CC BY
413
Для корреспонденции
Гмошинский Иван Всеволодович - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Адрес: 109240, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14 Телефон: (495) 698-53-71 Е-таИ: gmosh@ion.ru
А.А. Шумакова, В.А. Шипелин, Н.Р. Ефимочкина, Л.П. Минаева, И.Б. Быкова, Ю.М. Маркова, Э.Н. Трушина, О.К. Мустафина, И.В. Гмошинский, Р.А. Ханферьян, С.А. Хотимченко, С.А. Шевелева, В.А. Тутельян
Токсикологическая оценка наноразмерного коллоидного серебра, стабилизированного поливинилпирролидоном. IV. Влияние на микробиоту кишечника, иммунологические показатели
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», Москва Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, Moscow
Наноразмерное коллоидное серебро (НКС) «Арговит®-С», стабилизированное поливинилпирролидоном (ПВП) и содержащее наночастицы (НЧ) серебра диаметром 10-80 нм, вводили растущим крысам-самцам (масса тела 80±10 г) в течение первых 30 сут внутрижелудочно через зонд и далее в течение 62 сут с потребляемым рационом в дозах 0,1; 1,0 и 10 мг на 1 кг массы тела в день в расчете на серебро (Ag). Животные контрольных групп получали деионизованную воду и ПВП. В содержимом слепой кишки с помощью стандартных микробиологических методов определяли концентрацию основных и транзиторных компонентов кишечной микробиоты, антагонистическую активность симбиотических бифидобактерий. Экспрессию антигенов СБ45ЯА, СБЗ, СБ4, СБ8, ОБ 161 а на лимфоцитах (Лф) периферической крови определяли методом проточной цитофлуориметрии; уровень цитокинов П-10, П-13, ТЫГа в сыворотке крови изучали иммуноферментным методом. Показано, что подострое введение Ag во всех изученных дозах не приводит к значительным изменениям в составе нормальной микробиоты, оказывая тем не менее угнетающее действие на рост ряда транзи-торных компонентов, представленных в том числе условно-патогенными видами микроорганизмов. В числе изученных иммунологических показателей отмечено снижение количества В-Лф при максимальной дозе НКС, тогда как изменения остальных параметров системы иммунитета не имели однозначной зависимости от дозы вводимого продукта. Полученные данные проанализированы в свете представленных в предыдущих публикациях данных о влиянии НКС на интегральные, морфологические, гематологические, биохимические и энзимологичес-кие показатели животных в 92-суточном эксперименте. Сделан вывод
Toxicological evaluation of colloidal nano-sized silver stabilized polyvinylpyrrolidone.
IV. Influence on intestinal microbiota, immune indexes
A.A. Shumakova, V.A. Shipelin, N.R. Efimochkina, L.P. Minaeva, I.B. Bykova, Yu.M. Markova, E.N. Trushina, O.K. Mustafina, I.V. Gmoshinsky, R.A. Khanferyan, S.A. Khotimchenko, S.A. Sheveleva,
V.A. Tutelyan
о том, что значимые признаки подострой пероральной токсичности НКС отмечаются начиная с дозы 1 мг на 1 кг массы тела по Ag, максимальная недействующая доза (NOAEL) может быть оценена величиной 0,1 мг на 1 кг массы тела.
Ключевые слова: серебро, наночастицы, крысы, подострая токсичность, кишечная микробиота, лимфоциты, цитокины, NOAEL
Nano-sized colloidal silver (NCS) stabilized with polyvinylpyrrolidone (PVP) containing nanoparticles (NPs) of silver with a diameter of 10-80 nm was administered to growing male rats (body weight 80±10 g) during the first 30 days by intragastric gavage and then for 62 days with diet consumed in doses of 0.1, 1.0 and 10 mg/kg of body weight per day based on silver (Ag). The control animals received deionized water and PVP. The composition of microbiota from the cecum was studied using standard microbiological methods with determination of the main and transient components, together with antagonistic activity of symbiotic bifidobacteria. Expression of antigens CD45RA, CD3, CD4, CD8, CD161a on lymphocytes (Ly) of peripheral blood was determined by flow cytometry; blood serum levels of cytokines IL10, IL13, TNFa were examined by ELISA. It was shown that subacute administration of colloidal Ag in all studied doses did not lead to significant changes in the composition of the main components of normal microbiota, providing, however, the inhibitory effect on the growth of some transitory components probably including opportunistic species of microorganisms. Among the studied immunological parameters decreased amount of B-Ly was noticed at the highest dose of the NCS, while changes in the other parameters of the immune system were depended ambiguously on the dose of the product. The results were analyzed in conjunction with the data of previous publications concerning the impact on the NCS on integrated, morphological, hematological, biochemical and enzymological indexes of animals in the 92-day experiment. It was concluded that significant symptoms of NCS sub-acute oral toxicity manifested starting from a dose of 1 mg/kg body weight of Ag, and the maximum not observed adverse effect dose (NOAEL) can be estimated as 0.1 mg/kg body weight.
Keywords: silver, nanoparticles, rats, subacute toxicity, intestinal microbiota, lymphocytes, cytokines, NOAEL
Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноразмерного коллоидного серебра (НКС), производимого в больших масштабах современной наноин-дустрией, является важной задачей ввиду его присутствия в большом числе видов потребительской продукции (включая пищевые продукты и биологически активные добавки к пище) и возможности контаминации им различных объектов окружающей среды [1-3]. В цикле совместных исследований ФГБНУ «НИИ питания» и ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» Роспотребнадзора решалась задача определения пороговых токсических доз и максимальных недействующих доз (ЫОАЕЦ про-мышленно выпускаемого НКС в условиях подострого 92-суточного перорального введения растущим крысам. Результаты оценки интегральных, морфологических, гематологических, цитологических, биохимических показателей организма животных в соответствии с методами, установленными в Российской Федерации (МУ 1.2.2520-09 «Токсиколого-гигиеническая оценка
безопасности наноматериалов»), были представлены в предыдущих публикациях [4-6]. Известно, что наночастицы (НЧ) серебра обладают в определенных условиях выраженным антимикробным действием, связанным, по современным представлениям, с их умеренной растворимостью в некоторых биологических средах [7, 8]. Ввиду этого целью данной работы явилось изучение состояния микробиома толстой кишки у крыс, перорально получающих НКС, в подостром 92-суточном эксперименте, а также тесно связанных с этим показателей клеточного иммунитета.
Материал и методы
В работе использован промышленно выпускаемый препарат НКС «Арговит®-С» (ООО НПЦ «Вектор-Вита», Новосибирск, РФ). Его подробная характеристика как наноматериала была представлена ранее [6]. По составу изучаемый образец представлял собой водную дис-
персию НЧ металлического серебра, принадлежащих к фракциям с диаметром менее 5, 10-20 и 50-80 нм, стабилизированную поливинилпирролидоном (ПВП, пищевая добавка Е1201).
Эксперимент проведен в общей сложности на 75 крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 80±10 г, полученных из питомника РАН «Столбовая». На протяжении всего эксперимента животные получали сбалансированный полусинтетический рацион согласно МУ 1.2.2520-09. Животные были случайным образом разделены на 5 групп по 15 особей. Крысам 1-й (контрольной) группы вводили деионизованную воду, 2-й группы - носитель ПВП в виде водного раствора в дозе 200 мг на 1 кг массы тела. Крысы 3, 4 и 5-й групп получали раствор НКС в дозе соответственно 0,1, 1 и 10 мг на 1 кг массы тела в пересчете на серебро. Животным 3-й и 4-й групп дополнительно вводили ПВП в количестве, соответствующем его поступлению с препаратом НКС в 5-й группе. В течение первых 30 сут введение тестируемых препаратов осуществляли внут-рижелудочно через зонд, а на протяжении последующих 62 сут НКС и ПВП добавляли к корму животных; дозу при этом рассчитывали, исходя из количества фактически потребленного рациона.
На 92-е сутки животных обескровливали под глубокой эфирной анестезией. Кровь собирали с добавлением антикоагулянта (трикалиевая соль ЭДТА) в количестве 0,01% по массе. Содержимое слепой кишки отбирали в асептических условиях в стерильные контейнеры, разводили фосфатно-тиогликолевом буферным раствором и количественно засевали в дифференциально-диагностические и селективные среды в соответствии со стандартной методикой (МУ 1.2.2634-10 «Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза»).
Содержание бифидобактерий определяли на тиогли-колевой среде; лактобацилл - на среде MRS; бактерий семейства Enterobacteriaceae - на среде Эндо и цитрат-ном агаре, бактерий рода Staphylococcus - на желточно-солевом агаре и среде Байрд-Паркера; Streptococcus spp. - на кровяном агаре; Enterococcus spp. - на мо-лочно-ингибиторной среде (МИС), Bacteroides spp. - на кровяном агаре с неомицином, сульфитредуцирующих клостридий - на модифицированной железосульфитной среде; плесневых грибов - на среде Чапека. Содержание микроорганизмов выражали в lg КОЕ/г сырой массы фекалий.
Оценку антагонистической (кислотообразующей) активности популяций бифидобактерий проводили путем определения снижения рН культуральной жидкости (тио-гликолевой среды) на 5-е сутки инкубации с помощью рН-метра. Критериями служили пределы рН: менее 4,5 - антагонистически активные бифидобактерии; 4,6-5,1 - слабый антагонизм, более 5,1 - отсутствие антагонистической активности.
Экспрессию антигенов CD45RA, CD3, CD4, CD8, CD161a на лимфоцитах (Лф) периферической крови
определяли методом прямого иммунофлуоресцентного окрашивания клеток цельной крови с использованием панели моноклональных антител, конъюгированных с флуоресцентными красителями ("Beckman Coulter", США). Измерения выполняли на проточном цитофлуори-метре "FC-500" ("Beckman Coulter", США) по программе Cytomics CXP Software. Общее содержание CD45RA+ (B-Лф), CD3+ (Т-Лф) и CD161a+ (естественных киллеров) выражали в % от общего числа проанализированных. Содержание CD3+CD4+ (Т-хелперов) и CD3+CD8+ (Т-ци-тотоксических Лф) определяли как их процентную долю в общем количестве CD3+-клеток.
Определение цитокинов IL-10 и TNFa в сыворотке крови крыс проводили иммуноферментным методом с использованием коммерческих наборов "Bioscience" ("Bender MedSystems GmbH", Австрия), IL-13 - набора ("Cloud Clone Corp.", США). Оптическую плотность измеряли на автоматическом планшетном фотометре «ЭФОС 9605» («Сапфир», РФ).
Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета SPSS 18.0 согласно критерию Стьюдента, непараметрическому ранговому критерию Манна-Уитни, критериям ANOVA и Краскела-Уоллиса (однофакторный дисперсионный анализ). Различия признавали достоверными при уровне значимости р<0,05.
Результаты и обсуждение
Как следует из данных, представленных в табл. 1, поступление в течение 92 сут НКС во всех изученных дозах оказывало сравнительно слабое воздействие на основные популяции микробиоты слепой кишки крыс. Общее количество аэробов и анаэробов, численность лактобактерий и энтеробактерий оставалась без изменения у животных всех опытных групп. Содержание бифидобактерий у крыс 3-й группы оказалось достоверно (р2-3<0,05), но незначительно по абсолютной величине (менее чем в 2 раза) снижено по сравнению с уровнем у животных 2-й группы, получавших ПВП. У животных 4-й и 5-й групп, получавших большие дозы НКС, подобный эффект не наблюдался. Содержание бактероидов у крыс 3-й и 4-й групп было, напротив, достоверно повышено в сравнении с животными 1-й группы, но не 2-й, из чего следует, что данное воздействие является, по-видимому, неспецифическим, связанным с воздействием ПВП на эту группу организмов. Это же, по всей видимости, относится к наблюдаемому достоверному снижению численности энтерококков у крыс 3-й группы в сравнении с животными 1-й группы. Количество общих стрептококков и стафилококков у животных 5-й группы, получавших НКС в наибольшей дозе, оказалось достоверно и значительно (более чем на порядок величины) сниженным в сравнении с показателем для животных 1-й группы (р1-4,1-5<0,05), имело тенденцию (р>0,05) к снижению по сравнению с таковым у животных 2-й группы. Данное изменение, по-видимому,
га
Si Sí < 4,63±0,13 4,64±0,08 4,54±0,11 4,67±0,06 4,53±0,03 >0,05 >0,05 >0,05
аэробы в сумме 8,08±0,28 (7,5-9,4) 7,86±0,33 (6,9-9,3) 7,78±0,11 (7,3-8,0) 7,94±0,19 (7,3-8,6) 7,61 ±0,33 (6,3-8,6) >0,05 >0,05 >0,05
анаэробы в сумме 9,38±0,33 (8,0-10,0) 9,30±0,45 (7,1-10,0) 9,27±0,27 (8,3-10,0) 9,48±0,18 (9,0-10,0) 9,43±0,20 (9,0-10,0) >0,05 >0,05 >0,05
Содержание в фекалиях, lg КОЕ/г, M±m, интервалы изменения (в скобках] Bacteroides 7,03±0,20 (6,4-7,7) 7,58±0,25 (6,9-8,5) 7,93±0,30 (6,7-8,6)t 7,73±0,20 (7,3-8,6)t 7,30±0,38 (6,0-8,4) >0,05 >0,05 >0,05
Streptococcus 8,35±0,40 (6,9-9,3) 7,30±0,45 (6,3-9,3) 7,42±0,19 (6,6-7,8) 7,60±0,25 (6,7-8,3) 6,43±0,38 (5,1-7,6)t 0,013 0,009 >0,05
Entero-coccus 7,01 ±0,12 (6,6-7,5) 6,50±0,31 (5,3-7,3) 6,12±0,26 (5,2-6,8)t 6,25±0,51 (5,1-7,6) 7,21 ±0,34 (5,9-8,2) >0,05 >0,05 >0,05
Staphylococcus 6,86±0,38 (5,2-7,9) 6,46±0,19 (5,9-7,2) 6,76±0,16 (6,3-7,2) 6,33±0,22 (5,9-7,2) 5,73±0,33 (5,0-7,1 )t 0,050 >0,05 >0,05
Enterobac-teriaceae 6,12±0,45 (5,2-8,1) 4,73±0,53 (2,3-5,8) 5,32±0,31 (4,6-6,6) 6,05±0,40 (4,6-7,3) 3) ±- OO -i— OO LO LO >0,05 >0,05 >0,05
Lactobacillus 8,26±0,38 (7,0-9,3) 8,15±0,38 (6,9-9,0) 8,37±0,36 (7,0-9,4) 8,97±0,23 (8,3-9,6) 8,48±0,32 (7,0-9,0) >0,05 >0,05 >0,05
Bifidobacterium 7,78±0,26 (7,0-8,4) 8,33±0,23 (7,6-9,0) 7,55±0,25 (7,0-8,3)# 8,17±0,31 (7,0-9,0) 8,33±0,21 (8,0-9,0) >0,05 >0,05 >0,05
Число крыс 6 6 6 6 6 Однородность распределения, 1-5-я группы, ANOVA, р НЧ ПВП
Группа животных 1-я 2-я 3-я я 4- я-5-
Однофакторный анализ, ANOVA, p
О
нельзя рассматривать как неблагоприятное, посколь-
| ку известно, что в составе данных групп организмов
| присутствуют некоторые условно-патогенные виды.
s? Антагонистическая кислотообразующая активность бифидобактерий слепой кишки у всех крыс опытных групп, получавших НКС, достоверно не отличалась
К от контроля.
° Результаты оценки содержания транзиторных компо-
| нентов кишечной микробиоты, представленные в табл. 2,
§ на качественном уровне позволяют заключить, что
3? НКС, во всяком случае в наибольшей дозе (10 мг/кг,
о 5-я группа), оказывает подавляющее действие на раз-
S витие таких из них, как S. aureus, гемолитические
<2 стрептококки и протей. В отношении двух последних
Ц ¡¿ популяций эффект подавления роста наблюдается
¡ti „ -
,s ¡j по сравнению с 1-й группой и при меньших дозах
у НКС (0,1-1 мг на 1 кг массы тела). Таким образом,
'I i не оказывая значительного воздействия на боль-
:г се
| § шинство основных групп симбиотической микрофлоре § ры, НКС, по-видимому, способно ингибировать разви-
Ч О.
¡5 ¡5
g g. могут присутствовать условно-патогенные виды, что
g ^ является благоприятным фактором для организма
р
i
■s э s о. <в
о
тие ряда транзиторных популяций, в составе которых
§ в целом.
ч | Отсутствие дисбиотических изменений в толстой
I кишке крыс, получавших НЧ серебра, может быть свя-
! Ц зано с тем, что эти НЧ, согласно новым данным [7, 8],
СХ -О
" ¿3 имеют сами по себе незначительную антимикробную
^ 5 активность, а их бактерицидный потенциал обусловлен в основном эмиссией из них ионов Ад+ в присутствии
■§■ о окислителей. В анаэробных условиях толстой кишки
* <о растворение НЧ серебра происходит в очень малой
3 Е
* о степени, что и определяет, по-видимому, их относитель-эЕТ но слабо выраженное действие в отношении наиболее
X о
* о" многочисленных популяций нормофлоры.
и При оценке изменений в показателях клеточного
| '| иммунитета (табл. 3) следует принимать во внимание, а ^ что введение носителя наноматериала - ПВП - само
со [X со ■
по себе оказывает на них определенное воздействие. Так, у животных 2-й группы отмечено достоверное (р1-2<0,05) повышение количества В-Лф (на 36%)
^ ^ Так, у животных 2-й группы отмечено достоверное
I °
со
со ®
и снижение общих Т-Лф (на 23%). У крыс 5-й группы, р <3 получавшей НКС в наибольшей дозе, эти показатели
(О
§ ^ в основном возвращались к уровню, характерному для
Л ¡3 1-й группы (р1-5>0,05; р2-5<0,05). При этом зависимо о. мость количества Т-Лф от дозы НКС является немоно-
(Й § тонной: наблюдается также снижение их количества
¡5о у животных 3-й группы по сравнению со 2-й. Число
0 ч
| I ЫК-клеток при введении НКС достигало минимума в 4-й группе (доза серебра 1 мг на 1 кг массы тела).
Е Такие важные показатели, как число Т-хелперов и Т-ци-
1 5Г тотоксических Лф и их соотношение у животных, полу* со
<в | чавших НКС, достоверно не отличались от контроля.
1 § Влияние приема НКС на продукцию цитокинов ® § также не демонстрирует однозначной зависимости от
2 ¡5 дозы. Как следует из данных рисунка, концентрация х а ||_-10 достоверно снижалась у животных 3-й группы
о. -С
с э в сравнении со 2-й группой; аналогичная тенденция
Таблица 2. Содержание транзиторных популяций микробиоты кишечника у крыс 1-5-й групп
Группа животных Число крыс Содержание в фекалиях, lg КОЕ/г, медиана, интервалы изменения в скобках)
гемолитические Streptococcus spp. цитратас-симили-рующие Enterobacte-riaceae S. aureus Proteus spp. плесени спорооб-разующие микроорганизмы
1-я 6 <4 (<4-5,3) 5,0 (<4-5,3) 7,0 (4,2-7,4) 7,0 (5,2-9,1) 3,2 (<3-4,6) 5,2 (<4-6,3)
2-я 6 6,3 (<4-8,6) 5,1 (<4-6,0) 6,1 (5,0-7,0) <2 (<2-4,6)t <3 (<3-3,6) 5,2 (4,3-6,0)
3-я 6 <4 (<4-<4)# 4,4 (<4-5,3) 6,8 (6,3-7,2) 3,6 (<3-5,2)t# <3 (<3-3,6) 4,6 (<4-4,7)#
4-я 6 <4 (<4-7,6) 5,3 (4,3-7,2) 6,1 (5,8-7,0) <3 (<3-<3)t# 3,3 (<3-3,6) 4,8 (<4-6,3)
5-я 6 <4 (<4-<4)# 5,2 (<4-6,6) <3 (<3-5,2)t# <3 (<3-<3)t# <3 (<3-3,6) <4 (<3-<4)t#
Однородность распределения, 1-5-я группы, критерий Краскела-Уоллиса, p 0,041 >0,05 0,002 <0,001 >0,05 0,010
Факторный анализ, критерий Краскела-Уоллиса, p НЧ 0,023 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,010
ПВП >0,05 >0,05 0,040 <0,001 >0,05 >0,05
П р и м е ч а н и е. f - достоверность различий с 1-й группой (р<0,05) согласно и-критерию Манна-Уитни; # - достоверность различий со 2-й группой (р<0,05) согласно и-критерию Манна-Уитни.
Таблица 3. Показатели клеточного звена иммунитета (субпопуляции лимфоцитов, %) (М±т), у крыс 1-5-й групп
Группа животных Число крыс Содержание, % от числа проанализированных лимфоцитов CD4/CD8 (иммуно-регулятор-ный индекс)
CD45RA+ (В-лимфо-циты) CD3+ (Т-лимфо-циты) CD3+CD4+ (Т-хелперы) CD3+CD8+ (Т-цитоток-сические) CD161a+ (NK-клетки)
1-я 7 27,6±1,2 57,0±2,6 55,7±5,3 42,8±5,3 4,89±0,75 1,49±0,27
2-я 7 37,5±3,9t 43,7±4,11 48,3±6,1 49,7±6,3 5,31 ±0,77 1,17±0,27
3-я 7 29,1 ±2,7 56,4±3,8# 56,4±1,7 41, 8±1,9 3,81 ±0,07 1,38±0,11
4-я 7 33,5±2,7 50,7±3,3 50,0±4,8 48,0±4,8 3,17±0,43# 1,16±0,22
5-я 6 26,4±2,3# 57,9±2,1# 63,8±3,5 34,8±3,5 4,10±0,55 1,99±0,31
Однородность распределения, 1-5-я группы, ANOVA, р 0,043 0,025 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
Однофакторный анализ (ANOVA), р, по наличию НЧ >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
ПВП >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
П р и м е ч а н и е. f - достоверность различий с 1-й группой (р<0,05) согласно Ь-тесту Стьюдента и/или и-критерию Манна-Уитни; # - достоверность различий со 2-й группой (р<0,05) согласно Ь-тесту Стьюдента и/или и-критерию Манна-Уитни.
отмечается и для крыс 5-й группы. Т^а в пределах чувствительности метода выявлен только у 4 из 9 тестированных животных 4-й группы (данные не показаны). Достоверных различий в уровне 11_-13 между группами животных не наблюдается. В целом эти данные свидетельствуют об отсутствии значимого нарастания воспалительных процессов с увеличением дозы вводимого НКС.
Таким образом, влияние перорального приема НКС на показатели клеточного иммунитета является неоднозначным; единственным индикатором, позволяющим установить пороговую дозу, является, по-видимому, со-
держание В-Лф, для которого какие-либо достоверные изменения отсутствуют вплоть до дозы 1 мг на 1 кг массы тела включительно.
Основные итоги экспериментов [4-6] по определению пероральной NOAEL для НЧ серебра, стабилизированных ПВП, представленные в табл. 4, показывают, что данный наноматериал может оказывать различные неблагоприятные воздействия на организм, число и степень проявления которых монотонно нарастают в зависимости от дозы. При дозе 1 мг на 1 кг массы тела (4-я группа) наряду с выраженными морфологическими изменениями в печени отмечаются сдвиги в активности
микросомальных монооксигеназ печени изоформ CYP 1А2 и 2В1, глутатионпероксидазы эритроцитов. При дозе 10 мг на 1 кг массы тела (5-я группа) дополнительно к этому отмечаются изменения в активности CYP 1А1, глутатион-в-трансферазы, УДФ-глюкуронозилтрансфе-разы печени, общей лизосомальной р-галактозидазы и арилсульфатаз А и В, ряда гематологических показателей эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов, числа В-лимфоцитов, относительной массы легких. Прибавка массы тела у крыс 5-й группы к концу эксперимента достоверно возрастает, что, возможно, связано со снижением уровня двигательной активности у животных данного возраста. В течение 3-месячного периода введения НКС в 5-й группе погибли 4 животных; в остальных группах летальность отсутствовала. Таким образом, НКС токсичен для крыс при пероральном ежедневном введении в дозе 1 мг на 1 кг массы тела и более. Причиной такого действия по современным представлениям является главным образом эмиссия токсичных ионов Ад+ из НЧ во внутренней среде организма [9], однако не исключается и прямой механизм токсичности НЧ, связанный с каталитической генерацией кислородсодержащих свободных радикалов [10]. Альтернативное объяснение наблюдаемых эффектов может состоять во влиянии вводимого серебра на состояние микроэлементного го-меостаза [11], в частности на бионакопление и экскрецию эссенциальных микроэлементов (цинк, селен и др.).
Таблица 4. Сводная таблица эффектов подострого перорального введения наноразмерного коллоидного серебра, стабилизированного поливинилпирролидоном, у крыс в 92-суточном эксперименте
Показатель Наличие (+) Эффект может (+) Оценка Примечание
или отсутс- или не может (-) быть для
твие (-) интерпретирован как NOAEL
эффекта неблагоприятный
Прирост массы тела + + >1 мг/кг -
Относительная масса органов: -
- легкие + + >1 мг/кг
- остальное - - >10 мг/кг
Проницаемость кишечного барьера - - >10 мг/кг -
Система детоксикации ксенобиотиков: -
- CYP 1А1 + + >1 мг/кг
- CYP1А2 + + >0,1 мг/кг
- CYP 2В1 + + >0,1 мг/кг
- глутатион-Б-трасфераза + + >1 мг/кг
- УДФ-глюкуронозилтрансфераза + + >1 мг/кг
Активность лизосомальных гидролаз: -
- общая + + >1 мг/кг
- неседиментируемая - - >10 мг/кг
Показатели ПОЛ и системы антиокси-
дантной защиты:
- малоновый диальдегид + - >10 мг/кг
- диеновые конъюгаты ПНЖК плазмы - - >10 мг/кг
крови
- активность антиоксидантных
ферментов:
- глутатионпероксидаза + + >0,1 мг/кг
- супероксиддисмутаза + + ? Нет зависимости от дозы
- остальное - - >10 мг/кг
Небелковые тиолы печени + + ? Нет зависимости от дозы
160,0 140,0 120,0 100,0 80,0 60,0 40,0 20,0 0,0
1Ы0 11.-13
Группы
□ □ □ ■ ■
1-я 2-я 3-я 4-я 5-я
Содержание цитокинов 1Н0 и 11.-13 в сыворотке крови крыс 1-5-й групп, пг/мл, % от контроля, М±т
# - достоверность различий со 2-й группой (р<0,05) согласно Ь-тесту Стьюдента и/или и-критерию Манна-Уитни; число животных в группе - 9 (1-4-я группы), 6 (5-я группа).
Окончание табл. 4
Показатель Наличие (+) Эффект может (+) Оценка Примечание
или отсутс- или не может (-) быть для
твие (-) интерпретирован как NOAEL
эффекта неблагоприятный
Биохимические показатели крови:
- АЛТ - - >10 мг/кг
- АСТ + + ? Нет зависимости от дозы
- альбумин - - >10 мг/кг
- белок общий - - >10 мг/кг
- глюкоза - - >10 мг/кг
- креатинин + ? ? Влияние носителя
- мочевая кислота + + >1 мг/кг
- щелочная фосфатаза + + >1 мг/кг
Общий гемоглобин - - >10 мг/кг -
Гематологические показатели -
(эритроциты):
- концентрация гемоглобина - - >10 мг/кг
- общее количество эритроцитов + + >1 мг/кг
- показатель гематокрита - - >10 мг/кг
- средний объем эритроцита + + >1 мг/кг
- содержание гемоглобина в эритроците + + >1 мг/кг
- концентрация гемоглобина в эритроците + + >1 мг/кг
Гематологические показатели
(лейкоциты):
- нейтрофилы + + >1 мг/кг
- лимфоциты + + >1 мг/кг
- базофилы + + ? Нет зависимости от дозы
- моноциты + + ? То же
- эозинофилы - - >10 мг/кг
Тромбоциты: -
- средний объем тромбоцита + + >1 мг/кг
- тромбокрит + + >1 мг/кг
Апоптоз гепатоцитов:
- ранняя и поздняя стадии апоптоза - - >10 мг/кг
- мертвые клетки + + ? Изменения в пределах
вариабельности нормы
Продукция цитокинов:
- Т^а + + ? Нет зависимости от дозы
- 11.-10 + + ? То же
- И-13 - - >10 мг/кг
Показатели клеточного иммунитета:
- С045ВА+ (В-лимфоциты) + + >1 мг/кг
- СШ61а+ (естественные киллеры) + + ? Нет зависимости от дозы
- СЭ3+ (Т-лимфоциты) + ? ? Немонотонная зависи-
мость от дозы
- С03+С04+ (Т-хелперы) - - >10 мг/кг
- С03+С08+ (Т-цитотоксические) - - >10 мг/кг
- ИРИ (С04+/С08+) - - >10 мг/кг
Когнитивная функция + + ? Нет зависимости от дозы
(тест условного рефлекса
пассивного избегания)
Морфология внутренних органов: -
- печень + + >0,1 мг/кг
- селезенка + + >0,1 мг/кг
- почки + + >0,1 мг/кг
- подвздошная кишка - - >10 мг/кг
Состояние микробиома кишечника: -
- основные популяции + - >10 мг/кг
- транзиторные популяции + - >10 мг/кг
Представленные в литературе оценки для NOAEL при подостром (1 мес и более) пероральном введении НКС частично противоречивы. Авторы исследования [12] не выявили признаков токсичности НЧ серебра, мо-
дифицированных ПВП, в дозе 90 мг на 1 кг массы тела. С другой стороны, в работе [13] отмечалось наличие токсического действия НКС на печень крыс в дозе 125 мг на 1 кг массы тела и более. У мышей,
получавших НЧ серебра в дозах свыше 1 мг на 1 кг массы тела, происходили гистопатологические изменения в печени и почках [14]. В исследовании [15] отмечали ряд неблагоприятных сдвигов интегральных и биохимических показателей в организме крыс при дозе НКС, стабилизированного ПВП, 1 мг на 1 кг массы тела. Для НЧ серебра с немодифицированной поверхностью пороговая доза токсического действия, согласно [16], составила менее 0,01 мг/кг.
На основе данных, представленных в цикле работ [4-6], можно заключить, что для НЧ серебра, модифици-
рованных ПВП, значимые признаки токсичности отмечаются, начиная с дозы 1 мг на 1 кг массы тела, вводимой перорально, и NOAEL может быть оценена величиной 0,1 мг на 1 кг массы тела. При переходе на человека, с учетом введения двух 10-кратных коэффициентов запаса, безопасная доза НЧ в расчете на серебро должна составить 0,001 мг/кг, что соответствует дозе 70 мкг в день для человека с массой тела 70 кг. Следует отметить, что данная оценка совпадает с принятым в настоящее время в России верхним допустимым уровнем потребления серебра как химического элемента [17].
Сведения об авторах
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва):
Шумакова Антонина Александровна - научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий E-mail: antonina_sh@list.ru
Шипелин Владимир Александрович - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий E-mail: v.shipelin@ya.ru
Ефимочкина Наталья Рамазановна - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома E-mail: karlikanova@ion.ru
Минаева Людмила Павловна - кандидат технических наук, старший научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома E-mail: minaeva@ion.ru
Быкова Ирина Борисовна - научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома E-mail: bykova@ion.ru
Маркова Юлия Михайловна - младший научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома E-mail: yulia.markova.ion@gmail.com
Трушина Элеонора Николаевна - кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории спортивного питания с группой алиментарной патологии E-mail: trushina@ion.ru
Мустафина Оксана Константиновна - кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории спортивного питания с группой алиментарной патологии E-mail: mustafina@ion.ru
Гмошинский Иван Всеволодович - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий E-mail: gmosh@ion.ru
Ханферьян Роман Авакович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией спортивного питания с группой алиментарной патологии E-mail: khanferyan@ion.ru
Хотимченко Сергей Анатольевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий E-mail: hotimchenko@ion.ru
Шевелева Светлана Анатольевна - доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией биобезопасности и анализа нутримикробиома E-mail: sheveleva@ion.ru
Тутельян Виктор Александрович - академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией энзимологии питания, научный руководитель E-mail: tutelyan@ion.ru
Литература
1. Верников В.М., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Наночастицы предназначенных для пищевых продуктов: характеристика воз-
серебра в природе, промышленности, упаковочных материалах, можных рисков// Вопр. питания. 2009. Т. 78, № 6. С. 13-20.
2. Blaser S.A., Scheringer M., MacLeod M., Hungerbuhler K. Estimation of cumulative aquatic expo-sure and risk due to silver: contribution
of nano-functionalized plastics and textiles// Sci. Total Environ. 10. 2008. Vol. 390, N 2-3. P. 396-409.
3. Fabrega J., Luoma S.N., Tyler C.R., Galloway T.S., Lead JR. Silver nanoparticles: behaviour and effects in the aquatic environment // 1 1 . Environ. Int. 2011. Vol. 37, N 2. P. 517-531.
4. Шумакова А.А., Шипелин В.А., Сидорова Ю.С., Трушина Э.Н. и др. Токсикологическая оценка наноразмерного коллоидного серебра, стабилизированного поливинилпирролидоном, в 92- 12. дневном эксперименте на крысах. I. Характеристика нанома-териала, интегральные, гематологические показатели, уровень тиоловых соединений и апоптоз клеток печени // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № 6. С. 46-57. 13.
5. Зайцева Н.В., Землянова М.А., Звездин В.Н., Довбыш А.А. и др. Токсикологическая оценка наноразмерного коллоидного серебра, стабилизированного поливинилпирролидоном, в 92-дневном эксперименте на крысах. II. Морфология внутренних 14. органов // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № 1. С. 47-55.
6. Гмошинский И.В., Шипелин В.А., Ворожко И.В., Сенцова Т.Б. и др. Токсикологическая оценка наноразмерного коллоидного серебра, стабилизированного поливинилпирролидоном, 15. в 92-дневном эксперименте на крысах. III. Энзимологические, биохимические маркеры, состояние системы антиоксидантной защиты // Вопр. питания. 2016. Т. 85, № 2. С.14-23.
7. Sheehy K., Casey A., Murphy A., Chambers G. Antimicrobial proper- 16. ties of nano-silver: A cautionary approach to ionic interference //
J. Colloid Interface Sci. 2015. Vol. 443, N 1. P. 56-64.
8. Xiu Z.M., Zhang Q.B., Puppala H.L., Colvin V.L., Alvarez P.J.J. Negligible particle-specific antibacterial activity of silver nanoparticles// Nano Lett. 2012. Vol. 12, N 8. P. 4271-4275. 17.
9. Stensberg M.C., Wei Q., McLamore E.S., Porterfield D.M. et al. Toxicological studies on silver nanoparticles: challenges and
References
opportunities in assessment, monitoring and imaging// Nanomedicine (London). 2011. Vol. 6, N 5. P. 879-898.
Lapresta-Fernandez A., Fernandez A., Blasco J. Nanoecotoxicity effects of engineered silver and gold nanoparticles in aquatic organisms// Trends Anal. Chem. 2012. Vol. 32, N 2. P. 40-59. Benetti F., Bregoli L., Olivato I., Sabbioni E. Effects of metal(loid)-based nanomaterials on essential element homeostasis: the central role of nanometallomics for nanotoxicology// Metallomics. 2014. Vol. 6, N 4. P. 729-747.
Van der Zande M., Vandebriel R.J., Doren E.V., Kramer E. et al. Distribution, elimination, and toxicity of silver nanoparticles and silver ions in rats after 28-day oral exposure// ACS Nano. 2012. Vol. 6, N 8. P. 7427-7442.
Kim Y.S., Kim J.S., Cho H.S., Rha D.S. et al. Twenty-eight-day oral toxicity, genotoxicity, and gender-related tissue distribution of silver nanoparticles in Sprague-Dawley rats // Inhal. Toxicol. 2008. Vol. 20, N 6. P. 575-583.
Park E.J., Bae E., Yi J., Kim Y. et al. Repeated-dose toxicity and inflammatory responses in mice by oral administration of silver nanoparticles // Environ. Toxicol. Pharmacol. 2010. Vol. 30, N 2. P. 162-168.
Шумакова А.А., Смирнова В.В., Тананова О.Н., Трушина Э.Н. и др. Токсиколого-гигиеническая характеристика наночастиц серебра, вводимых в желудочно-кишечный тракт крыс // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 6. С. 9-18.
Ходыкина Н.В., Горшенин А.В., Клаучек В.В., Почепцов А.Я. и др. Экспериментальное изучение хронической пероральной токсичности сферических нефункционализированных наночастиц серебра // Нанотоксикология: достижения, проблемы, перспективы. Волгоград , 2014. С. 65-66.
Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ. Методические рекомендации МР 2.3.1. 19150-04.
1. Vernikov V.M., Gmoshinski I.V., Khotimchenko S.A. Silver nanoparti- 9. cles in industry, environment and food packaging material: probable
risk characterization. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2009; Vol. 78 (6): 13-20. (in Russian)
2. Blaser S.A., Scheringer M., MacLeod M., Hungerbuhler K. Estimation 10. of cumulative aquatic expo-sure and risk due to silver: contribution
of nano-functionalized plastics and textiles. Sci Total Environ. 2008; Vol. 390 (2-3): 396-409. 11.
3. Fabrega J., Luoma S.N., Tyler C.R., Galloway T.S., Lead J.R. Silver nanoparticles: behaviour and effects in the aquatic environment. Environ Int. 2011; Vol. 37 (2): 517-31.
4. Shumakova A.A., Shipelin V.A., Sidorova Yu.S., Trushina E.N., et al. 12. Toxicological evaluation of nanosized colloidal silver, stabilized with polyvinylpyrrolidone. I. Characterization of nanomaterial, integral, hematological parameters, level of thiol compounds and liver cell apoptosis. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2015; Vol. 84 13. (6): 46-57. (in Russian)
5. Zaitseva N.V., Zemlyanova M.A., Zvezdin V.N., Dovbysh A.A., et al. Toxicological evaluation of nanosized colloidal silver, stabilized with polyvinylpyrrolidone. II. Internal organs morphology. 14. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2016; Vol. 85 (4): 47-55.
(in Russian)
6. Gmoshinsky I.V., Shipelin V.A., Vorozhko I.V., Sentsova T.B., 15. et al. Toxicological evaluation of colloidal nanosized silver stabi-
ized polyvinylpyrrolidone. III. Enzymological, biochemical markers, state of antioxidant defense system. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2016; Vol. 85 (2): 14-23. (in Russian) 16.
7. Sheehy K., Casey A., Murphy A., Chambers G. Antimicrobial properties of nano-silver: A cautionary approach to ionic interference. J Colloid Interface Sci. 2015; Vol. 443 (1): 56-64.
8. Xiu Z.M., Zhang Q.B., Puppala H.L., Colvin V.L., et al. Negligible particle-specific antibacterial activity of silver nanoparticles. Nano 17. Lett. 2012; Vol. 12 (8): 4271-5.
Stensberg M.C., Wei Q., McLamore E.S., Porterfield D.M., et al. Toxicological studies on silver nanoparticles: challenges and opportunities in assessment, monitoring and imaging. Nanomedicine (London). 2011; Vol. 6 (5): 879-98.
Lapresta-Fernandez A., Fernandez A., Blasco J. Nanoecotoxicity effects of engineered silver and gold nanoparticles in aquatic organisms. Trends Anal Chem. 2012; Vol. 32 (2): 40-59. Benetti F., Bregoli L., Olivato I., Sabbioni E. Effects of metal(loid)-based nanomaterials on essential element homeostasis: the central role of nanometallomics for nanotoxicology. Metallomics. 2014; Vol. 6 (4): 729-47.
Van der Zande M., Vandebriel R.J., Doren E.V., Kramer E., et al. Distribution, elimination, and toxicity of silver nanoparticles and silver ions in rats after 28-day oral exposure. ACS Nano. 2012; Vol. 6 (8): 7427-42.
Kim Y.S., Kim J.S., Cho H.S., Rha D.S., et al. Twenty-eight-day oral toxicity, genotoxicity, and gender-related tissue distribution of silver nanoparticles in Sprague-Dawley rats. Inhal Toxicol. 2008; Vol. 20 (6): 575-83.
Park E.J., Bae E., Yi J., Kim Y., et al. Repeated-dose toxicity and inflammatory responses in mice by oral administration of silver nanoparticles. Environ Toxicol Pharmacol. 2010; Vol. 30 (2): 162-8. Shumakova A.A., Smirnova V.V., Tananova O.N., Trushina E.N., et al. Toxicological sanitary characterization of silver nanopar-ticles introduced in gastrointestinal tract of rats. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2011; Vol. 80 (6): 9-18. (in Russian) Khodykina N.V., Gorshenin A.V., Klauchek V.V., Pocheptsov A.Ya., et al. Experimental study of chronic oral toxicity of non-functionalized spherical silver nanoparticles In: Nanotoxicology: Achievements, Problems, Prospects. Volgograd, 2014: 65-6. URL: http://www. twirpx.com/file/1533482/ (in Russian)
Recommended levels of consumption of food and biologically active substances. Guidelines. MR 2.3.1.1915-04.
