CC BY
44
ГИГИЕНА ПИТАНИЯ
Для корреспонденции
Гмошинский Иван Всеволодович - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБНУ «НИИ питания» Адрес: 109240, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14 Телефон: (495) 698-53-71 E-mail: gmosh@ion.ru
H.B. Зайцева1, М.А. Землянова1, 2, В.Н. Звездин1, A.A. Довбыш1, И.В. Гмошинский3, С.А. Хотимченко3, Т.И. Акафьева4
Токсикологическая оценка наноразмерного коллоидного серебра, стабилизированного поливинилпирролидоном, в 92-дневном эксперименте на крысах. II. Морфология внутренних органов
1 ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» Роспотребнадзора, Пермь
2 ФГБОУ ВПО «Пермский национальный исследовательский политехнический университет»
3 ФГБНУ «НИИ питания», Москва
4 ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет»
1 Federal Scientific Center for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies, Perm'
2 Perm National Research Polytechnic University
3 Institute of Nutrition, Moscow
4 Perm State National Research University
Toxicological evaluation of nanosized colloidal silver, stabilized with polyvinylpyrrolidone, in 92-day experiment on rats. II. Internal organs morphology
N.V. Zaytseva1, M.A. Zemlyanova1, 2, V.N. Zvezdini, A.A. Dovbyshi, I.V. Gmoshinsky3, S.A. Khotimchenko3, T.I. Akafieva4
Целью исследования стала оценка безопасных доз промышленно выпускаемого наноразмерного коллоидного серебра (НКС), стабилизированного поливинилпирролидоном (ПВП, пищевая добавка Е1201), при введении в желудочно-кишечный тракт крыс в 92-дневном эксперименте по показателям морфологических изменений в органах животных. Исследуемый образец НКС содержал неагрегированные наночастицы (НЧ) серебра, принадлежащие к размерным фракциям с диаметром менее 5, 10-20 и 50-80 нм. 80% НЧ находилось в интервале гидродинамических диаметров 10,6-61,8 нм. Препарат НКС вводили растущим крысам-самцам линии Вистар с исходной массой тела 80±10 г в течение 1 мес внутрижелудочно через зонд и далее с потребляемым кормом в дозах 0,1, 1,0 и 10 мг на 1 кг массы тела в расчете на серебро. Животные контрольных групп получали воду или носитель наноматериала - водный раствор ПВП. После выведения животных из эксперимента путем обескровливания под эфирной анестезией отбирали органы (печень, селезенку, почки, подвздошную кишку) и готовили их микропрепараты по стандартным методикам; окраску осуществляли гематоксилином
и эозином. Анализ микропрепаратов выполняли в светооптическом микроскопе, снабженном цифровой фотокамерой, при увеличении от 1x100 до 1x1000. Показано, что у животных опытных групп, получавших НКС, отмечается серия морфологических изменений тканей внутренних органов (печени, селезенки и почек) с нарастанием спектра и степени выраженности структурных изменений по мере увеличения дозы серебра. Органом, наиболее чувствительным к воздействию НКС, является, по-видимому, печень животных, в которой уже при дозе НЧ серебра 0,1 мг на 1 кг массы тела отмечается эозинофильная инфильтрация портальных трактов, которая при дальнейшем увеличении дозы до 1,0 и 10,0 мг на 1 кг массы тела начинает сопровождаться появлением средних и крупнокапельных жировых вакуолей в цитоплазме гепатоцитов, отеком и лимфомакрофагальной инфильтрацией портальных трактов. Выявляемые изменения могут рассматриваться как признаки развития воспаления гепатоцитов, во всяком случае при дозе наноматериала 1,0 мг на 1 кг массы тела и более. Сравнительная выраженность морфологических изменений во внутренних органах коррелирует с известными из литературы данными о биораспределении НЧ серебра, вводимых в желудочно-кишечный тракт. Сделан вывод, что пороговая доза, отвечающая минимальному токсическому действию НКС, по данным изучения вышеуказанных органов, не превышает 1,0 мг на 1 кг массы тела в расчете на серебро.
Ключевые слова: серебро, наночастицы, токсичность, крысы, морфология, печень, селезенка, почки
The aim of the study was to evaluate the safe doses of commercially available nanosized colloidal silver (NCS), stabilized with polyvinilpirrolidone (PVP, food additive E1201) when administered in gastrointestinal tract of rats in the 92-day experiment in terms of the morphological changes in the internals of animals. The sample studied contained non-aggregated nanoparticles (NPs) of silver belonging to size fractions with a diameter of less than 5 nm, 10-20 nm or 50-80 nm. 80% of NPs were inside the range of hydrodynamic diameters 10.6-61.8 nm. The preparation of NCS was administered to growing male Wistar rats (initial body weight 80±10 g) for 1 month by intragastric gavage and then consumed with food at doses of 0.1, 1.0 and 10 mg/kg of body weight based on silver. The control animals received water or vehicle of nanomaterial - water solution of PVP. After withdrawal of animals from the experiment by exsanguination under ether anesthesia organs (liver, spleen, kidney, ileum) were isolated and their slides were prepared by standard methods following by staining with hematoxylin-eosin. Analysis was performed in light optical microscope equipped with a digital camera at a magnification from 1x100 to 1x1000. It was shown that the experimental animals treated with the NCS developed series of morphological changes in the tissues of the internal organs (liver, spleen and kidney) with the elevation of the range and severity of structural changes with increasing doses of silver. The most sensitive target of NCS action was apparently liver, which has already shown at a dose of 0.1 mg of silver NP/kg of body weight marked eosinophilic infiltration of portal tracts, which was accompanied at doses of 1.0 and 10.0 mg/kg by the emergence of medium and large-drop fat vacuoles in the cytoplasm of hepatocytes, swelling and lympho-macrophage infiltration of the portal tracts. Detectable changes can be regarded as symptoms of inflammation of hepatocytes, at least, at a dose nanomaterial of 1.0 mg/kg body weight or more. Relative intensity of morphological changes in the internal organs correlated with published data on the biodistribution of silver NP administered to the gastrointestinal tract. It is concluded that the threshold dose corresponding to the minimum adverse effect of NCS is, according to the study of the above, no more than 1.0 mg/kg of body weight based on silver. Keywords: silver, nanoparticles, toxicity, rats, morphology, liver, spleen, kidney
В настоящее время значительно возрастает нагрузка на население наночастицами (НЧ) серебра, содержащимися в большом числе видов потребительской продукции (медицинские препараты, перевязочные материалы, дезинфицирующие средства, лакокрасочная продукция, текстиль, фильтры для воды, упаковочные материалы, косметическая продукция, биологически активные добавки к пище) [1-3]. Годовой объем производства в мире материалов, содержащих этот вид НЧ, в 2011 г. превысил 500 т в пересчете на серебро [4]. В результате утилизации изделий и материалов, содержащих НЧ серебра, они могут поступать в объекты окружающей среды [4, 5]. Ввиду этого оценка рисков, связанных с перо-ральным поступлением НЧ серебра в организм,
48
является актуальной и представляет собой одну из важных задач гигиены и профилактической медицины.
В ряде исследований сообщается о токсическом действии НЧ серебра при пероральном введении. Так, анализ морфологических изменений ткани печени и желчных протоков мышей после экспозиции НЧ серебра в течение 28 дней в дозе 125 мг на 1 кг массы тела и выше выявил вакуолизацию, очаговый некроз печени, гиперплазию желчных протоков, а также повышенную инфильтрацию клеток, воспаление и расширение центральных вен [6]. При внутрижелудочном введении мышам НЧ серебра в дозе 1 мг на 1 кг массы тела в течение 14 дней отмечали увеличение экспрессии ^-1, ^-6, ^-4, ^-10, ^-12 и TGF-p, признаки
гистопатологического действия на почки [7]. В результате 28-дневного введения НЧ серебра самцам крыс в возрасте около 1 мес в начале эксперимента у животных отмечались снижение уровня глюкозы натощак, повышение макромо-лекулярной проницаемости кишки, ингибирова-ние развития симбиотической кишечной микрофлоры [8]. В то же время авторы исследования [9] не выявили достоверных признаков пероральной токсичности НЧ серебра (включая репродуктивную токсичность) для самцов и самок крыс в дозах до 250 мг на 1 кг массы тела при длительности введения до 52 дней. Таким образом, имеющиеся оценки пероральных токсических доз НЧ противоречивы, что может быть обусловлено различиями в свойствах применяемых НЧ.
Среди выпускаемых в настоящее время материалов, содержащих НЧ серебра, наибольший практический интерес представляет наноразмерное коллоидное серебро (НКС), стабилизированное поливинилпирролидоном (ПВП). Преимуществами этого стабилизатора являются его высокая эффективность в сочетании с низкой токсичностью для человека (ПВП является разрешенной пищевой добавкой Е1201, а также используется в составе инфузионных растворов - кровезаменителей). Цель цикла исследований, проводимых совместно ФБУН «ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» и ФГБНУ «НИИ питания», - оценка безопасных доз НКС, стабилизированного ПВП, при введении в желудочно-кишечный тракт крыс в 92-дневном эксперименте с использованием методических указаний по оценке безопасности наноматериалов [10]. Предметом исследования в данной статье являются морфологические (гисто-патологические) изменения в органах животных.
Материал и методы
Исследованный раствор НКС («кластерного серебра») «Арговит-С» по ТУ 9310-03-79044259-12 был предоставлен ООО НПЦ «Вектор-Вита» (Новосибирск1, РФ). Препарат НКС представлял собой водный раствор коричневого цвета (в проходящем свете) с зеленовато-серым оттенком (в отраженном свете) и небольшой опалес-ценцией. Длина волны максимума поглощения в видимой области составляла ^=403,2 нм. Согласно данным анализа методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (МР 1.2.2641-10), общее содержание серебра в неразбавленном растворе НКС составляло 10,09±0,04 мг/см3.
Стабилизатор ПВП в продукте содержался в количестве 19% (по массе). Исследование методом трансмиссионной электронной микроскопии2 (микроскоп «JEOL JEM-100CX»; «JEOL», Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ показало, что в составе изучаемого образца НКС выявляются НЧ высокой электронной плотности, с четкими контурами, преимущественно округлой, эллипсоидной формы и отдельные частицы треугольной формы, принадлежащие к размерным фракциям с диаметром <5, 10-20 и 50-80 нм. В качестве НЧ серебра эти частицы идентифицировали методом дифракции электронов с выбранной области (МР 1.2.2641-10). По данным исследования методом динамического лазерного светорассеяния на приборе «Nanotrack Wave» («Microtrac Inc.», США), 80% НЧ серебра находилось в интервале гидродинамических диаметров 10,6-61,8 нм.
Работа с животными выполнена в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (ILAR, DELS) и Правилами лабораторной практики [11, 12]. Эксперимент выполнен на 5 группах животных - по 15 крыс-самцов линии Вистар исходной массой тела 80±10 г, в возрасте около 30 дней, полученных из питомника «Столбовая». На протяжении всего эксперимента животные получали сбалансированный полусинтетический рацион согласно МУ 1.2.2520-09. Крыс размещали в клетках по 3 особи, рацион и воду предоставляли в режиме свободного неограниченного доступа. На протяжении первого месяца эксперимента животные 1-й (контрольной) группы получали внутрижелу-дочно через зонд деионизованную воду, 2-й группы -носитель ПВП («Пласдон К-29/32», «Ashland», США) в виде 2% водного раствора в дозе 200 мг на 1 кг массы тела, 3-5-й групп - раствор НКС в дозах соответственно 0,1, 1,0 и 10,0 мг на 1 кг массы тела в сутки в пересчете на серебро. Животным 3-й и 4-й групп дополнительно вводили ПВП в количестве, соответствующем его поступлению с препаратом НКС в 5-й группе. Начиная со второго месяца эксперимента, соответствующие количества НКС и ПВП добавляли к корму животных; потребляемые дозы рассчитывали, определяя фактическую поеда-емость рационов. В ходе эксперимента крыс ежедневно взвешивали на электронных весах с точностью ±1 г, фиксировали заболеваемость, летальность, внешний вид, активность, состояние шерстяного покрова, стула, особенности поведения.
Выведение животных из эксперимента осуществляли на 93-е сутки путем обескровливания из нижней полой вены под эфирной анестезией. Вскрытие животных, отбор органов (печень, почки, селезенку, подвздошную кишку) для морфологи-
1 Авторы благодарят кандидата химических наук В.А. Бурмистрова за предоставленный для исследования образец коллоидного серебра.
2 Исследование проведено кандидатом биологических наук С.М. Придворовой (ФГБУН «Институт биохимии им. А.Н. Баха»).
49
#
ческих исследований осуществляли в соответствии с МУ 1.2.2745-10. Немедленно после отбора органов материал фиксировали в 10% нейтральном (забуференном 0,1 М фосфатом натрия, рН 7,00±0,05) растворе формалина (квалификации «Analytical grade», «Sigma-Aldrich», Германия) в соотношении 1:50 (образец:фиксатор) по массе.
Подготовка гистологических препаратов включала дегидратацию фрагментов органов в спиртах восходящей концентрации, пропитку хлороформом и парафином в автоматическом гистологическом процессоре «Excelsior ES» («Thermo Scientific», Германия). Далее фрагменты заливали гомогенизированной парафиновой средой «Histomix» [13] на станции заливки блоков «Histo Star» («Thermo Scientific», Германия). Парафиновые срезы толщиной 3-4 мкм изготавливали на санном микротоме «JUNG SM 2000R» («Leica», Германия) и окрашивали их по общепринятой методике [14] гематоксилином и эозином в роботе-окрашивателе «Varistain Gemini ES» («Thermo Scientific», Германия). Полученные микропрепараты исследовали на светооптическом микроскопе «MEIJI» («Techno», Япония), снабженном камерой «Microscopy VISION» («VISION», Канада) при увеличении х50, х100, х200, х400, х800, х1000. Микрофотографии выполняли с помощью камеры «Microscopy VISION» («VISION», Канада). В каждой из групп животных изучено не менее 8 микропрепаратов каждого органа. Всего проанализировано 550 микропрепаратов исследованных органов.
Результаты
Контрольная группа животных (1-я группа)
При оценке морфологии внутренних органов крыс 1-й (контрольной) группы структура ткани печени и почек соответствовала ортодоксальной картине для животных данного пола и возраста; видимых патологических изменений не установлено. В структуре лимфоидной ткани селезенки выявлены увеличение объема белой пульпы до 35-40% от общего объема ткани (норма - 20-25%), образование реактивных фолликулов. В подвздошной кишке установлена гиперплазия лимфоидной ткани, ассоциированная со слизистой оболочкой тонкой кишки. Указанные эффекты могут рассматриваться как не выходящие за пределы нормальных возрастных изменений для животных 4-месячного возраста.
Животные, получавшие носитель/стабилизатор наноматериала - поливинилпирролидон (2-я группа)
При изучении структуры тканей внутренних органов крыс 2-й группы, получавших ПВП в дозе 200 мг на 1 кг массы тела в сутки в течение
92 дней, видимых морфологических изменений печени, селезенки, почек и подвздошной кишки относительно структуры органов от животных 1-й контрольной группы не установлено. Репрезентативные микрофотографии препаратов органов животных 2-й группы в сравнении с 1-й группой представлены на рис. 1а, 2а, 3а, 4а (см. цветную вклейку).
Животные, получавшие наноразмерное коллоидное серебро в дозе 0,1 мг на 1 кг массы тела в расчете на серебро (3-я группа)
Печень. Капсула органа имеет тонкую волокнистую структуру с очаговым набуханием мезотелия. Балочное строение печени сохранено (рис. 1б, см. цветную вклейку). Цитоплазма гепатоцитов зернистая, содержит большое количество мелких прозрачных вакуолей с четкими контурами (рис. 1в, см. цветную вклейку). Морфология стенок и эндотелия центральных и портальных вен, артерий, синусов, структура и органное распределение клеток Купфера в основном соответствуют ортодоксальной картине. Портальные тракты содержат умеренно выраженную инфильтрацию из эозинофилов, макрофагов, лимфоцитов (рис. 1б, см. цветную вклейку).
Селезенка. Капсула органа толстая, волокнистая, покрытая набухшим мезотелием. Структура трабе-кул, объем и строение белой пульпы, лимфатических фолликулов, периартериальных лимфатических влагалищ в основном соответствуют ортодоксальной картине, характерной для животных 1-й и 2-й групп. При этом в маргинальных зонах белой пульпы и в красной пульпе отмечены множественные скопления эозинофилов, одиночные многоядерные гигантские клетки (рис. 2б, см. цветную вклейку).
Почки. Капсула тонкая, волокнистая, содержит единичные гладкомышечные клетки, клетки мезотелия уплощены. Дифференцировка на кору и мозговой слой сохранена. Структура клубочков ортодоксальна, признаков пролиферации мезан-гиальных, эндотелиальных клеток и клеток наружного листка капсулы не выявлено. Проксимальные прямые и извитые канальцы с четкими контурами выстланы однослойным эпителием с неравномерно зернистой оксифильной цитоплазмой, неровным размытым апикальным краем, базально расположенным ядром. Собирательные трубочки узкие, выстланы светлым призматическим эпителием. Вены тонкостенные, полнокровны. Ветви почечной артерии характеризуются набухшим эндотелием, вакуолизацией миоцитов. По сравнению с животными 1-й и 2-й групп в структуре ткани почек крыс 3-й группы установлены морфологические изменения в виде острого венозного полнокровия, вакуолизации миоцитов и набухания эндотелия артерий (рис. 3б, см. цветную вклейку).
Подвздошная кишка. Все слои стенки кишки хорошо дифференцируются. Структура ворсинок
50
и крипт эпителия, собственной пластинки, мышечного слоя является ортодоксальной и не отличается в 3-й группе животных от структуры подобных органов животных 1-й и 2-й групп. Структура лимфоидной ткани кишки соответствует норме и не отличается от картины, характерной для органов животных 1-й и 2-й групп. Таким образом, каких-либо морфологических изменений в стенке подвздошной кишки при дозе НКС 0,1 мг на 1 кг массы тела не выявлено (рис. 4б, см. цветную вклейку).
Животные, получавшие наноразмерное коллоидное серебро в дозе 1,0 мг на 1 кг массы тела в расчете на серебро (4-я группа)
Печень. Капсула органа тонкая, волокнистая, покрыта уплощенными клетками мезотелия. Балочное строение сохранено. Гепатоциты многоугольной формы, одно или двуядерные с четко видимыми ядрышками (рис. 1г, см. цветную вклейку). Цитоплазма гепатоцитов грубозернистая, содержит большое количество прозрачных мелких и средних жировых вакуолей с четкими контурами, в единичных гепатоцитах вакуоли крупные (рис. 1д, см. цветную вклейку). Просветы центральных вен и прилежащие к ним синусоиды несколько расширены. Портальные тракты в большинстве полей зрения с размытыми контурами за счет отека и клеточной инфильтрации из лимфоцитов, макрофагов и большого количества эозинофилов, портальные вены запустевшие, с тонкими стенками. Жёлчные капилляры мелкие с низким кубическим эпителием. Клетки Купфера неправильной формы, крупные, преобладают по периферии долек. Таким образом, в структуре ткани печени крыс 4-й группы выявляются морфологические изменения относительно структуры органов животных 1-й и 2-й групп в виде выраженной эозинофилии инфильтрата портальных трактов, мелких и средних жировых вакуолей в цитоплазме гепатоцитов.
Селезенка. Капсула толстая волокнистая, покрыта уплощенным мезотелием. Трабекулы толстые, волокнистые, содержат полнокровные сосуды, инфильтрированы макрофагами, лимфоцитами, плазматическими клетками. Белая пульпа составляет до 40% от объема органа, образована средними и крупными фолликулами, широкими клеточными периартериальными лимфатическими влагалищами, клеточными размытыми маргинальными зонами, в части полей зрения сливающимися между собой. В части фолликулов видны широкие светлые реактивные центры, образованные центроцитами, центробластами, иммуноблас-тами, макрофагами. Маргинальные синусы узкие, содержат эритроциты, лимфоциты. Красная пульпа представлена венозными синусами и пульпар-ными тяжами. Венозные синусы с тонкими стен-
ками, очаговым набуханием эндотелия содержат эритроциты, лимфоциты, лейкоциты. Селезеночные (пульпарные) тяжи имеют клеточное строение. В разных отделах красной пульпы и маргинальных зонах визуализируются скопления эозино-филов, одиночные многоядерные клетки (рис. 2в, см. цветную вклейку). Таким образом, морфологические изменения в селезенке крыс 4-й группы в сравнении с органами животных 1-й и 2-й групп включают выраженную эозинофилию маргинальных зон и красной пульпы.
Почки. Капсула тонкая, волокнистая, покрыта уплощенным мезотелием. Вены с тонкими стенками, полнокровны. Крупные ветви почечной артерии с толстыми мышечными стенками, набухшим эндотелием, очаговой вакуолизацией миоци-тов. Клубочки разных размеров, их капиллярные петли умеренного кровенаполнения, мочевые пространства широкие. В части клубочков слабая пролиферация мезангиальных клеток (до 6 в дольке) с незначительным увеличением объема мезанги-ального матрикса (рис. 3в, г, см. цветную вклейку). Проксимальные прямые и извитые канальцы с четкими контурами, выстланы однослойным мелкозернистым оксифильным эпителием с неровным апикальным краем, округлыми базально расположенными ядрами. Дистальные канальцы тонкие, выстланы однослойным низким кубическим эпителием со светлой цитоплазмой и округлыми ядрами. Собирательные трубочки тонкие, выстланы призматическим светлым эпителием. Таким образом, выявленные в почках животных 4-й группы морфологические изменения относительно структур органов животных 1-й и 2-й групп состоят преимущественно в очаговой, слабо выраженной пролиферации мезангиальных клеток.
Подвздошная кишка. В структуре ткани подвздошной кишки крыс 4-й группы, как и в случае животных 3-й группы, морфологических изменений относительно показателей контрольной группы не установлено (рис. 4в, см. цветную вклейку).
Животные, получавшие наноразмерное коллоидное серебро в дозе 10 мг на 1 кг массы тела в расчете на серебро (5-я группа)
Печень. Капсула органа тонкая, волокнистая, покрыта уплощенным мезотелием. Структуры долек прослеживаются хорошо, балочное строение сохранено. Центральные и портальные вены с тонкими стенками, очаговым набуханием эндотелия. Вокруг единичных центральных артерий в синусоидах определяются скопления лимфоцитов, макрофагов, единичные эозинофилы (рис. 1е, см. цветную вклейу). Крупные ветви артерий с толстыми мышечными стенками, очаговым набу-
51
#
ханием эндотелия. Синусоиды уменьшены в объеме. Гепатоциты многоугольной формы, находятся в состоянии распространенной мелкокапельной жировой дистрофии, в части полей зрения видны единичные вакуоли среднего размера (рис. 1ж, см. цветную вклейку). В портальных трактах отмечаются очаговый отек, слабая и умеренная лимфомакрофагальная инфильтрация с примесью единичных эозинофилов. Желчные протоки с толстыми отечными стенками, выстланы низким кубическим эпителием. Клетки Купфера крупные, неправильной формы, преобладают на периферии долек. Таким образом, у животных 5-й группы наблюдаются выраженные изменения в структуре печени в виде распространенной мелкокапельной жировой дистрофии, единичных жировых вакуолей среднего и крупного размера в цитоплазме гепатоцитов, отека и лимфомакрофагальной инфильтрации портальных трактов с примесью эозинофилов.
Селезенка. Капсула органа толстая, волокнистая, содержит единичные гладкомышечные клетки, покрыта мезотелием с очаговым набуханием клеток, инфильтрирована единичными лимфоцитами. Трабекулы толстые волокнистые, инфильтрированы лимфоцитами, макрофагами, плазматическими клетками, единичными эозинофилами (рис. 2г, см. цветную вклейку). Белая пульпа составляет до 45% объема органа, образована средними и крупными фолликулами и широкими клеточными периартериальными лимфатическими влагалищами с широкими клеточными размытыми маргинальными зонами, в части полей зрения сливающимися между собой. Центральные артерии фолликулов с толстыми стенками, набухшим эндотелием, вакуолизацией миоцитов. Маргинальные синусы узкие или не дифференцируются. Венозные синусы красной пульпы с тонкими стенками, заполнены клеточными элементами. В маргинальных зонах и в пульпарных тяжах небольшие скопления эозинофилов. В разных отделах пульпы встречаются единичные многоядерные клетки. Таким образом, в селезенке животных 5-й группы выявлены выраженные изменения по сравнению с крысами 1-й и 2-й групп, состоящие в увеличении объема белой пульпы, эозинофилии маргинальных зони красной пульпы.
Почки. Капсула органа тонкая волокнистая, покрыта уплощенным мезотелием. Вены с тонкими стенками, полнокровны. Крупные ветви почечной артерии с толстыми мышечными стенками, набухшим эндотелием, очаговой вакуолизацией миоцитов (рис. 3д, см. цветную вклейку). Клубочки разных размеров, их капиллярные петли умеренного кровенаполнения, мочевые пространства широкие. В части клубочков определяется слабая пролиферация мезангиальных клеток (до 6 в дольке) с незначительным увеличением объ-
ема мезангиального матрикса. Признаков пролиферации эндотелиоцитов и клеток наружного листка капсулы нет. Проксимальные прямые и извитые канальцы с четкими контурами, выстланы однослойным мелкозернистым окси-фильным эпителием с неровным апикальным краем, округлыми базально расположенными ядрами. Дистальные канальцы тонкие, выстланы однослойным низким кубическим эпителием со светлой цитоплазмой и округлыми ядрами. Собирательные трубочки тонкие, выстланы призматическим светлым эпителием. Таким образом, в структуре ткани почек крыс 5-й группы установлены морфологические изменения относительно структур органов животных 1-й и 2-й групп в виде очаговой слабо выраженной пролиферации мезангиальных клеток и набухания эндотелия артерий.
Подвздошная кишка. Морфология всех слоев стенки подвздошной кишки крыс 5-й группы не изменена сколько-нибудь значимым образом по сравнению с аналогичными данными животных 1-й и 2-й групп (рис. 4г, см. цветную вклейку).
Обсуждение
Результаты проведенных в данной работе исследований показали, что при введении НКС в желудочно-кишечный тракт крыс на протяжении 92 сут в дозе 0,1, 1,0 и 10,0 мг на 1 кг массы тела в сутки (в расчете на серебро) отмечается серия морфологических изменений тканей внутренних органов (печени, селезенки и почек) с нарастанием спектра и степени выраженности структурных изменений по мере увеличения дозы. Органом, наиболее чувствительным к воздействию НКС, является, по-видимому, печень животных, в которой уже при дозе серебра в составе его НЧ 0,1 мг на 1 кг массы тела отмечается эозино-фильная инфильтрация портальных трактов, что при дальнейшем увеличении дозы НКС до 1,0 и 10,0 мг на 1 кг начинает сопровождаться появлением средних и крупнокапельных жировых вакуолей в цитоплазме гепатоцитов, отеком и лим-фомакрофагальной инфильтрацией портальных трактов. Выявляемые изменения могут рассматриваться как признаки развития воспаления гепато-цитов, во всяком случае, при дозе наноматериала 1,0 мг на 1 кг массы тела и более. В селезенке животных опытных групп, начиная с дозы НКС 1,0 мг на 1 кг массы тела, отчетливо выявляются изменения в виде эозинофилии маргинальных зон и красной пульпы. В почках морфологические изменения при дозе НКС 1,0 мг на 1 кг массы тела и более имеют менее выраженный характер и проявляются в виде острого венозного полнокровия, вакуолизации миоцитов, слабо выраженной
52
пролиферации мезангиальных клеток и набухания эндотелия артерий. Наименее чувствительным к воздействию НКС органом является, по-видимому, тонкая (подвздошная) кишка, в которой морфологических изменений во всем интервале исследованных доз НКС не выявлено.
Сравнительная выраженность морфологических изменений во внутренних органах опытных групп животных коррелирует с известными из литературы данными о биораспределении НЧ серебра, вводимых в желудочно-кишечный тракт крыс. Так, показано, что внутренним органом, накапливающим наибольшее количество этих НЧ, является печень, далее следует селезенка, тогда как в почках накопление НЧ серебра оказывается менее значительным [6, 15, 16]. В работах [16, 17] показана способность НЧ серебра к проникновению через кишечную стенку, поступлению в системную циркуляцию, накоплению и персистенции в составе ряда внутренних органов. При этом на первой стадии указанных процессов, по-видимому, не происходит растворение НЧ серебра в значимых количествах; напротив, в случае введения в желудочно-кишечный тракт растворимых (солевых) форм этого металла отмечается обратный процесс - формирование его металлических НЧ в ряде внутренних органов [16]. Согласно имеющимся данным [18], возможен захват клетками различного типа НЧ серебра, после чего под действием окислителей различной природы (в том числе эндогенных) происходит постепенное высвобождение из них серебра в ионной форме, которое, как известно, обладает способностью необратимо ингибировать большое число ферментов и мембранных транспортных систем, связываясь с тиоловыми группами активных белков [19]. Обобщение большого числа данных исследований в клеточных культурах in vitro показало, что эти эффекты проявляются при содержании НЧ серебра в среде инкубации 3 мкг/см3 и выше. При этом, как показывают данные компьютерного моделирования биокинетики НЧ серебра, такая их концентрация в ткани печени и селезенки может
развиться при внутрижелудочном введении в зависимости от его длительности, при дозе порядка 5-10 мг на 1 кг массы тела [20]. С этими оценками согласуются полученные данные в настоящей работе о том, что морфологические изменения в печени и селезенке (и, отчасти, в почках) животных в интервале доз 1-10 мг на 1 кг массы тела являются выраженными и свидетельствуют о развитии токсического действия, тогда как при дозе 0,1 мг на 1 кг массы тела они имеют маргинальный характер. Показательно, что тонкая кишка, как первый барьер на пути НЧ серебра из просвета желудочно-кишечного тракта в организм сама по себе, по-видимому, не является мишенью их токсического действия. Это согласуется с результатами исследований, при которых не выявлено значительных ультраструктурных изменений в энтероцитах крыс, по данным электронной микроскопии (в отличие от селезенки и печени), при остром внутрикишечном введении высоких доз НКС [17], а также с отсутствием влияния НКС на проницаемость кишечного барьера крыс возрастом 4 мес для белковых макромолекул, что было показано в нашей предыдущей работе [21]. Данное наблюдение косвенно подтверждает положение о том, что всасывание НКС в кишке происходит преимущественно в форме дискретных НЧ, которые, по-видимому, сами обладают относительно низкой токсичностью [22]. Основным местом проявления их токсического действия при этом являются паренхиматозные внутренние органы, в клетках которых возможно, по некоторым данным, высвобождение высоких локальных концентраций ионов серебра под действием ок-сидантов, способностью эндогенной продукции которых обладают нейтрофильные лейкоциты, макрофаги и клетки Купфера [23, 24].
В совокупности морфологических данных, полученных у крыс, потреблявших на протяжении 3 мес НКС, можно заключить, что пороговая доза данного наноматериала составляет, по данным изучения вышеуказанных органов, не более 1,0 мг на 1 кг массы тела.
Сведения об авторах
Зайцева Нина Владимировна - академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, директор ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» Роспотребнадзора (Пермь) E-mail: znv@fcrisk.ru
Землянова Марина Александровна - доктор медицинских наук, заведующая отделом биохимических и цитогенетических методов диагностики ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» Роспотребнадзора, профессор кафедры экологии человека и безопасности жизнедеятельности ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» E-mail: zem@fcrisk.ru
Звездин Василий Николаевич - кандидат медицинских наук, заведующий лабораторией биохимической и наносенсорной диагностики ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» Роспотребнадзора (Пермь) E-mail: zvezdin@fcrisk.ru
Довбыш Анастасия Александровна - токсиколог лаборатории метаболизма и фармакокинетики ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» Роспотребнадзора (Пермь) E-mail: dovnastja@yandex.ru
Гмошинский Иван Всеволодович - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБНУ «НИИ питания» (Москва) E-mail gmosh@ion.ru
Хотимченко Сергей Анатольевич - доктор медицинских наук, заведующий лабораторией пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий, врио заместителя директора ФГБНУ «НИИ питания» (Москва) E-mail hotimchenko@ion.ru
Акафьева Татьяна Игоревна - магистр кафедры экологии человека и безопасности жизнедеятельности ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» E-mail: akafieva@fcrisk.ru
Литература
#
10.
11.
12.
Blaser S.A., Scheringer M., MacLeod M., Hungerbuhler K. Estimation 13. of cumulative aquatic exposure and risk due to silver: contribution of nano-functionalized plastics and textiles// Sci. Total Environ. 14. 2008. Vol. 390, N 2-3. P. 396-409.
Marambio-Jones C., Hoek E.M.V. A review of the antibacterial effects 15. of silver nanomaterials and potential implications for human health and the environment // J. Nanopart. Res. 2010. Vol. 12, N 5. P. 1531-1551. Savage N., Diallo M.S. Nanomaterials and water purification: opportunities and challenges // J. Nanopart. Res. 2005. Vol. 7, N 4-5. P. 331-342. 16.
Fabrega J., Luoma S.N., Tyler C.R., Galloway T.S. et al. Silver nanoparticles: behaviour and effects in the aquatic environment // Environ. Int. 2011. Vol. 37, N 2. P. 517-531.
Vejerano E.P, Leon E.C., Holder A.L., Marr L.C. Characterization 17. of particle emissions and fate of nanomaterials during incineration // Environ. Sci. Nano. 2014. Vol. 1, N 2. P. 133-143. Kim Y.S., Kim J.S., Cho H.S., Rha D.S. et al. Twenty-eight-day oral toxicity, genotoxicity, and gender-related tissue distribution of silver nanoparticles in Sprague-Dawley rats // Inhal. Toxicol. 2008. Vol. 20, 18. N 6. P. 575-583.
Park E.J., Bae E., Yi J., Kim Y. et al. Repeated-dose toxicity and inflammatory responses in mice by oral administration of silver nanoparticles // Environ. Toxicol. Pharmacol. 2010. Vol. 30, N 2. 19. P. 162-168.
Шумакова А.А., Смирнова В.В., Тананова О.Н., Трушина Э.Н. и др. Токсиколого-гигиеническая характеристика наночастиц 20. серебра, вводимых в желудочно-кишечный тракт крыс // Вопр. питания. 2011. Т. 80. № 6. С. 9-18.
Hong J.S., Kim S., Lee S.H., Jo E. et al. Combined repeated-dose toxicity study of silver nanoparticles with the reproduction/devel- 21. opmental toxicity screening test // Nanotoxicology. 2014. Vol. 8, N 4. P. 349-362.
Онищенко Г.Г., Тутельян В.А., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Развитие системы оценки безопасности и контроля наноматериалов и нанотехнологий в Российской Федерации // Гиг. и сан. 2013. № 1. С. 4-11. 22.
Приказ Минздравсоцразвития России № 708Н от 23.08.2010. Об утверждении правил лабораторной практики [Электронный ресурс]. URL: http: //www.zakonprost.ru/content/base/ 165273]. 23. Guide for the care and use of laboratory animals. 8th ed. / Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Research (ILAR); Division on Earth and 24. Life Studies (DELS); National Research Council of the national academies. Washington : The National Academies Press, 2011.
Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники. Л. : Медицина, Ленинградское отделение, 1969. 424 с. Микроскопическая техника : руководство / под ред. Д.С. Сар-кисова, Ю.Л. Петрова. М. : Медицина, 1996. 544 с. Бузулуков Ю.П., Гмошинский И.В., Распопов Р.В., Демин В.Ф.и др. Изучение абсорбции и биораспределения наночастиц некоторых неорганических веществ, вводимых в желудочно-кишечный тракт крыс, с использованием метода радиоактивных индикаторов // Мед. радиол. и радиац. безопасность. 2012. Т. 57, № 3. С. 5-12. Van der Zande M., Vandebriel R.J., Doren E.V., Kramer E. et al. Distribution, elimination, and toxicity of silver nanoparticles and silver ions in rats after 28-day oral exposure // ACS Nano. 2012. Vol. 6, N 8. P. 742 7-744 2.
Платонова Т.А., Придворова С.М., Жердев А.В., Василевская Л.С. и др. Идентификация наночастиц серебра в тканях слизистой оболочки тонкой кишки, печени и селезенки крыс методом просвечивающей электронной микроскопии // Бюл. экспер. биол. 2013. Т. 155, № 2. С. 204-209.
Stensberg M.C., Wei Q., McLamore E.S., Porterfield D.M. et al. Toxi-cological studies on silver nanoparticles: challenges and opportunities in assessment, monitoring and imaging // Nanomedicine (Lond.). 2011. Vol. 6, N 5. P. 879-898.
Lapresta-Fernandez A., Fernandez A., Blasco J. Nanoecotoxicity effects of engineered silver and gold nanoparticles in aquatic organisms // Trends Anal. Chem. 2012. Vol. 32, N 2. P. 40-59. Demin V.A., Gmoshinsky I.V., Demin V.F., Anciferova A.A. et al. Modeling interorgan distribution and bioaccumulation of engineered nanoparticles (using the example of silver nanoparticles) // Nano-technologies in Russia. 2015. Vol. 10, N 3-4. P. 288-296. Шумакова А.А., Шипелин В.А., Сидорова Ю.С., Трушина Э.Н. и др. Токсикологическая оценка наноразмерного коллоидного серебра, стабилизированного поливинилпирролидоном, в 92-дневном эксперименте на крысах. I. Характеристика наноматериала, интегральные, гематологические показатели, уровень тиоловых соединений и апоптоз клеток печени // Вопр. питания. 2015. Т. 84, № 6. С. 46-57. Xiu Z.M., Zhang Q.B., Puppala H.L., Colvin V.L. et al. Negligible particle-specific antibacterial activity of silver nanoparticles // Nano Lett. 2012. Vol. 12, N 8. P. 4271-4275.
Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге / под ред. В.П. Казначеева. Новосибирск : Наука. Сибир. отд-ние, 1983. 256 с.
Takahashi R., Edashige K., Sato E.F., Inoue M. et al. Luminol che-miluminescence and active oxygen generation by activated neutro-phils // Arch. Biochem. Biophys. 1991. Vol. 285, N 2. P. 325.
54
1.
2
3.
6
7.
8
9
References
10.
12.
Blaser S.A., Scheringer M., MacLeod M., Hungerbuhler K. Estimation 13. of cumulative aquatic exposure and risk due to silver: contribution of nano-functionalized plastics and textiles. Sci Total Environ. 2008; 14. Vol. 390 (2-3): 396-409.
Marambio-Jones C., Hoek E.M.V. A review of the antibacterial 15. effects of silver nanomaterials and potential implications for human health and the environment. J Nanopart Res. 2010; Vol. 12 (5): 1531-51.
Savage N., Diallo M.S. Nanomaterials and water purification: opportunities and challenges. J Nanopart Res. 2005; Vol. 7 (4-5): 331-42. 16.
Fabrega J., Luoma S.N., Tyler C.R., Galloway T.S., et al. Silver nanoparticles: behaviour and effects in the aquatic environment. Environ Int. 2011; Vol. 37 (2): 517-31.
Vejerano E.P, Leon E.C., Holder A.L., Marr L.C. Characterization 17. of particle emissions and fate of nanomaterials during incineration. Environ Sci Nano. 2014; Vol. 1 (2): 133-43. Kim Y.S., Kim J.S., Cho H.S., Rha D.S., et al. Twenty-eight-day oral toxicity, genotoxicity, and gender-related tissue distribution of silver nanoparticles in Sprague-Dawley rats. Inhal Toxicol. 2008; Vol. 20 18. (6): 575-83.
Park E.J., Bae E., Yi J., Kim Y. et al. Repeated-dose toxicity and inflammatory responses in mice by oral administration of silver nanoparticles. Environ Toxicol Pharmacol. 2010; Vol. 30 (2): 162-8. 19. Shumakova A.A., Smirnova V.V., Tananova O.N., Trushina E.N. et al. Toxicological sanitary characterization of silver nanoparticles introduced in gastrointestinal tract of rats. Voprosy pitaniia [Problems of 20. Nutrition]. 2011. Vol. 80, N 6. P. 9-18. (in Russian) Hong J.S., Kim S., Lee S.H., Jo E. et al. Combined repeated-dose toxicity study of silver nanoparticles with the reproduction/developmental toxicity screening test. Nanotoxicology. 2014; Vol. 8 (4): 21. 349-62.
Onishchenko G.G., Tutelyan V.A., Gmoshinsky I.V., Khotimchenko S.A. Development of nanomaterials and nanotechnology safety an control system in Russian Federation. Hygiena i sanitariya [Hygiene and Sanitation]. 2013; Vol. 1: 4-11. (in Russian)
Order of the Health Ministry of Russia from 23.08.2010 N 708N. On 22. approval of rules of laboratory practice [electronic resource]. URL: http: //www.zakonprost.ru/content/base/ 165273]. (in Russian) Guide for the care and use of laboratory animals. 8th ed. / Commit- 23. tee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Research (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the 24. national academies. Washington : The National Academies Press, 2011.
Merkulov G.A. Course of pathohistological technique. Leningrad : Meditsina, 1969: 424 p. (in Russian)
Microscopy technique: guidance /ed. D.S. Sarkisov, Ju.L. Petrov. Moscow : Meditsina, 1996: 544 p. (in Russian) Buzulukov Ju.P., Gmoshinski I.V., Raspopov R.V., Demin V.F. et al. Studies on absorption and biodistribution of some inorganic nanoparticles administered into gastrointestinal tract using radioisotope tracers. Meditsinskaya radiologiya I radiatsionnaya bezo-pasnost' [Medical Radiology and Radidtoin Safety]. 2012; Vol. 57 (3): 5-12. (in Russian)
Van der Zande M., Vandebriel R.J., Doren E.V., Kramer E. et al. Distribution, elimination, and toxicity of silver nanoparticles and silver ions in rats after 28-day oral exposure. ACS Nano. 2012; Vol. 6 (8): 742 7-42.
Platonova T.A., Pridvorova S.M., Zherdev A.V., Vasilevskaya L.S. et al. Identification of silver nanoparticles in intestinal mucosa, liver and spleen of rats using transmission electron microscopy. Byul-leten' eksperimental'noy biologii i meditsiny [Bulletin of Experimental Biology and Medicine]. 2013. Vol. 155 (2): 204-9. (in Russian) Stensberg M.C., Wei Q., McLamore E.S., Porterfield D.M. et al. Toxi-cological studies on silver nanoparticles: challenges and opportunities in assessment, monitoring and imaging. Nanomedicine (Lond). 2011; Vol. 6 (5): 879-98.
Lapresta-Fernandez A., Fernandez A., Blasco J. Nanoecotoxicity effects of engineered silver and gold nanoparticles in aquatic organisms. Trends Anal Chem. 2012; Vol. 32 (2): 40-59. Demin V.A., Gmoshinsky I.V., Demin V.F., Anciferova A.A., et al. Modeling interorgan distribution and bioaccumulation of engineered nanoparticles (using the example of silver nanoparticles). Nanotech-nologies in Russia. 2015; Vol. 10 (3-4): 288-96. Shumakova A.A., Shipelin V.A., Sidorova Yu.S., Trushina E.N. et al. Toxicological evaluation of nanosized colloidal silver, stabilized with polyvinylpyrrolidone, in 92-day experiment on rats. I. Characterization of nanomaterial, integral, hematological parameters, level of thiol compounds and liver cell apoptosis. Voprosy pitaniya [Problems of Nutrition]. 2015; Vol. 84 (6): 46-57. (in Russian) Xiu Z.M., Zhang Q.B., Puppala H.L., Colvin V.L. et al. Negligible particle-specific antibacterial activity of silver nanoparticles. Nano Lett. 2012; Vol. 12 (8): 4271-5.
Mayansky A.N., Mayanski D.N. Essays on neutrophil and macrophage / ed. V.P. Kaznacheev. Novosibirsk : Nauka. Suberian Department, 1983: 256 p. (in Russian)
Takahashi R., Edashige K., Sato E.F., Inoue M., et al. Luminol chemi-luminescence and active oxygen generation by activated neutrophils. Arch Biochem Biophys. 1991; Vol. 285 (2): 325.
55
2
6
7
8
9
