CC BY
37
Для корреспонденции
Гмошинский Иван Всеволодович - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Адрес: 109240, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14 Телефон: (495) 698-53-71 E-mail: [email protected]
И.В. Гмошинский, В.А. Шипелин, И.В. Ворожко, Т.Б. Сенцова, С.Х. Сото, Л.И. Авреньева, Г.В. Гусева, Л.В. Кравченко, С.А. Хотимченко, В.А. Тутельян
Токсикологическая оценка наноразмерного коллоидного серебра, стабилизированного поливинилпирролидоном. III. Энзимологические, биохимические маркеры, состояние системы антиоксидантной защиты
Toxicological evaluation of colloidal nano-sized silver stabilized polyvinylpyrrolidone. III. Enzymological, biochemical markers, state of antioxidant defense system
I.V. Gmoshinsky, V.A. Shipelin,
I.V. Vorozhko, T.B. Sentsova, S.Kh. Soto,
L.I. Avren'eva, G.V. Guseva,
L.V. Kravchenko, S.A. Khotimchenko,
V.A. Tutelyan
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», Москва
Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety,
Moscow
Наноразмерное коллоидное серебро (НКС) с размером первичных нано-частиц (НЧ) в интервале 10-80 нм в виде водной суспензии вводили крысам с исходной массой тела 80±10 г в течение первых 30 сут внут-рижелудочно через зонд и далее в течение 62 сут с потребляемым рационом в дозах 0,1; 1,0 и 10 мг на 1 кг массы тела в день в расчете на серебро (Ag). Животные контрольных групп получали деионизованную воду и носитель НЧ - водный раствор стабилизатора поливинилпирроли-дона (ПВП). В печени определяли активности (Vmax) микросомальных монооксигеназ со смешанной функцией изоформ CYP 1A1, 1A2 и 2B1 по их специфическим субстратам, активность конъюгирующих ферментов печени глутатион-Б-трансферазы и УДФ-глюкуронозилтрансферазы в микросомальной фракции и цитозоле, общую и неседиментируемую активность лизосомальных гидролаз. В плазме крови оценивали содержание малонового диальдегида, диеновых конъюгатов полиненасыщенных жирных кислот, а в эритроцитах - активность ферментов антиоксидантной защиты. Изучали комплекс стандартных биохимических показателей сыворотки крови. В результате проведенных исследований выявлены изменения ряда молекулярных маркеров токсического действия. В их числе - повышение активности ключевых ферментов I и II стадий системы детоксикации ксенобиотиков, свидетельствующее о ее функциональном перенапряжении, снижение активностей глу-татионпероксидазы (ГП), общих арилсульфатаз А и В, в-галактозида-зы (при отсутствии изменений в их неседиментируемой активности), уровня мочевой кислоты, повышение активности щелочной фосфатазы. Указанные изменения наблюдались преимущественно при дозе НЧ Ag10 мг на 1 кг массы тела, за исключением ГП, для которой пороговая доза
составляла 1 мг на 1 кг массы тела. Достоверных изменений изученных маркеров при дозе Ag 0,1 мг на 1 кг массы тела не выявлено. Обсуждаются возможные механизмы токсического действия НЧ серебра.
Ключевые слова: серебро, наночастицы, крысы, подострая токсичность, микросомы, цитохром Р450, лизосомы, несе-диментируемая активность, перекисное окисление липидов, микроэлементы
Nanosized colloidal silver (NCS) with primary nanoparticles (NPs) size in the range of 10-80 nm in aqueous suspension was administered to rats with initial weight 80± 10 g for the first 30 day intragastrically and for lasting 62 days with the diet consumed in doses of 0.1; 1.0 and 10 mg/kg of body weight b.w.) per day based on silver (Ag). The control animals received deionized water and carrier of NPs - aqueous solution of stabilizer polyvinylpyrrolidone. Activity (Vmax) was determined in liver of microsomal mixed function monooxygenase isoforms CYP 1A1, 1A2 and 2B1 against their specific substrates, the activity of liver conjugating enzymes (glutathione-S-transferase and UDP-glucuronosyltransferase) in the microsomal fraction and a cytosol, and the overall and non-sedimentable activities of lysosomal hydrolases. In blood plasma there were evaluated malonic dialdehyde, PUFA diene conjugates, in erythrocytes - the activity of antioxidant enzymes. A set of standard biochemical indicators of blood serum was also determined. The studies revealed changes in a number of molecular markers of toxic action. Among them - the increase in the activity of key enzymes I and II stages of detoxification of xenobiotics, indicating its functional overvoltage; reducing the activity of glutathione peroxidase (GP), the total arylsulfatase A and B, ft-galactosidase (in the absence of changes in their non-sedimentable activity), levels of uric acid, increased alkaline phosphatase activity. These changes occurred mainly at the dose Ag of 10 mg/kg b.w., except for the GP to which the threshold dose was 1 mg/kg b.w. No significant changes in the studied markers in a dose Ag 0,1 mg/kg b.w. were identified. Possible mechanisms of the toxic action of silver NPs are discussed.
Keywords: silver, nanoparticles, rats, subacute toxicity, microsomes, cytochrome P450, lysosomes, non-sedimentable activity, lipid peroxidation, trace elements
Наночастицы (НЧ) серебра (Ад) широко используются в медицине, быту и технике главным образом в качестве бактерицидного средства [1-3]. Согласно некоторым данным, их производство в 2015 г. может превысить 1000 т [4, 5], что соответствует около 140 мг на каждого жителя Земли. Экспонирование человека НЧ Ад возможно как непосредственно через потребительскую продукцию (биологически активные добавки к пище, косметика, фармацевтические препараты, текстиль), так и опосредованно, через пищевые продукты и воду, содержащие эти НЧ, мигрировавшие в объекты окружающей среды. Определенное значение в настоящее время приобретает и путь экспозиции отходами НЧ Ад, поступающими в сточные воды и далее на земли сельскохозяйственного назначения, откуда возможна их передача по пищевым цепям и через сельскохозяйственную продукцию к человеку.
Согласно данным многочисленных исследований [6-12], НЧ Ад обладают ингаляционной, эпи-кутанной и пероральной токсичностью для млекопитающих, однако оценки их токсических доз в эксперименте противоречивы. Поскольку механизм токсического действия НЧ Ад, по современным представлениям, состоит главным образом во внутриклеточном высвобождении ими ионов Ад+, являющихся ингибиторами многих ферментов и мембранных транспортных систем [13], наиболее лабильными биомаркерами неблагоприятного действия этих НЧ на организм могут быть активности ключевых ферментов, уровни важнейших метаболитов и показатели, связанные с процессами перекисного окисления липидов (ПОЛ).
Ввиду этого целью настоящей работы является изучение влияния подострого 92-дневного перо-рального введения НЧ Ад лабораторным крысам на активность ряда критически важных микро-
сомальных и лизосомальных ферментов, стабильность лизосомальных мембран, состояние системы антиоксидантной защиты и биохимические показатели сыворотки крови. В качестве объекта исследования выбран образец промышленно выпускаемого наноразмерного коллоидного Ag (НКС), стабилизированного нетоксичным биосовместимым полимером поливинилпирролидоном (ПВП), широко используемый в настоящее время в потребительской продукции.
Материал и методы
В работе использован препарата НКС («кластер-ногосеребра»)«Арговит-С» поТУ 9310-03-7904425912 (ООО НПЦ «Вектор-Вита»1, г. Новосибирск, РФ). Изучаемый образец продукции представлял собой однородную жидкость коричневого цвета (в проходящем свете) с зеленовато-серым оттенком (в отраженном свете), с небольшой опалесцен-цией и максимумом поглощения в видимой области спектра ^=403,2 нм. Согласно данным анализа методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой2) на приборе «Agilent 7700 MS» («Agilent», Япония), общее содержание Ag в неразбавленном растворе НКС составляло 10,09±0,04 мг/см3, содержание ПВП, по данным изготовителя, - 190 мг/см3. Характеристика образца методами трансмиссионной электронной микроскопии и динамического лазерного светорассеяния показала, что в составе НКС присутствовали НЧ Ag с диаметрами менее 5, 10-20 и 50-80 нм; 80% частиц имели гидродинамический диаметр в интервале 10,6-61,8 нм; индивидуальные частицы размером более 100 нм практически отсутствовали.
Эксперимент выполнен на 5 группах по 15 крыс-самцов линии Вистар с исходной массой тела 80±10 г, полученных из питомника РАН «Столбовая». На протяжении всего эксперимента животные получали сбалансированный полусинтетический рацион согласно МУ 1.2.2520-09. Крыс размещали в клетках группами по 3 особи, рацион и воду предоставляли в режиме свободного неограниченного доступа. Животные 1-й (контрольной) группы получали носитель - деионизованную воду, крысы 2-й группы - ПВП в виде водного раствора в дозе 200 мг на 1 кг массы тела, крысы групп с 3-й по 5-ю - эквивалентное количество ПВП и НКС в дозах соответственно 0,1; 1 и 10 мг на 1 кг массы тела в расчете на Ag. В течение первых 30 сут введение тестируемых препаратов
осуществляли внутрижелудочно через зонд, а на протяжении последующих 62 сут НКС и ПВП добавляли к корму животных. Доза ПВП в группах животных со 2-й по 4-ю была выбрана, исходя из количества этого вещества, потребляемого с препаратом НКС крысами 5-й группы. В ходе эксперимента крыс ежедневно взвешивали на электронных весах (с точностью ±1 г), фиксировали заболеваемость, летальность, внешний вид, активность, состояние шерстяного покрова, стула, особенности поведения. На протяжении 2-го и 3-го месяцев эксперимента поедаемость корма животными всех групп была практически 100%, что позволило рассчитать дозу Ад и ПВП, исходя из фактически потребленного количества рациона.
Выведение животных из эксперимента осуществляли на 93-и сутки декапитацией под эфирной анестезией. У 6 животных из каждой группы отбирали печень целиком, гомогенизировали ее в 0,1 М Трис-НС1 буфере рН 7,4, охлажденном до 0...+2 оС в соотношении 1:4 по массе. Гомо-генат подвергали фракционированию методом дифференциального центрифугирования на препаративной ультрацентрифуге «Весктап L7-65» («Весктап», США) с получением микросомальной и цитозольной фракций. Содержание изоформ микросомальных монооксигеназ оценивали по величине активности: этоксирезоруфин-деалкилаз-ной (изоформа CYP1A1), 7-метоксирезоруфин-О-деметилазной (CYP1A2) и 7-пентоксирезоруфин-О-деалкилазной (CYP2B1), используя специфические субстраты [14, 15].
Активность лизосомальных ферментов р-глю-куронидазы, р-галактозидазы, арилсульфатаз А и В исследовали согласно [16] в цельном гомоге-нате печени (общая активность) и во фракции ци-тозоля (неседиментируемая активность). Общую активность конъюгирующих ферментов глутатион-Б-трансферазы и УДФ-глюкуронозилтрансферазы определяли в цитозоле и в микросомах по методам [17, 18] соответственно. Все измерения ферментативных активностей проводили в условиях насыщения ферментов субстратами ([Б]>>Кт).
Биохимические показатели сыворотки крови (общий белок, альбумин, глюкоза, креатинин, мочевая кислота, мочевина), активность трансаминаз печени [аланинами нотрансферазы (АЛТ) и аспар-татаминотрансферазы (АСТ)], а также суммарной щелочной фосфатазы (ЩФ) определяли на биохимическом анализаторе («Копе1аЬ», Финляндия).
Исследования показателей ПОЛ и системы ан-тиоксидантной защиты в эритроцитах и плазме крови проводили на биохимическом анализаторе
1 Авторы благодарят кандидата химических наук В.А. Бурмистрова за предоставленный для исследования образец коллоидного серебра.
2 Исследование проведено научным сотрудником лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» А.А. Шумаковой.
«ФП-901» («Labsystems OY», Финляндия). Активность глутатионредуктазы эритроцитов определяли по методу Tillotson и соавт. (1971) в адаптации, согласно [19], глутатионпероксидазы (ГП) эритроцитов - на основе метода Mille в модификации [20], каталазы - по методу Oshino с соавт. в модификации [21], супероксиддисмутазы эритроцитов - на основе метода Niashikimi и соавт. в модификации [21]. Содержание малонового ди-альдегида в гомогенате печени оценивали по методу Mihara и соавт. [22]. Содержание диеновых конъюгатов полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) в гомогенатах печени определяли спект-рофотометрическим методом [23].
Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета SPSS 18.0 согласно критерию Стьюдента, непараметрическому ранговому критерию Манна-Уитни и критерию ANOVA (однофакторный дисперсионный анализ). Различия признавали статистически значимыми при уровне p<0,05.
Результаты
Как следует из данных, представленных в табл. 1, активность микросомальных моноокси-
геназ изоформ CYP1A1, CYP1A2 и CYP2B1 по отношению к их специфическим субстратам в печени животных опытных групп изменялась в сравнении с контролем сходным образом. А именно, у крыс 2-й группы, получавших стабилизатор ПВП, активности снижались (максимально в случае CYP1A1, на 30%, р1-2<0,05), а у животных, получавших НКС в возрастающих дозах (с 3-й по 5-ю группу), до-зозависимо возрастали. Максимальный прирост активности (в сравнении со 2-й группой) наблюдался в 5-й группе (на 34, 32 и 19% для 3 изоформ соответственно в сравнении со 2-й группой; р2-5<0,05 во всех случаях). Достоверное возрастание активности CYP1A2 и CYP2B1 наблюдалось также в сравнении с крысами 2-й группы также и у животных 4-й группы.
Внутрижелудочное введение НКС оказало влияние на активность конъюгирующих ферментов II стадии детоксикации ксенобиотиков. Так, активность глутатионтрансферазы в печени крыс 5-й группы возрастала на 22% в сравнении с 1-й группой и на 13% по сравнению со 2-й группой (р1-52-5<0,05), активность УДФ-глюкуроно-зилтрансферазы - на 60 и 42% соответственно (р1-52-5<0,05). Таким образом, прием НЧ Ад в течение 92 сут в дозе более 1 мг на 1 кг массы тела не только не оказал угнетающего действия
Таблица 1. Активность ферментов I и II фазы детоксикации ксенобиотиков у крыс 1-5-й групп (М±т)
Группа Количество Показатель
животных, крыс этоксирезору- метоксире- пентокси- глутатион- УДФ-глю-
дозы финдеалкила- зоруфин- резоруфин- трансфера- куронозил-
вводимых за (CYP1A1), деалкилаза деалкилаза за, мкмоль/ трансфера-
препаратов пмоль/ (CYP1A2), (CYP2ß1), минхмг за, нмоль/
минхмг пмоль/ пмоль/ белка минхмг
белка минхмг белка минхмг белка белка
1-я, контрольная, деионизованная вода 6 4,97±0,65 51,0±3,8 15,1 ±0,6 0,958±0,028 13,2±0,7
2-я, ПВП 200 мг/кг 6 3,45±0,22 40,7±7,0 12,9±0,4 1,035±0,023 14,8±1,3
3-я, ПВП 200 мг/кг + НКС 0,1 мг/кг по Ад 6 3,57±0,69 45,6±5,1 13,6±0,5 0,972±0,035 13,8±1,5
4-я, ПВП 180 мг/кг + НКС 1 мг/кг по Ад 6 3,33±0,39 58,0±2,4 14,7±0,5 0,995±0,052 12,8±1,9
5-я, НКС 10 мг/кг по Ад 6 4,65±0,37 60,1 ±4,6 15,6±0,3 1,167±0,032 21,1 ±0,9
Однородность распределения, 1-5-я группы, ANOVA, р >0,05 0,044 0,002 0,002 0,001
1-я и 2-я группы >0,05/0,045 >0,05/>0,05 0,01/0,016 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
«о ^ 1-я и 3-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
сог 1-я и 4-я группы >0,05/0,037 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
S = 1-я и 5-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 0,001/0,004 0,000/0,004
Её •= S оя н 2-я и 3-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
оир 2-я и 4-я группы >0,05/>0,05 0,042/>0,05 0,012/0,025 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
2-я и 5-я группы 0,021/0,03 0,043/0,037 0,000/0,004 0,007/0,01 0,002/0,008
П р и м е ч а н и е. Здесь и в табл. 2-4: * - числитель дроби - t-критерий Стьюдента; знаменатель - непараметрический критерий Манна-Уитни.
на систему детоксикации ксенобиотиков, но и повысил активность некоторых ее ключевых компонентов.
Противоположным по направленности оказалось воздействие НКС на активность лизосо-мальных ферментов. Данные, представленные в табл. 2, свидетельствуют о том, что общие активности арилсульфатаз А и В, а также р-галактози-дазы были достоверно снижены у крыс 5-й группы в сравнении с животными 2-й группы (p2-5<0,05), а в первом случае - также и с животными 1-й группы (p1-5<0,05). На активность р-глюкурони-дазы прием НКС не оказал видимого воздействия. Неседиментируемая активность перечисленных лизосомальных гидролаз, маркирующая стабильность мембран лизосом гепатоцитов, во всех опытных группах животных (с 3-й по 5-ю) недостоверно отличалась от контроля.
Анализ биохимических показателей сыворотки крови (табл. 3) показывает, что активность АЛТ достоверно не отличалась от контроля во всех опытных группах животных. Активность АСТ была достоверно повышена в сравнении с контролем у крыс, получавших ПВП (2-я группа), но практически не изменена у животных, которым вводили НКС (3-5-я группы). При этом во всех случаях средняя активность первой из этих трансаминаз находились в пределах погрешности анализа внутри коридора референтных значений для крыс данного пола и возраста (39,9-59,1 ед/л согласно [24]), а второй -ниже установленной нижней границы нормы (101,0160,6 ед/л). Таким образом, признаков токсического
действия НКС животных по показателям активности трансаминаз в сыворотке крови не выявлено. При этом у животных 5-й группы, получавших НКС в наибольшей дозе, отмечено достоверное (р1-5<0,05) возрастание активности ЩФ на 51% в сравнении с животными контрольной группы. Среднее значение активности ЩФ у крыс 5-й группы превышало верхнюю границу нормы (85,8-166,8 ед/л, [24]). Ни ПВП, ни НКС в меньших дозах не оказывали видимого воздействия на этот показатель.
Среди показателей азотистого обмена уровень креатинина сыворотки крови был достоверно повышен у крыс 5-й группы в сравнении с животными 1-й группы, а уровень мочевой кислоты - достоверно снижен в сравнении как с животными 1-й группы, так и 2-й. Остальные изученные биохимические показатели (общий белок, альбумин, мочевина, глюкоза) значимо не различались во всех группах животных.
Показатели ПОЛ и активности ферментов системы антиоксидантной защиты, представленные в табл. 4, свидетельствуют о наличии ряда эффектов со стороны приема НКС. Так, уровень малонового диальдегида оказывался достоверно снижен в 4-й группе по сравнению со 2-й группой, тогда как концентрация диеновых конъюгатов практически не изменялась в зависимости от дозы наноматериала. Активность супероксиддисмута-зы достоверно снизилась в 4-й группе (р2-4<0,05), однако этот эффект не фиксируется при наибольшей дозе наноматериала. Активности глутати-онредуктазы и каталазы значимо не различались
Таблица 2. Активность лизосомальных гидролаз и доля их неседиментируемой активности у крыс 1-5-й групп (M±m)
Группа Количество Показатель
животных крыс общая неседимен- общая неседимен- общая неседимен-
активность тируемая активность тируемая активность тируемая
арилсуль- активность в-галак- активность в-глюку- активность
фатаз А и В, мкмоль/ арилсуль-фатаз А и В, тозидазы, мкмоль/ в-галакто-зидазы, ронидазы, мкмоль/ в-глюкуро-нидазы,
минхг % от общей минхг % от общей минхг % от общей
ткани ткани ткани
1-я 6 2,76±0,12 5,51 ±0,11 2,55±0,09 9,15±0,69 2,33±0,13 4,89±0,34
2-я 6 2,91 ±0,17 5,08±0,30 2,77±0,12 9,01 ±0,67 2,31 ±0,09 4,49±0,30
3-я 6 2,90±0,13 5,04±0,38 2,76±0,07 8,19±0,98 2,25±0,11 4,59±0,37
4-я 6 3,0±0,11 5,84±0,46 2,66±0,15 9,82±0,45 2,41 ±0,13 4,93±0,12
5-я 6 2,45±0,04 5,28±0,37 2,41±0,09 9,24±0,29 2,21 ±0,08 4,97±0,29
Однородность распределения, 1-5-я группы, ANOVA, р 0,027 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
1-я и 2-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
«О ^ 1-я и 3-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
сог 1-я и 4-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
1-я и 5-я группы 0,041 />0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
8 = ® ян 2-я и 3-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
2-я и 4-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
Si" 2-я и 5-я группы 0,021/0,037 >0,05/>0,05 0,041/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
Таблица 3. Биохимические показатели сыворотки крови у крыс 1-5-й групп (М±т)
Группа животных Количество крыс Показатель
АЛТ, ед./л АСТ, ед/л щелочная фос-фатаза, ед./л альбумин, г/л белок общий, г/л глюкоза, ммоль/л креатинин, мкмоль/л мочевая кислота, мкмоль/л мочевина, мкмоль/л
1-я 6 56,4±2,6 27,2±5,0 149,4±16,6 33,3±0,8 67,8±2,1 5,97±0,15 45,7±2,0 49,4±4,9 8,15±0,39
2-я 6 59,9±4,1 40,0±6,3 149,4±24,0 32,7±0,5 66,3±1,0 5,88±0,22 48,7±1,8 37,8±3,2 7,90±0,51
3-я 6 62,5±2,9 47,6±4,6 212,2±37,0 32,3±0,6 66,7±1,2 6,43±0,16 52,7±2,4 52,5±5,6 8,58±0,64
4-я 6 62,0±2,9 39,1 ±14,8 151,8±24,8 31,9±0,6 65,4±1,1 5,81 ±0,26 48,9±0,6 48,6±4,0 7,26±0,44
5-я 6 57,4±5,3 25,3±5,3 226,4±28,6 33,9±0,7 66,0±1,4 6,32±0,32 52,5±1,5 23,0±3,1 7,50±0,44
Однородность распределения, 1-5-я группы, А1\10\/А, р >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 0,045 <0,001 >0,05
Достоверность* различия при попарном сравнении групп, р 1-я и 2-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
1-я и 3-я группы >0,05/>0,05 0,013/0,025 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 0,047/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
1-я и 4-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
1-я и 5-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 0,042/0,037 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 0,019/0,025 0,001/0,006 >0,05/>0,05
2-я и 3-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 0,046/>0,05 >0,05/>0,05
2-я и 4-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
2-я и 5-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 0,008/0,016 >0,05/>0,05
Таблица 4. Показатели перекисного окисления липидов и активности ферментов антиоксидантной защиты у крыс 1-5-й групп (М±т)
со
Группа Количество Показатель
животных крыс содержание диеновых содержание мало- активность глутати- активность глутати- активность суперок- активность ката-
конъюгатов ПНЖК в плазме, нмоль/мл нового диальдегида в плазме, нмоль/мл онпероксидазы эритр., МКМОЛЬ/МИНХМЛХЭр онредуктазы эритр., мкмоль/ минхмлхэр сиддисмутазы эритр., усл. ед/млхэр лазы эритр., ки/млхэр
1-я 6 3,08±0,13 4,78±0,11 32,6±3,3 2,12±0,33 1609±38 385±62
2-я 6 3,05±0,13 4,69±0,19 36,7±2,9 2,24±0,20 1594±84 400±64
3-я 6 3,22±0,07 4,74±0,17 30,2±2,8 1,81 ±0,22 1542±77 373±42
4-я 6 3,05±0,08 4,20±0,08 27,5±2,1 1,75±0,12 1295±118 367±70
5-я 6 3,06±0,16 4,58±0,17 16,7±1,7 2,06±0,13 1506±42 431 ±76
Однородность распределения, 1-5-я группы, А1\10\/А, р >0,05 >0,05 <0,001 >0,05 >0,05 >0,05
Достоверность* 1-я и 2-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
различия при 1-я и 3-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
попарном срав- 1-я и 4-я группы >0,05/>0,05 0,001/0,004 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 0,044/>0,05 >0,05/>0,05
нении групп,р 1-я и 5-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 0,003/0,002 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
2-я и 3-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
2-я и 4-я группы >0,05/>0,05 0,039/0,025 0,028/0,037 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
2-я и 5-я группы >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 0,000/0,004 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05 >0,05/>0,05
о Е
00 >
00
00 о -а о К
между группами животных. Наиболее выраженным и дозозависимым является воздействие приема НКС на активность глутатионпероксидазы, активность которой в 2 и более раза снижена у крыс 5-й группы в сравнении с животными 1-й и 2-й групп. Минимальная доза Ag, при которой отмечается этот эффект, составляет, как показывают полученные данные, 1 мг на 1 кг массы тела.
Обсуждение
В ряде работ, посвященных изучению токсических свойств НЧ Ag, его неблагоприятное воздействие на организм лабораторных животных не было выявлено вплоть до весьма высоких доз, порядка 100 мг на 1 кг массы тела и более [7, 12, 13]. На основании этого высказывались предположения, что токсичность НКС для организма высших животных невелика. Противоречия в оценке токсичности НЧ Ag наряду с очевидными причинами, состоящими в использовании в различных работах образцов НЧ с разными размерами и функционализацией поверхности, может состоять и в выборе недостаточно лабильных маркеров токсического действия. Из того, что в основе предполагаемого токсического эффекта НКС, по современным представлениям, лежит взаимодействие высвобождаемых из НЧ ионов Ag+ с тиоловыми группами ферментов и мембранных белков, следует предположение, что чувствительными мишенями воздействия этого наноматериала могут быть ключевые для метаболизма ферментные системы и клеточные мембраны. Большой интерес в этом отношении представляет оценка влияния нанотоксического фактора на ферментные системы I и II фазы деток-сикации ксенобиотиков в печени (белки семейства цитохрома Р450, конъюгирующие трансферазы), поскольку от их функционального состояния критическим образом зависит гомеостаз клетки. При оценке влияния на мембраны информативным показателем является доля неседиментируемой активности лизосомальных гидролаз, так как именно с дестабилизацией лизосомальных мембран, по современным представлениям, связаны ранние этапы гибели клетки.
При выявлении всех этих эффектов нельзя исключить возможность того, что стабилизатор наноматериала - ПВП, считающийся инертным биосовместимым полимером, в условиях длительного поступления в организм способен тем не менее повлиять на изучаемые биомаркеры токсичности. В частности ранее была отмечена его способность незначительно угнетать активность изоформ цитохрома Р 450 CYP1A2 и CYP2B1 [25], подтвержденная данными, полученными в настоящем исследовании. На этом фоне НЧ Ag, вводимые вместе с ПВП, оказывают противо-
положное ему действие, приводя к повышению активности всех изученных изоформ микросо-мальных монооксигеназ начиная с дозы НКС 1 мг на 1 кг массы тела. Активность конъюгирующих ферментов печени глутатионтрансферазы и УДФ-глюкуронозилтрансферазы также специфически повышается у животных, получавших НКС, причем данный эффект является значимым при дозе 10 мг на 1 кг массы тела. Можно предположить, что выявленные изменения свидетельствуют о функциональном перенапряжении систем I и II стадий детоксикации ксенобиотиков.
Другими чувствительными энзиматическими маркерами воздействия НЧ Ag, как показали проведенные исследования, являются лизосомальные ферменты арилсульфатазы А, В и р-галактозида-за. Известно, что при недостаточности арилсуль-фатаз возможно развитие некоторых лизосомных болезней накопления, проявляющихся, в частности, в отложении в тканях животных липофусцина [26]. Лизосомальная р-галактозидаза выполняет важную биологическую функцию, участвуя в контроле роста клеток и, в частности, в феномене их репликативного старения [27]. Доза НКС, при которой отмечаются изменения активности обоих маркерных ферментов, составляет не менее 10 мг на 1 кг массы тела. При этом важно отметить, что даже в наибольшей дозе НКС значимо не влияет на величину неседиментируемой активности лизосомальных гидролаз, и, следовательно, наблюдаемые изменения не связаны с изменением под действием НЧ Ag стабильности лизосо-мальных мембран.
В литературе имеются данные о том, что НЧ Ag являются индукторами оксидантного стресса в клеточных культурах in vitro и в организмах гид-робионтов [13, 28]. Эти эффекты наблюдаются, однако, только при достаточно высоких концентрациях НЧ (0,1 мг/см3 по Ag), причем покрытие ПВП препятствует их проявлению. По-видимому, благодаря этому стандартные показатели ПОЛ, изученные в настоящем эксперименте (уровни малонового диальдегида и диеновых конъюгатов сыворотки крови животных) не возрастают даже при наибольшей дозе НКС.
В числе чувствительных маркеров воздействия НКС на организм животных следует указать также на активность ферментов ЩФ и ГП. Достоверное и выраженное повышение активности ЩФ под действием введения НКС в дозе 10 мг на 1 кг массы тела не может быть, по-видимому, объяснено повреждением гепатоцитов, поскольку не сопровождается соответствующим ростом активности АЛТ и АСТ. Активность ГП эритроцитов, напротив, с ростом дозы НКС монотонно снижается, причем пороговой дозой НКС для проявления этого эффекта является 1 мг на 1 кг массы тела. При объяснении этих эффектов следует иметь
в виду, что активность обоих этих ферментов в организме зависит от микроэлементного статуса: ЩФ - от обеспеченности цинком, а ГП -селеном. Это позволяет предположить, что в механизме действия на организм НЧ Ад определенную роль может играть взаимодействие Ад с другими микроэлементами.
Таким образом, проведенный эксперимент позволил выявить ряд чувствительных энзиматичес-ких маркеров воздействия на организм экспериментальных животных НЧ Ад в составе препарата
НКС, стабилизированного ПВП. В числе этих маркеров - активности изоформ цитохрома Р450 CYP1A1, 1А2 и 2В1, конъюгирующих ферментов, ЩФ, ГП. Изменения всех перечисленных маркеров, а также показателей азотистого обмена (креатинин, мочевая кислота) отмечаются в интервале доз НКС от 1,0 до 10,0 мг на 1 кг массы тела в условиях 92-суточного перорального поступления. В дозе 0,1 мг на 1 кг массы тела никаких изменений в активности исследованных маркеров не выявлено.
Сведения об авторах
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва):
Гмошинский Иван Всеволодович - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий E-mail: [email protected]
Шипелин Владимир Александрович - кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий E-mail: [email protected]
Ворожко Илья Викторович - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории клинической биохимии, иммунологии и аллергологии E-mail: [email protected]
Сенцова Татьяна Борисовна - доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией клинической биохимии, иммунологии и аллергологии E-mail: [email protected]
Сото Селада Хорхе - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории метаболом-ного и протеомного анализа E-mail: [email protected]
Авреньева Людмила Ивановна - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории энзимологии питания E-mail: [email protected]
Гусева Галина Владимировна - кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории энзимо-логии питания E-mail: [email protected]
Кравченко Лидия Васильевна - кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории энзимологии питания E-mail: [email protected]
Хотимченко Сергей Анатольевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий, врио заместителя директора E-mail: [email protected]
Тутельян Виктор Александрович - академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией энзимологии питания, научный руководитель E-mail: [email protected]
Литература
Fabrega J., Fawcett S., Renshaw J., Lead J. Silver nanoparticle impact on bac-terial growth: effect of pH, concentration, and organic matter // Environ. Sci. Technol. 2009. Vol. 43, N 19. P. 7285-7290. Savage N., Diallo M.S. Nanomate-rials and water purification: opportunities and challenges // J. Nanopart. Res. 2005. Vol. 7, N 4-5. P. 331-342.
Zodrow K., Brunet L., Mahendra S., Li D. et al. Polysulfone ultrafiltration membranes impregnated with silver nanoparticles show improved biofouling resistance and virus removal // Water Res. 2009. Vol. 43, N 3. P. 715-723.
Stensberg M.C., Wei Q., McLamore E.S., Porterfield D.M. et al. Toxicological studies on silver nanoparticles: challenges and opportunities in assessment, monitoring and imaging // Nanomedicine (London). 2011. Vol. 6, N 5. P. 879-898.
The future demand of silver: industrial demand. The Silver Institute. Washington DC, 2011. P. 27-32. URL: www.sil-verinstitute.org/site/wp-content/uploads/ 2012/11/ OutlookSilver Demand.pdf
Hong J.S., Kim S., Lee S.H., Jo E. et al. Combined repeated-dose toxicity study of silver nanoparticles with the reproduction/devel-
2.
3
6
opmental toxicity screening test // Nanotoxicology. 2014. Vol. 8, N 4. P. 349-362.
7. Kim Y.S., Kim J.S., Cho H.S., Rha D.S. et al. Twenty-eight-day oral toxicity, genotoxicity, and gender-related tissue distribution of silver nanoparticles in Sprague-Dawley rats // Inhal. Toxicol. 2008. Vol. 20, N 6. P. 575-583.
8. Korani M., Rezayat S.M., Gilani K., Arbabi Bidgoli S. et al. Acute and subchronic dermal toxicity of nanosilver in guinea pig // Int. J. Nano-med. 2011. Vol. 6. P. 855-862.
9. Park E.J., Bae E., Yi J., Kim Y. et al. Repeated-dose toxicity and inflammatory responses in mice by oral administration of silver nanoparticles // Environ. Toxicol. Pharmacol. 2010. Vol. 30, N 2. P. 162-168.
10. Sung J.H., Ji J.H., Park J.D., Yoon J.U. et al. Subchronic inhalation toxicity of silver nanoparticles // Toxicol. Sci. 2009. Vol. 108, N 2. P. 452-461.
11. Sung J.H., Ji J.H., Yoon J.U., Kim D.S. et al. Lung function changes in Sprague-Dawley rats after prolonged inhalation exposure to silver nanoparticles // Inhal. Toxicol. 2008. Vol. 20, N 6. P. 567-574.
12. Van der Zande M., Vandebriel R.J., Doren E.V., Kramer E. et al. Distribution, elimination, and toxicity of silver nanoparticles and silver ions in rats after 28-day oral exposure // ACS Nano. 2012. Vol. 6, N 8. P. 74 2 7-7442.
13. Lapresta-Fernandez A., Fernandez A., Blasco J. Nanoecotoxicity effects of engineered silver and gold nanoparticles in aquatic organisms // Trends Anal. Chem. 2012. Vol. 32, N 2. P. 40-59.
14. Burke M.D., Thompson S., Elcombe C.R., Halpert J. et al. Ethoxy-, pentoxy- and benzyloxyphenoxazones and homologues: a series of substrates to distinguish between different induced cytochromes P-450 // Biochem. Pharmacol. 1985. Vol. 34, N 18. P. 3337-3345.
15. Lake B.G. Preparation and characterization of microsomal fractions for studies on xeno-biotic metabolism // Biochemical Toxicologe - a Practical Approach / eds K. Snell, B. Mullock Oxford, UK : IRL Press, 1987. P. 183-215.
16. Дингл Д. Лизосомы. Методы исследования : пер. с англ. М. : Мир, 1980. 342 с.
17. Burchell B., Weatherill P. 4-Nitrophenol UDP-glucuroniltransferase (rat liver) // Methods Enzymol. 1981. Vol. 77. P. 169-176.
18. Habig W.H., Pabst M.J., Jakoby W.B. Glutathione-S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation // J. Biol. Chem. 1974. Vol. 249, N 22. P. 7130-7139.
19. Мальцев Г.Ю., Орлова Л.А. Оптимизация определения активности глутатионредуктазы эритроцитов человека на полуавтоматическом анализаторе // Вопр. мед. химии. 1994. № 2. С. 59-61.
20. Мальцев Г.Ю., Тышко Н.В. Методы определения содержания глютатиона и активности глутатионпероксидазы в эритроцитах // Гиг. и сан. 2002. № 2. С. 69-72.
21. Мальцев Г.Ю., Васильев А.В. Способ определения активности каталазы и супероксиддисмутазы эритроцитов на анализаторе открытого типа // Вопр. мед. химии. 1994. № 2. С. 56-58.
22. Mihara M., Uchiyama M., Fukuzawa K. Thiobarbituric acid value on fresh ho-mogenate of rat as a parameter of lipid peroxidation in aging , CCl4 intoxication and vitamin E deficiency // Biochem. Med. 1980. Vol. 23, N 3. P. 302-311.
23. Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови // Лаб. дело. 1983. № 3. С. 33-35.
24. Zhang Z.P., Tian Y.H., Li R., Cheng X.Q. et al. The comparison of the normal blood biochemical values of Wistar rats with different age and sex // Asian J. Drug Metab. Pharmacokinet. 2004; Vol. 4, N 3. P. 215-218.
25. Шумакова А.А., Смирнова В.В., Тананова О.Н., Трушина Э.Н. и др. Токсиколого-гигиеническая характеристика наночастиц серебра, вводимых в желудочно-кишечный тракт крыс // Вопр. питания. 2011. Т. 80, № 6. С. 9-18.
26. Jolly R.D., Walkley S.U. Lysosomal storage diseases of animals: an essay in comparative pathology // Vet. Pathol. 1997. Vol. 34, N 6. P. 527-548.
27. Dimri G.P., Lee X., Basile G., Acosta M. et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1995. Vol. 92, N 20. P. 9363-9367.
28. Farkas J., Christian P., Gallego-Urrea J.A., Roos N. et al. Uptake and effects of manufactured silver nanoparticles in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) gill cells // Aquat. Toxicol. 2011. Vol. 101, N 1. P. 117-125.
References
Fabrega J., Fawcett S., Renshaw J., Lead J. Silver nanoparticle 9. impact on bac-terial growth: effect of pH, concentration, and organic matter. Environ Sci Technol. 2009; Vol. 43 (19): 7285-90. Savage N., Diallo M.S. Nanomate-rials and water purification: 10. opportunities and challenges. J Nanopart Res. 2005; Vol. 7 (4-5): 331-42. 11.
Zodrow K., Brunet L., Mahendra S., Li D., et al. Polysulfone ultrafiltration membranes impregnated with silver nanoparticles show improved biofouling resistance and virus removal. Water Res. 2009; 12. Vol. 43 (3): 715-23.
Stensberg M.C., Wei Q., McLamore E.S., Porterfield D.M., et al. Toxicological studies on silver nanoparticles: challenges and opportunities in assessment, monitoring and imaging. Nanomedicine 13. (London). 2011; Vol. 6 (5): 879-98.
The future demand of silver: industrial demand. The Silver Institute. Washington DC, 2011: 27-32. URL: www.silverinstitute.org/site/wp- 14. content/uploads/ 2012/11/ OutlookSilverDemand.pdf] Hong J.S., Kim S., Lee S.H., Jo E., et al. Combined repeated-dose tox-icity study of silver nanoparticles with the reproduction/developmental toxicity screening test. Nanotoxicology. 2014; Vol. 8 (4): 349-62. 15. Kim Y.S., Kim J.S., Cho H.S., Rha D.S., et al. Twenty-eight-day oral toxicity, genotoxicity, and gender-related tissue distribution of silver nanoparticles in Sprague-Dawley rats. Inhal Toxicol. 2008; Vol. 20 (6): 575-83. 16.
Korani M., Rezayat S.M., Gilani K., Arbabi Bidgoli S., et al. Acute and subchronic dermal toxicity of nanosilver in guinea pig. Int J Nano- 17. med. 2011; Vol. 6: 855-62.
Park E.J., Bae E., Yi J., Kim Y., et al. Repeated-dose toxicity and inflammatory responses in mice by oral administration of silver nanoparticles. Environ Toxicol Pharmacol. 2010; Vol. 30 (2): 162. Sung J.H., Ji J.H., Park J.D., Yoon J.U., et al. Subchronic inhalation toxicity of silver nanoparticles. Toxicol. Sci. 2009; Vol. 108 (2): 452-61. Sung J.H., Ji J.H., Yoon J.U., Kim D.S., et al. Lung function changes in Sprague-Dawley rats after prolonged inhalation exposure to silver nanoparticles. Inhal Toxicol. 2008; Vol. 20 (6): 567-74. Van der Zande M., Vandebriel R.J., Doren E.V., Kramer E., et al. Distribution, elimination, and toxicity of silver nanoparticles and silver ions in rats after 28-day oral exposure. ACS Nano. 2012; Vol. 6 (8): 742 7-42.
Lapresta-Fernandez A., Fernandez A., Blasco J. Nanoecotoxicity effects of engineered silver and gold nanoparticles in aquatic organisms. Trends Anal Chem. 2012; Vol. 32 (2): 40-59. Burke M.D., Thompson S., Elcombe C.R., Halpert J., et al. Ethoxy-, pentoxy- and benzyloxyphenoxazones and homologues: a series of substrates to distinguish between different induced cytochromes P-450. Biochem Pharmacol. 1985; Vol. 34 (18): 3337-45. Lake B.G. Preparation and characterization of microsomal fractions for studies on xeno-biotic metabolism In: K. Snell, B. Mullock (eds). Biochemical Toxicology — a Practical Approach. Oxford, UK: IRL Press, 1987: 183-215.
Dingle J.T., ed. Lysosomes: A laboratory handbook. Amsterdam: North Holland Publishing Co., 1972: 340 p. (in Russian) Burchell B., Weatherill P. 4-Nitrophenol UDP-glucuroniltransferase (rat liver). Methods Enzymol. 1981; Vol. 77: 169-76.
2
3
5.
6
7
8
M.B. fMomuHCKHM, B.A. WunenuH, M.B. BOPOWKO u gp.
18. Habig W.H., Pabst M.J., Jakoby W.B. Glutathione-S-transferases. The first enzymatic step in mercapturic acid formation. J Biol Chem. 1974; Vol. 249 (22): 7130-9.
19. Maltsev G.Yu., Orlova L.A. Optimisation of measurement of human red blood cells glutathione reductase activity in semi-automatic analyser. Voprosy meditsinskoy khimii [Problems of Medical Chemistry]. 1994; Vol. 2: 59-61. (in Russian)
20. Maltsev G.Yu., Tyshko N.V. Methods of determination of glutathione and glutathione peroxidase activity in red blood cells. Gigiena i sani-tariia [Hygiene and Sanitation]. 2002; Vol. 2: 69-72. (in Russian)
21. Maltsev G.Yu., Vasil'ev A.V. A method of activity determination of red blood cells catalase and superoxide dismutase in open type analyser. Voprosy meditsinskoy khimii [Problems of Medical Chemistry]: 1994; Vol. 2: 56-8. (in Russian)
22. Mihara M., Uchiyama M., Fukuzawa K. Thiobarbituric acid value on fresh ho-mogenate of rat as a parameter of lipid peroxidation in aging, CCl4 intoxication and vitamin E deficiency. Biochem Med. 1980; Vol. 23 (3): 302-11.
23. Gavrilov V.B., Mishkorudnaya M.I. Spectrophotometric determination of lipid hydroperoxide content in the blood plasma. Laborator-noe delo [Laboratory work]. 1983; Vol. 3: 33-5. (in Russian)
24. Zhang Z.P., Tian Y.H., Li R., Cheng X.Q., et al. The comparison of the normal blood biochemical values of Wistar rats with different age and sex. Asian J Drug Metab. Pharmacokinet. 2004; Vol. 4 (3): 215-8.
25. Shumakova A.A., Smirnova V.V., Tananova O.N., Trushina E.N., et al. Toxicological sanitary characterization of silver nanoparticles introduced in gastrointestinal tract of rats. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2011; Vol. 80 (6): 9-18. (in Russian)
26. Jolly R.D., Walkley S.U. Lysosomal storage diseases of animals: an essay in comparative pathology. Vet Pathol. 1997; Vol. 34 (6): 527-48.
27. Dimri G.P., Lee X., Basile G., Acosta M., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci USA. 1995; Vol. 92 (20): 9363-7.
28. Farkas J., Christian P., Gallego-Urrea J.A., Roos N., et al. Uptake and effects of manufactured silver nanoparticles in rainbow trout (Oncorhyn-chus mykiss) gill cells. Aquat Toxicol. 2011; Vol. 101 (1): 117-25.
