПИ) + - >100 мг/кг -
Сведения об авторах
ФГБНУ «НИИ питания» (Москва):
Шумакова Антонина Александровна - научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий E-mail: antonina.shumakova@gmail.com
Шипелин Владимир Александрович - кандидат медицинских наук, научный сотрудник, лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий E-mail: v.shipelin@yandex.ru
Трушина Элеонора Николаевна - кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории спортивного питания с группой алиментарной патологии E-mail: trushina@ion.ru
Мустафина Оксана Константиновна - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории спортивного питания с группой алиментарной патологии E-mail: mustafina@ion.ru
Гмошинский Иван Всеволодович - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий E-mail: gmosh@ion.ru
Ханферьян Роман Авакович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией спортивного питания с группой алиментарной патологии E-mail: khanferyan@ion.ru
Хотимченко Сергей Анатольевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий E-mail: hotimchenko@ion.ru
Тутельян Виктор Александрович - академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией энзимологии питания, директор E-mail: tutelyan@ion.ru
Литература
1. Верников В.М., Распопов Р.В., Арианова Е.А., Тананова О.Н. и др. Токсиколого-гигиеническая оценка препаратов нанострук-
110
турированного диоксида кремния в эксперименте на лабораторных животных // Инновационные технологии в управлении,
образовании, промышленности «АСТИНТЕХ-2010». Астрахань : ИД «Астраханский университет», 2010. С. 4-7.
2. Зайцева Н.В., Землянова М.А., Звездин В.Н., Саенко Е.В. Токси- 10. колого-гигиеническая оценка безопасности водной суспензии нанодисперсного диоксида кремния, синтезированного методом жидкокристаллического темплатирования // Анализ риска здоровью. 2013. № 1. С. 65-72. 11.
3. Зайцева Н.В., Землянова М.А., Лебединская О.В., Звездин В.Н. и др. Влияние нанодисперсного диоксида кремния на структурные особенности внутренних органов экспериментальных 12. животных // Морфология. 2013. Т. 144, № 5. С. 78-79.
4. Park E.J., Park K. Oxidative stress and pro-inflammatory responses 13. induced by silica nanoparticles in vivo and in vitro // Toxicol. Lett. 2009. Vol. 184, N 1. P. 18-25.
5. Rossi E.M., Pylkkanen L., Koivisto A.J., Vippola M. et al. Airway 14. exposure to silica-coated TiO2 nanoparticles induces pulmonary neutrophilia in mice // Toxicol. Sci. 2010. Vol. 113, N 2. P. 422-433. 15.
6. Sayes C.M., Reed K.L., Glover K.P., Swain K.A. et al. Changing the
dose metric for inhalation toxicity studies: short-term study in rats 16. with engineered aerosolized amorphous silica nanoparticles // Inhal. Toxicol. 2010. Vol. 22, N 4. P. 348-354.
7. Van der Zande M., Vandebriel R.J., Groot M.J., Kramer E. et al. Sub- 17. chronic toxicity study in rats orally exposed to nanostructured silica // Part. Fibre Toxicol. 2014. Vol. 11. P. 8.
8. Шумакова А.А., Арианова Е.А., Шипелин В.А., Сидорова Ю.С. 18. и др. Токсикологическая оценка наноструктурного диоксида кремния. I. Интегральные показатели, аддукты ДНК, уровень тиоловых соединений и апоптоз клеток печени // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 3. С. 52-62. 19.
9. Шумакова А.А., Авреньева Л.И., Гусева Г.В., Трусов Н.В. и др. Токсикологическая оценка наноструктурного диоксида кремния II.
Энзимологические, биохимические показатели, состояние системы антиоксидантной защиты // Вопр. питания. 2014. Т. 83, № 4. С. 58-66. Шумакова А.А., Кузнецова Г.Г., Минаева Л.П., Быкова И.Б. и др. Токсикологическая оценка наноструктурного диоксида кремния. III. Микроэкологические, гематологические показатели, состояние системы иммунитета // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № 4. С. 46-56. Yang H., Wu Q., Tang M., Liu X. et al. In vitro study of silica nanopar-ticle-induced cytotoxicity based on real-time cell electronic sensing system // J. Nanosci. Nanotechnol. 2010. Vol. 10, N 1. P. 561-568. МУК 2.3.2.970-00. Медико-биологическая оценка пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников. Stokes C.R., Miller B.G., Bourne F.J. Animal models of food sensitivity // Food Allergy and Intolerance / eds J. Brostoff, S.J. Challacombe. Eastbourne : W.B. Saunders, 1987. P. 286-300. МР 1.2.0052-11. Оценка воздействия наноматериалов на функцию иммунитета.
МУ 1.2. 2635-10. Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов.
Han B., Guo J., Abrahaley T., Qin L. et al. Adverse effect of nano-silicon dioxide on lung function of rats with or without ovalbumin immunization // PLoS One. 2011. Vol. 6, N 2. Article ID e17236. Yoshida T., Yoshioka Y., Fujimura M., Yamashita K. et al. Promotion of allergic immune responses by intranasally-administrated nanosilica particles in mice // Nanoscale Res. Lett. 2011. Vol. 6, N 1. P. 192-204. Simberg D., Zhang W.M., Merkulov S., McCrae K. et al. Contact activation of kallikrein-kinin system by superparamagnetic iron oxide nanoparticles in vitro and in vivo // J. Control Release. 2009. Vol. 140, N 3. P. 301-305.
Chen E.Y., Garnica M., Wang Y.C., Mintz A.J. et al. A mixture of anatase and rutile TiO2 nanoparticles induces histamine secretion in mast cells // Part. Fibre Toxicol. 2012. Vol. 9. P. 2.
References
1. Vernikov V.M., Raspopov R.A., Arianova E.A., Tananova O.N. et al. Toxicological and hygienic evaluation of preparations of nanostructured silica in an experiment on laboratory animals. In: Innovative technologies in management, education, industry «ASTINTEKH 2010». Astrakhan : Izd. dom «Astrakhan University», 2010: 4-7. (in Russian)
2. Zaitseva N.V., Zemlyanova M.A., Zvezdin V.N., Saenko E.V. Toxicological and hygienic evaluation of the safety of an aqueous suspension nanosized silica synthesized by the method of liquid crystal templating. Analyz Riska Zdorov'yu [Health Risk Analysis]. 2013; N 1: 65-72. (in Russian)
3. Zaitseva N.V., Zemlyanova M.A., Lebedinskaya O.V., Zvezdin V.N. et al. Effect of nanosized silicon dioxide on the structural features of the internal organs of experimental animals. Morfologya [Morphology]. 2013; Vol. 144 (5): 78-9. (in Russian)
4. Park E.J., Park K. Oxidative stress and pro-inflammatory responses induced by silica nanoparticles in vivo and in vitro. Toxicol Lett. 2009; Vol. 184 (1): 18-25.
5. Rossi E.M., Pylkkanen L., Koivisto A.J., Vippola M. et al. Airway exposure to silica-coated TiO2 nanoparticles induces pulmonary neutrophilia in mice. Toxicol Sci. 2010; Vol. 113 (2): 422-33.
6. Sayes C.M., Reed K.L., Glover K.P., Swain K.A. et al. Changing the dose metric for inhalation toxicity studies: short-term study in rats with engineered aerosolized amorphous silica nanoparticles. Inhal Toxicol. 2010; Vol. 22 (4): 348-54.
7. Van der Zande M., Vandebriel R.J., Groot M.J., Kramer E. et al. Sub-chronic toxicity study in rats orally exposed to nanostructured silica. Part Fibre Toxicol. 2014; Vol. 11: 8.
8. Shumakova A.A., Arianova E.A., Shipelin V.A., Sidorova Ju.S. et al. Toxicological assessment of nanostructured silica. I. Integral indices, adducts of DNA, tissue thiols and apoptosis in liver. Vopr Pitan [Problems of Nutrition]. 2014; Vol. 83 (3): 52-62. (in Russian).
9. Shumakova A.A., Avren'eva L.I., Guseva G.V., Trusov N.V. et al. Toxicological assessment of nanostructured silica. II. Enzymatic, biochemical indices, state of antioxidative defence. Vopr Pitan [Problems of Nutrition]. 2014; Vol. 83 (4): 58-66. (in Russian)
10. Shumakova A.A., Kuznetsova G.G., Minaeva L.P., Bykova I.B. et al. Toxicological assessment of nanostructured silica. III. Microeco-logical, hematological indices, state of cellular immunity. Vopr Pitan [Problems of Nutrition]. 2015; Vol. 84 (4): 46-56. (in Russian).
11. Yang H., Wu Q., Tang M., Liu X. et al. In vitro study of silica nanopar-ticle-induced cytotoxicity based on real-time cell electronic sensing system. J Nanosci Nanotechnol. 2010; Vol. 10 (1): 561-8.
12. Guidelines MUK 2.3.2.970-00. Medical and biological evaluation of food products derived from genetically modified sources. (in Russian).
13. Stokes C.R., Miller B.G., Bourne F.J. Animal models of food sensitivity // Food Allergy and Intolerance / eds J. Brostoff, S.J. Challacombe. Eastbourne : W.B. Saunders, 1987: 286-300.
14. Guidelines MR 1.2.0052-11. Assessing the impact of nanomaterials on the immune function. (in Russian)
15. Guidelines MU 1.2. 2635-10. Medical and biological safety assessment of nanomaterials. (in Russian)
16. Han B., Guo J., Abrahaley T., Qin L. et al. Adverse effect of nano-silicon dioxide on lung function of rats with or without ovalbumin immunization. PLoS One. 2011; Vol. 6 (2). Article ID e17236.
17. Yoshida T., Yoshioka Y., Fujimura M., Yamashita K. et al. Promotion of allergic immune responses by intranasally-administrated nanosil-ica particles in mice. Nanoscale Res Lett. 2011; Vol. 6 (1): 192-204.
18. Simberg D., Zhang W.M., Merkulov S., McCrae K. et al. Contact activation of kallikrein-kinin system by superparamagnetic iron oxide nanoparticles in vitro and in vivo. J Control Release. 2009; Vol. 140 (3): 301-5.
19. Chen E.Y., Garnica M., Wang Y.C., Mintz A.J. et al. A mixture of anatase and rutile TiO2 nanoparticles induces histamine secretion in mast cells. Part Fibre Toxicol. 2012; Vol. 9: 2.
111
