CC BY
56
ГИГИЕНА ПИТАНИЯ
Для корреспонденции
Гмошинский Иван Всеволодович - доктор биологических наук,
ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой
токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий
ФГБУ «НИИ питания» РАМН
Алрес: 109240, Москва, Устьинский проезд, д. 2/14
Телефон: (495) 698-53-71
E-mail: [email protected]
A.А. Шумакова1, Е.А. Арианова1, В.А. Шипелин1, Ю.С. Сидорова1, А.В. Селифанов1, Э.Н. Трушина1, О.К. Мустафина1, И.В. Сафенкова2, И.В. Гмошинский1, С.А. Хотимченко1,
B.А. Тутельян1
Токсикологическая оценка наноструктурного диоксида кремния I. Интегральные показатели, аддукты ДНК, уровень тиоловых соединений и апоптоз клеток печени
#
Toxicological assessment of nanostructured silica. I. Integral indices, adducts of dna, tissue thiols and apoptosis in liver
A.A. Shumakova1, E.A. Arianova1, V.A. Shipelin1, Yu.S. Sidorova1, A.V. Selifanov1, E.N. Trushina1,
0.K. Mustafina1, I.V. Safenkova2,
1.V. Gmoshinsky1, S.A. Khotimchenko1, V.A. Tutelyan1
1 ФГБУ «НИИ питания» РАМН, Москва
2 ФГБУ «Институт биохимии им. А.Н. Баха» РАМН, Москва
1 Research Institute of Nutrition of Russian Academy of Sciences, Moscow
2 Institute of Biochemistry of A.N. Bach of Russian Academy of Science, Moscow
Наноструктурный аморфный диоксид кремния (SÍO2) широко используется в составе пищевых добавок, лекарственных препаратов и косметической продукции. Данные о пероральной токсичности этого нанома-териала (НМ) in vivo, полученные в острых и подострых экспериментах, противоречивы. Цель работы - оценка некоторых параметров токсичности наноструктурного SÍO2 при его пероральном введении крысам в течение 3 мес. В работе использовали коммерческий наноструктурный SÍO2, полученный газофазным гидролизом тетрахлорсилана, с размером первичных наночастиц 5-30 нм, который был охарактеризован как НМ рядом независимых методов. SÍO2 в виде водной дисперсии, обработанной ультразвуком, вводили крысам с исходной массой тела 80,0±4,0 г в течение первых 30 сут внутрижелудочно через зонд и далее в течение 62 сут в составе рациона в дозах 0,1; 1,0; 10 и 100 мг/кг массы тела в день. Животные контрольной группы получали носитель НМ - де-ионизованную воду. Определяли прибавку массы тела, относительную массу внутренних органов, проницаемость кишечной стенки для макромолекул овальбумина (определение концентрации в сыворотке крови с помощью твердофазного двухвалентного иммуноферментного теста), экскрецию с мочой продукта окислительной деструкции ДНК 8-оксо-2-дезоксигуанозина (8-oxo-G) (с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии), уровень тиоловых соединений в ткани печени (спектрофотометрически), апоптоз клеток печени
52
(проточный цитофлуориметр), эффективность закрепления условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ). Показано, что в результате введения наноструктурного 5102 в течение 3 мес во всех дозах масса тела животных снижается на 10-15%; в дозах 1 и 10 мг/кг отмечается достоверное увеличение массы надпочечников, в дозе 10 мг/кг достоверно снижается экскреция с мочой 8-охо-С. При максимальной дозе НМ (100 мг/кг) после 2 мес введения достоверно уменьшалось число животных, входивших в темный отсек экспериментальной установки при первичном тестировании УРПИ. По остальным изученным показателям не отмечено достоверных изменений при всех дозах вводимого НМ. Сделан вывод об отсутствии по изученным показателям выраженного токсического эффекта наноструктурного 5102 для крыс при ежедневной дозе до 100 мг/кг массы тела в течение 3 мес.
Ключевые слова: диоксид кремния, наночастицы, крысы, подострая токсичность, аддукты ДНК, глутатион, проницаемость кишечной стенки, апоптоз, поведенческие реакции
Nanostructured amorphous silica (SiO2) is widely used in food additives, pharmaceuticals and cosmetics. Available data on the oral toxicity of this nanomate-rial (NM ) in vivo, obtained in acute and subacute experiments are contradictory. The purpose of this study is evaluation of some parameters of toxicity of nanostructured SO2 when orally administered to rats for 3 months. We used commercial SO2 preparation, obtained by gas-phase hydrolysis of tetrachlorosilane with a size of the primary nanoparticles close to 5-30 nm, which was characterized as NM by several independent methods. SiO2 in the form of sonicated aqueous dispersion was administered to male rats with initial weight of 80±4 g for the first 30 days by intragastric gavage and then for 62 days with consumed diets in daily dose of 0,1; 1,0; 10 and 100 mg/kg body weight. The control animals received vehicle - deionized water. Weight gain, relative mass of internal organs, intestinal permeability to protein macromolecules (determination of ovalbumin level in blood serum by solid-phase bivalent immunoassay), urinary excretion of oxidative degradation product of DNA 8-oxo-2-deoxyguanosine (8-oxo-G) (by reversed phase HPLC), the level of thiol compounds in liver (spectrophoto-metrically), liver cell apoptosis (flow cytometer), fixing efficiency of passive avoidance (CRPA) have been measured. It has been shown that three-month administration of nanostructured SiO2 in all doses resulted in animal body weight decrease by 10-15%; a significant increase in adrenal weight was noticed under doses of 1 and 10 mg/kg and urinary 8-oxo-G excretion was significantly reduced at the dose 10 mg/kg. At the maximum dose of NM, 100 mg/kg, after 2 months of administration the number of animals decreased that entered the dark compartment of the experimental setup at initial testing of CRPA. The rest of the studied indices did not experience any significant changes depending on the dose of NM. It is concluded that no toxic effect were expressed in indices studied under the influence of nanostructured SiO2 in rats at daily doses up to 100 mg per kg body weight for 3 months.
Key words: silica, nanoparticles, rats, subacute toxicity, adducts of DNA, gluta-thione, intestinal permeability, apoptosis, behavioral reactions
Аморфный диоксид кремния (кремнезем, БЮ2) широко используется в настоящее время в качестве пищевой добавки (Е551), а также входит в состав большого числа таблетированных лекарственных средств и многих видов косметической продукции. В спецификации JECFA на данную пищевую добавку [23] отсутствует информация
о размере ее частиц, что допускает использование высокодисперсного аморфного БЮ2, полученного газофазным гидролизом тетрахлорсилана высокой степени чистоты. Данный материал, известный как «Аэросил» (ГОСТ 14922-77), характеризуется размером первичных частиц 5-30 нм, образующих рыхлые агрегаты субмикронного размера,
53
ГИГИЕНА ПИТАНИЯ
#
т.е. является наноматериалом (НМ), многие биологические свойства которого, в том числе предполагаемая токсичность, изучены недостаточно.
Необходимость оценки безопасности НМ обосновывается в постановлении Главного государственного санитарного врача РФ № 54 от 23.07.2007 «О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и содержащей нанома-териалы» и информационном письме Роспотреб-надзора «О надзоре за производством и оборотом продукции, содержащей наноматериалы» [5, 6]. В связи с этим в последние годы были проведены исследования по оценке безопасности при перо-ральном введении лабораторным животным различных образцов наноструктурного SiO2, которые дали противоречивые результаты [1, 3, 4].
Цель работы - токсиколого-гигиеническая оценка в подостром эксперименте на крысах длительностью 92 сут вводимого перорально нано-структурного SiO2, соответствующего по своим характеристикам ГОСТ 14922-77 и применяемого в качестве пищевой добавки, а также в фармацевтической и парфюмерно-косметической промышленности.
Материал и методы
Использован коммерческий высокодисперсный аморфный SiO2 «Орисил 300» по ТУ 24.1-31695418002-2003 (ООО «Силика», Россия, Московская обл., г. Долгопрудный). Индекс «300» в наименовании продукта означал удельную площадь поверхности в м2/г, определенную методом изотерм адсорбции инертных газов. В соответствии со спецификацией изготовителя изучаемое вещество соответствовало ГОСТ 14922-77. Продукт представлял рентгеноаморфный легкий белый порошок, дающий при диспергации ультразвуком в воде опалесцирующий бесцветный коллоидный раствор, стабильный не менее 2 сут. По данным изготовителя, частицы SiO2 в продукте являлись непористыми.
Оценка размера и формы частиц продукта выполнена методом трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) на просвечивающем электронном микроскопе «JEM-100CX» («JEOL», Япония); методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) на приборе «SmartSPM» («АИСТ-НТ», Россия), спектроакустическим методом на анализаторе «DT-1202» («Dispersion technology Inc.», США); методом динамического лазерного светорассеяния на анализаторе частиц «Nanotrack Wave» («Microtrac Inc.», США). В двух последних случаях исследование суспензии проводили после ультразвуковой обработки.
Эксперимент выполнен на 75 крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 80±4 г,
полученных из питомника РАМН «Столбовая». На протяжении всего эксперимента животные получали сбалансированный полусинтетический рацион согласно МУ 1.2.2520-09, тождественный по составу А^93 [20]. Крыс размещали в клетках группами по 3 особи, рацион и воду предоставляли в режиме свободного неограниченного доступа. В начале эксперимента животные были случайным образом разделены на 5 групп равной численности (по 15 крыс), совпадающих по исходной средней массе тела. Животным 1-й (контрольной) группы вводили носитель (деионизованную воду). Крысы 2-5-й групп получали наноструктрный БЮ2 в виде обработанной ультразвуком (в течение 5 мин, частота 44 кГц, мощность 1 Вт/см3) суспензии в деиони-зованной воде. В течение первых 30 сут введение НМ осуществляли внутрижелудочно через зонд, а на протяжении последующих 62 сут суспензию БЮ2 добавляли к корму животных; дозу при этом рассчитывали исходя из поедаемости рациона. Доза БЮ^ вводимая животным 2-5-й групп, составляла соответственно 0,1; 1,0; 10 и 100 мг/кг массы тела. В ходе эксперимента крыс ежедневно взвешивали на электронных весах (с точностью ±1 г), фиксировали заболеваемость, летальность, внешний вид, активность, состояние шерстяного покрова, стула, особенности поведения.
По истечении 60 сут эксперимента у 8-14 животных из каждой группы, выбранных случайным образом, исследовали закрепление УРПИ по методике, описанной в работе [11]. На I стадии тестирования (выработка у животных УРПИ, «обучение») крыс однократно помещали в светлый отсек камеры. Под влиянием поискового рефлекса и врожденного предпочтения темных участков пространства (фотофобии) определенное число крыс из каждой группы заходили в темный отсек. Регистрировали латентный период (ЛП) пребывания крыс в светлом отсеке камеры и число животных, отказавшихся от захода в темное помещение на протяжении всего времени наблюдения (180 с). Как только крыса переходила в темный отсек камеры, ворота автоматически закрывались и животное получало электрокожное раздражение на лапы (ток 0,4 мА в течение 8 с). После этого ворота между отсеками поднимались, и животное во всех случаях немедленно переходило в светлый отсек установки. Сразу после этого крысу переводили в клетку постоянного содержания.
На II стадии тестировали стойкость закрепления УРПИ у животных, совершивших заход в темный отсек на I стадии эксперимента. Для этого через 24 ч после первого тестирования этих животных повторно помещали в светлый отсек и фиксировали число заходов животных в темный отсек без нанесения болевого раздражителя и полное время пребывания в темном и светлом отсеках. Общее время пребывания крысы в установке
54
составило 180 с. Третью серию тестов (исследование угасания УРПИ как показателя когнитивной функции) осуществляли через 14 сут после первого тестирования в условиях, идентичных второму тестированию.
За 4 сут до завершения эксперимента у 5 животных из каждой группы осуществляли выборочное тестирование экскреции продукта окислительной деструкции ДНК 8-oxo-G с мочой, для чего крыс с 18.00 до 9.00 следующего дня помещали в обменные клетки. В ходе сбора образца мочи животные корм не получали, при этом доступ к воде не ограничивали. Экскрецию 8-oxo-G определяли с помощью обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии [2, 13] на колонке «Supersphere 100 RP18» (125x2 мм, 4 мкм) с предколонкой «Supersphere 100 RP18» (10x2 мм) («Merck», Германия), уравновешенной 10 мМ ацетат-аммонийным буфером, рН 4,3, в градиенте концентрации метанола 1-80%. В качестве детектора использовали трехуровневый квадрупольный масс-спектрометр «API 3000» («PE Biosystems», Германия), на котором определяли содержание иона с M/Z=168. Подготовку пробы проводили, как указано в работе [7].
Выведение животных из эксперимента осуществляли на 93 сут опыта путем обескровливания из нижней полой вены под эфирной анестезией. За 3 ч до этого по 8-9 крыс из каждой группы получали внутрижелудочно через зонд раствор овальбумина куриного яйца (ОВА) 0,15 М NaCl в дозе 3 г/кг массы тела. Определяли абсолютную и относительную массу внутренних органов (печени, почек, селезенки, сердца, семенников, тимуса, легких, надпочечников) путем взвешивания на электронных весах (с точностью ±0,01 г); в асептических условиях отбирали фрагмент правой доли печени для изучения апоптоза и содержимое слепой кишки для изучения состава кишечного микробиоценоза. Кровь отбирали дробно с антикоагулянтом (0,01% трикалиевая соль ЭДТА) для проведения биохимического и гематологического анализа и в стерильную сухую пробирку для отделения сыворотки. У части животных отбирали печень целиком, гомогенизировали ее в 0,1 М трис-HCl буфере рН 7,4, охлажденном до 0...+2 °С в соотношении 1:4 по массе. Для определения концентрации тканевых небелковых тиолов аликвоту 1 мл цельного гомогената печени смешивали при 0...+2 °С с 3 мл 6% трихлоруксусной кислоты (ч.д.а.) и через 10 мин центрифугировали при 3000g в течение 20 мин 0,5 мл супернатанта смешивали с 2 мл 0,4 М трис-HCl буфера рН 8,9 и 0,05 мл 0,4% раствора 5,5'-дитиобис-2-нитробензойной кислоты (реактива Эллмана) в этиловом спирте. Оптическую плотность измеряли при длине волны 412 нм на спектрофотометре СФ-46 («Ломо», Россия). При построении стандартных графиков исполь-
зовали восстановленный глутатион. Остальную часть гомогената использовали для выделения микросомальной фракции печени, используемой в биохимических и протеомных исследованиях.
Проницаемость кишечной стенки для макромолекул ОВА оценивали по его концентрации в сыворотке крови, которую определяли с помощью твердофазного двухвалентного иммунофер-ментного теста согласно [24] с незначительными модификациями. Величину всасывания ОВА в процентах от введенной дозы в расчете на весь кровоток рассчитывали исходя из предположения, что масса крови крысы составляет 6% от массы тела при гематокрите около 50%.
Состояние апоптоза клеток печени изучали на проточном цитофлуориметре «FC 500» («Beckman Coulter International S.A.», Австрия) [12]. Суспензию гепатоцитов получали с помощью автоматической системы для механической гомогенизации ткани «BD Medimachine» («Becton Dickenson and Company», США), однократно отмывали клетки забуференным фосфатами до рН 7,2-7,4 раствором 0,15 М хлорида натрия и готовили пробу с концентрацией клеток 1x106 см-3. Гепатоциты окрашивали конъюгированным с флуорохромом (FITC) аннексином V (AnV-FITC) и витальным красителем 7-аминоактиномицином (7-AAD) («Beck-man Coulter Int.», США) [8-10].
Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета SPSS 18.0 согласно критерию Стьюдента, непараметрическим критериям Манна-Уитни, х2 и критерию ANOVA. Различия признавали достоверными при уровне значимости p<0,05.
Результаты
Характеристика наноматериала
Исследование суспензии БЮ2 в концентрации 1 мкг/мл методом ТЭМ (рис. 1а) показало, что частицы на сеточке распределялись в основном в виде больших агрегатов, состоящих из первичных частиц размером от 5 до 100 нм, и очень небольшого количества отдельных частиц размером 5-20 нм. Метод АСМ показал на сканированных изображениях образцов суспензии, высушенных на подложке, присутствие наночастиц (НЧ), находящихся преимущественно в агрегированном состоянии. Агрегаты НЧ присутствовали на всех сканах с размером сканируемой области 20x20 мкм2; размеры агрегатов варьировали, достигая максимальной величины до 2 мкм в одном из измерений. Для всех агрегатов отмечено, что структурным элементом является частица с размерами менее 100 нм. Популяция НЧ в составе агрегатов была однородной по морфологии: состояла из сферических частиц с размерами от 20 до 60 нм (рис. 1б).
55
ГИГИЕНА ПИТАНИЯ
Рис. 1. Репрезентативные изображения частиц суспензии БЮг, полученные методами трансмиссионной электронной микроскопии (а) и атомно-силовой микроскопии (б)
#
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
-т-П^ 10,000
Рис. 2. Результаты исследования частиц БЮ2 методом динамического лазерного светорассеяния
По оси абсцисс - размер частиц, нм; по оси ординат: слева - доля частиц с размером не менее данного, % (лента), справа - доля частиц в интервале размеров, % (гистограмма).
Спектроакустическое исследование водной суспензии БЮ2 с концентрацией 5% по массе, обработанной ультразвуком, выявило бимодальное распределение частиц по размерам с преобладанием фракции НЧ со средним размером 20-40 нм. Анализ размера частиц образца в концентрации 1% по массе методом динамического лазерного светорассеяния показал, что в препарате преобладала фракция НЧ со среднечисловым гидродинамическим диаметром 56,6±32,1 нм, 90-й перцентиль -размера 91,7 нм (рис. 2). Содержание фракции частиц с диаметром более 100 нм после ультразвуковой обработки не превышало 10% от общего числа частиц.
Таким образом, на основании определения размера и формы частиц БЮ2 четырьмя независимыми методами было установлено, что исследуемый образец являлся НМ.
Состояние и рост животных в ходе эксперимента
На протяжении 1-го мес внутрижелудочного введения животным суспензии БЮ2 наблюда-
ли гибель 1 крысы в 4-й группе и 3 животных в 5-й группе. Вскрытие всех павших животных показало, что гибель наступила от двусторонней пневмонии, которая развивалась, как можно предположить, вследствие случайного попадания в дыхательные пути следов вводимой через зонд суспензии, содержащей высокую концентрацию НЧ. Наличие у НЧ БЮ2 ингаляционной токсичности известно по данным работ [18, 21, 22]. Кроме того, 1 крыса погибла в 3-й группе на 3-м месяце эксперимента. Остальные животные всех опытных групп по своему внешнему виду, состоянию шерстяного покрова и слизистых оболочек, двигательной активности, поведению не отличались от животных контрольной группы, имели нормальный стул. Определение средних ежемесячных прибавок массы тела (рис. 3) показало, что на протяжении 1-го и 2-го месяцев эксперимента животные всех групп прибавляли в массе практически одинаково (р>0,1 критерий ANOVA), однако по истечении 3-го месяца наблюдалось небольшое (не более 15%), но достоверное отставание в прибавке массы у животных во всех 4 опытных группах по сравнению с крысами из контрольной группы. Данный эффект не являлся дозозависимым и был связан у животных данного возраста, по всей вероятности, с сокращением прироста жировой массы, что не может быть интерпретировано как признак неблагоприятного (токсического) действия вводимого в рацион БЮ2.
Уровень тревожности и состояние когнитивной функции
Тестирование животных по методу УРПИ осуществляли по истечении 1 мес введения БЮ2 в составе рациона и 2 мес с начала эксперимента. Как показали результаты исследований (табл. 1), на I стадии эксперимента все животные 1-й (контрольной) группы зашли в темный отсек в течение тест-периода 180 с. При этом в опытных группах (со 2-й по 5-ю) определенное число животных
56
Доза, мг/кг массы тела □о По,1 И1,о И10 И100
300 1
250 - _
200 -
2 150 -
100 -
50
Месяцы
Рис. 3. Средняя масса тела (а) и средний прирост массы тела (б) крыс в ходе эксперимента
* - достоверность отличий (р<0,05) от показателя 1-й группы по критерию Манна-Уитни.
Таблица 1. Результаты первого тестирования (выработка условного рефлекса пассивного избегания) у крыс
#
Группа Общее число крыс в опыте (я) Число крыс, зашедших в темный отсек, абс. (%) Число крыс, не зашедших в темный отсек в течение 180 с, абс. (%)
1-я 8 8 (100) 0 (0)
2-я 9 8 (89) 1 (11)
3-я 11 8 (73) 3 (27)
4-я 14 10 (71) 4 (29)
5-я 13 8 (61) 5 (39)
Достоверность различия групп, критерий х2, р 1-2-я >0,05
1-3-я >0,05
1-4-я >0,05
1-5-я 0,044
Ф
отказались от вхождения в темный отсек, причем их доля росла с увеличением дозы НМ. В 5-й группе при наибольшей дозе БЮ2 5 (39%) из 13 животных не вошли в темный отсек, что достоверно отличается от контроля (р<0,05, критерий х2). Как показало второе тестирование, только одна крыса из 1-й группы вошла в темный отсек; во 2-5-й группах таких животных не было, т.е. рефлекс УРПИ у них полностью закрепился. Закрепление УРПИ было очень стойким, так что и через 14 сут, при третьем тестировании, ни одно животное из всех 5 групп не вошло в темный отсек. Таким образом, результаты показали отсутствие негативного влияния БЮ2 на когнитивную функцию (стойкость закрепления УРПИ) во всех изученных дозах, однако при наибольшей из них (100 мг/кг) можно предположить наличие у животных повышенного уровня дискомфорта (тревожности), что выразилось в достоверном сокращении числа первичных заходов в темный отсек.
Масса внутренних органов
Данные, приведенные в табл. 2, показали, что каких-либо изменений в массе большинства внутренних органов в зависимости от дозы БЮ2 не наблюдалось. Исключение составляют надпочечники, относительная масса которых была достоверно (р<0,05) повышена в 3-й и 4-й группах по сравнению с 1-й группой, максимум, на 32%. В 5-й группе, получавшей наибольшую дозу НМ, данный эффект не воспроизводился, т.е. не являлся дозозависимым.
Проницаемость кишечной стенки
Перорально вводимые НЧ некоторых видов могут оказать раздражающее воздействие и вызвать воспаление в стенке тонкой кишки. Ввиду этого представляло интерес выявить, способен ли нано-структурный БЮ2 оказать влияние на проницаемость кишечной стенки для макромолекул белка. Данные, представленные на рис. 4, показали, что при воздействии на животных изучаемого НМ
57
ГИГИЕНА ПИТАНИЯ
Таблица 2. Относительная масса органов крыс на 93-и сутки эксперимента
Группа Доза диоксида кремния, мг/кг массы тела Число животных в группе Масса органов, % от массы тела, M±m
печень почки селезенка гонады сердце тимус легкие надпочечники
1-я 0 (контроль) 9 2,77±0,06 0,628±0,017 0,347±0,018 0,737±0,029 0,284±0,009 0,139±0,008 0,476±0,013 0,022±0,001
2-я 0,1 10 2,67±0,16 0,631±0,036 0,321±0,018 0,733±0,026 0,274±0,013 0,131±0,012 0,493±0,027 0,024±0,003
3-я 1,0 9 2,65±0,06 0,643±0,018 0,347±0,024 0,770±0,016 0,266±0,005 0,142±0,006 0,501±0,014 0,028±0,001*
4-я 10 9 2,59±0,07 0,629±0,015 0,321±0,007 0,822±0,040 0,268±0,006 0,156±0,006 0,477±0,020 0,029±0,002*
5-я 100 7 2,71±0,04 0,639±0,016 0,306±0,015 0,769±0,025 0,280±0,009 0,130±0,011 0,480±0,019 0,027±0,002
Примечание. * - различие с 1-й группой достоверно, р<0,05 по критерию Манна-Уитни.
#
0,014 0,012 0,010 0,008 0,006 0,004 0,002 0,000
Q60 0,50 0,40 030 Ц20 Q10 ООО
1-я
2-я
3-я
4-я
5-я
1-я
2-я
3-я
4-я
5-я
Рис. 4. Данные, характеризующие проницаемость кишечной стенки для макромолекул белка у крыс
По оси абсцисс - группа животных; по оси ординат - всасываемость макромолекул овальбумина куриного яйца в кровь, % от введенной дозы х103, М±т.
Рис. 5. Экскреция 8-оксо-2-дезоксигуанозина с мочой у крыс
По оси абсцисс - группа животных; по оси ординат - суточная экскреция 8-оксо-2-дезоксигуанозина, нг/мг креатинина, М±т; * - достоверность различий (р<0,05) от показателя 1-й группы по критерию Манна-Уитни.
в течение 3 мес в дозе до 100 мг/кг массы тела не наблюдалось каких-либо достоверных систематических изменений всасываемости макромолекул белка в кровь.
Окислительное повреждение ДНК
Данные, представленные на рис. 5, показали, что экскреция 8-охо-в с мочой у животных 2-й, 3-й и 5-й групп достоверно не отличалась от контроля, а в 4-й группе была достоверно снижена, что свидетельствовало об ослаблении процессов окислительного повреждения ДНК в этой группе. Этот эффект не может быть интерпретирован как вредный и, как ясно из полученных данных, он не являлся дозозависимым. Таким образом, какого-либо негативного влияния БЮ2 на геном животных по показателю его окислительного повреждения не выявлено в дозе, как минимум, 100 мг/кг массы тела.
58
Содержание тиоловых соединений в печени
Содержание в печени небелковых тиоловых соединений, представленных у крысы главным образом восстановленным глутатионом, является важным показателем, характеризующим состояние окислительно-восстановительного (Red/Ox) гомеостаза организма. Как следует из данных, представленных на рис. 6, общее содержание в печени небелковых тиоловых соединений (в пересчете на глутатион) у животных опытных групп достоверно не отличалось от контроля (р>0,1, ANOVA для 1-5-й групп). Таким образом, нано-структурный SiO2 не оказывал сколько-нибудь выраженного влияния на этот параметр в дозе вплоть до 100 мг/кг массы тела.
Апоптоз клеток печени
Количество клеток печени, находившихся на разных стадиях апоптоза, и мертвых клеток,
ф
I ■ ■ ■ ITÍ
А.А. Шумакова, Е.А. Арианова, В.А. Шипелин и др.
по данным анализа проточной цитофлуоримет-рии, представлено в табл. 3. Содержание живых клеток в печени животных всех четырех опытных групп находилось в пределах нормальных значений, определенных ранее [8, 9], и не отличалось достоверно от контроля (р>0,05; ANOVA и тест Манна-Уитни). То же было справедливо и для количества клеток, находившихся в раннем и позднем апоптозе, и общего числа клеток в апоптозе. Количество мертвых клеток было незначительно по величине, отличалось большой вариабельностью и также достоверно не различалось между опытными и контрольной группами. Таким образом, свидетельств об усилении процессов апопо-тоза клеток печени при потреблении животными наноструктурного БЮ2 в дозе до 100 мг/кг массы тела не получено.
56,0 54,0 52,0 50,0 48,0 46,0 44,0 42,0 40,0
1
Рис. 6. Содержание небелковых тиолов (в расчете на восстановленный глутатион) в печени крыс
По оси абсцисс - группа животных; по оси ординат - содержание глутатиона в печени, мкмоль (в пересчете на орган).
Обсуждение результатов
Токсикологическая оценка наноструктурного SiO2 в эксперименте продолжительностью 3 мес проведена в данной работе в интервале доз НМ от 0,1 до 100 мг/кг массы тела, что соответствует количеству кремния от 0,047 до 47 мг на 1 кг массы тела. Поскольку адекватный уровень (АУ) потребления кремния в России составляет 30 мг, а верхний допустимый уровень (ВДУ) - 50 мг (МР 2.3.1.1915-04), минимальная использованная доза в расчете на человека с массой тела 70 кг составляет 11% от АУ, а максимальная достигает 11000% от АУ и 6600% от ВДУ кремния. Дальнейшая аггравация дозы SiO2 не представлялась возможной, так как при этом резко возрастал риск гибели животных вследствие аспирации следов суспензии НМ в ходе зондовых введений в течение первого месяца опыта.
Согласно данным исследований in vitro, НЧ аморфного SiO2 при поступлении во внутреннюю среду организма могут быть токсичными. В основе неблагоприятных эффектов НЧ может лежать каталитическая генерация свободнорадикальных соединений, которая была выявлена в бесклеточной системе [25], в культуре кератиноцитов [16] и альвеолярных эпителиоцитов человека [14]. Цитотоксические эффекты НЧ SiO2 для клеток линии EAHY926 были выявлены в исследовании
Таблица 3. Показатели апоптоза клеток печени у крыс
[17]. При этом частицы субмикронного размера (100-330 нм) не были токсичны. В культуре стволовых клеток эмбриона мыши НЧ аморфного SiO2 диаметром 10 и 30 нм (но не 80 нм) подавляли дифференцировку в нормальные кардиомиоциты [19]. Апоптоз и изменения в экспрессии р53, Вах и Bcl-2 под действием НЧ SiO2 размером 21 нм были выявлены в нормальных клетках печени линии L-02 [28]. О наличии у НЧ SiO2 цитотоксических свойств указывают также данные работ [15, 26, 27]. Однако с учетом предположительно крайней низкой всасываемости и биодоступности НЧ SiO2 по аналогии с другими оксидными НЧ перечисленные данные, полученные на моделях in vitro, трудно распространить на ситуацию перорального поступления НЧ в организм. По данным ряда исследований in vivo, наноструктурный аморфный SiO2 обладает выраженной ингаляционной токсичностью [18, 21, 22]. Однако при изучении эффектов НЧ SiO2 после перорального введения получены противоречивые результаты. Внутрижелудоч-ное зондовое введение крысам наноструктурного аморфного SiO2 с удельной поверхностью 220 м2/г в дозах 1 и 100 мг на 1 кг массы тела на протяжении 30 сут не вызвало выраженного токсического воздействия, судя по всему комплексу изученных биохимических, физиологических, гематологических и аллергологических показателей [1]. В работах
Группа Число животных Количество, % от общего числа проанализированных клеток, M±m
живые клетки (AnV"7-AAD") ранний апоптоз (AnV+7-AAD") поздний апоптоз (AnV+7-AAD+) сумма клеток в апоптозе (AnV+) мертвые клетки (AnV—7-AAD+)
1-я 6 94,92±0,41 4,80±0,44 0,117±0,040 4,92±0,45 0,150±0,067
2-я 6 94,75±0,46 4,98±0,50 0,183±0,054 5,17±0,48 0,133±0,033
3-я 6 94,05±0,49 5,53±0,49 0,183±0,048 5,72±0,53 0,267±0,084
4-я 6 94,73±0,44 4,87±0,50 0,150±0,056 5,02±0,47 0,250±0,056
5-я 6 93,87±0,46 5,60±0,49 0,267±0,084 5,87±0,51 0,233±0,076
59
ГИГИЕНА ПИТАНИЯ
[3, 4] мышам внутрижелудочно в остром опыте вводили «монодисперсные» НЧ БЮ2, полученные методом жидкокристаллического темплатирования с использованием цетилтриметиламмония бромида в качестве темплата. Частицы БЮ2 имели эллиптическую форму размером около (50~70)х(20~30) нм. Отмечалась гибель животных в группах, получивших НМ, на 3-и и 4-е сут при величине LD5o, равной 4600 мг/кг массы тела. При дозе НЧ БЮ2 выше 0,2 LD50 отмечено повреждение форменных элементов крови, а в дозе 0,3LD50 выявлены морфологические изменения системы кровообращения, лимфоидной и макрофагальной систем, а также дегенеративные изменения в печени и почках. Изученные НЧ БЮ2 характеризовались значительной кумулятивностью (индекс кумулятивности 0,45).
Можно предположить, что основной причиной расхождения результатов работ [1] и [3, 4] является различие в свойствах применявшихся препаратов БЮ2. При этом следует отметить, что оба изученных вида наноструктурного БЮ2 не применяются в составе потребительской, в том числе пищевой продукции, и не соответствуют по своим характеристикам наиболее распространенной в пищевых производствах форме наноструктурного БЮ2 типа «Аэросил». Изучение подострой пероральной токсичности этого НМ с размером первичных частиц 5-30 нм, проведенное в настоящей работе, показало, что для него отсутствовали выраженные признаки токсического действия при введении
в течение 3 мес в дозе до 100 мг/кг массы тела ежедневно по интегральным показателям, включая прибавку массы тела, проницаемость кишечной стенки для макромолекул, стойкость закрепления УРПИ. Не выявлено негативного влияния НЧ на такие маркеры токсического действия, как уровень тканевых тиолов, окислительное повреждение ДНК, апоптоз клеток печени. Отдельные выявленные эффекты (гипертрофия надпочечников у животных 3-й и 4-й групп) были относительно незначительными по абсолютной величине и не демонстрировали четкой зависимости от дозы НЧ. Единственным показателем, характеризовавшимся зависимостью от дозы, было число животных, отказавшихся от первичного захода в темный отсек в тесте УРПИ, причем эффект был достоверным при дозе 100 мг/кг. Однако данный показатель не входит в стандартный протокол УРПИ-теста, и ввиду этого его корректная интерпретация затруднена. В итоге необходимо констатировать, что свидетельств подострой пероральной токсичности наноструктурного БЮ2 типа «Аэросил» в эксперименте длительностью 3 мес не выявлено, в том числе и при значительно аггравированной дозе 100 мг/кг массы тела. Для подтверждения либо уточнения этого результата в последующих публикациях будет проведен анализ более широкого набора маркеров токсического действия, включая биохимические, гематологические, иммунологические и микробиологические показатели.
Сведения об авторах
Шумакова Антонина Александровна - аспирант, младший научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУ «НИИ питания» РАМН (Москва) E-mail: [email protected]
Арианова Елена Александровна - младший научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУ «НИИ питания» РАМН (Москва) E-mail: [email protected]
Шипелин Владимир Александрович - младший научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУ «НИИ питания» РАМН (Москва) E-mail: [email protected]
Сидорова Юлия Сергеевна - аспирант, младший научный сотрудник лаборатории пищевых биотехнологий и специализированных продуктов ФГБУ «НИИ питания» РАМН (Москва) E-mail: [email protected]
Селифанов Александр Васильевич - младший научный сотрудник лаборатории химии пищевых продуктов ФГБУ «НИИ питания» РАМН (Москва) E-mail: [email protected]
Трушина Элеонора Николаевна - кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории спортивного питания с группой алиментарной патологии ФГБУ «НИИ питания» РАМН (Москва) E-mail: [email protected]
Мустафина Оксана Константиновна - научный сотрудник лаборатории спортивного питания с группой алиментарной патологии ФГБУ «НИИ питания» РАМН (Москва) E-mail: [email protected]
Сафенкова Ирина Викторовна - кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории иммуно-биохимии ФГБУ «Институт биохимии им. А.Н.Баха» РАН (Москва) E-mail: [email protected]
Гмошинский Иван Всеволодович - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУ «НИИ питания» РАМН (Москва) E-mail: [email protected]
Хотимченко Сергей Анатольевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУ «НИИ питания» РАМН (Москва) E-mail: [email protected]
Тутельян Виктор Александрович - академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, директор ФГБУ «НИИ питания» РАМН (Москва) E-mail: [email protected]
Литература
1. Верников В.М., Распопов Р.В., Арианова Е.А. и др. Ток-сиколого-гигиеническая оценка препаратов нанострук-турированного диоксида кремния в эксперименте на лабораторных животных // Инновационные технологии в управлении, образовании, промышленности «АСТИН-ТЕХ-2010». - Астрахань: ИД «Астраханский университет», 2010. - С. 4-7.
2. Жанатаев А.К., Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Перспективы определения 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина в качестве биомаркера окислительного стресса в эксперименте и клинике // Вестн. РАМН. - 2002. - № 2. - С. 45-49.
3. Зайцева Н.В., Землянова М.А., Звездин В.Н., Саенко Е.В. Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности водной суспензии нанодисперсного диоксида кремния, синтезированного методом жидкокристаллического темпла-тирования // Анализ риска здоровью. - 2013. - № 1. -С. 65-72.
4. Зайцева Н.В., Землянова М.А., Лебединская О.В. и др. Влияние нанодисперсного диоксида кремния на структурные особенности внутренних органов экспериментальных животных // Морфология. - 2013. - Т. 144, № 5. -С. 78-79.
5. Онищенко Г.Г., Арчаков А.И., Бессонов В.В. и др. Методические подходы к оценке безопасности наномате-риалов // Гиг. и сан. - 2007. - № 6. - С. 3-10.
6. Онищенко Г.Г., Тутельян В.А. О концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения нано-материалов // Вопр. питания. - 2007. - Т. 76, № 6. -С. 4-8.
7. Распопов Р.В., Верников В.М., Шумакова А.А. и др. Ток-сиколого-гигиеническая характеристика наночастиц диоксида титана, вводимых в виде дисперсии в желудочно-кишечный тракт крыс. Сообщение 1. Интегральные, биохимические и гематологические показатели, степень всасывания макромолекул в тонкой кишке, повреждение ДНК // Вопр. питания. - 2010. - Т. 79, № 4. -С. 21-30.
8. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Биодоступность наночастиц оксида железа при использовании их в питании. Результаты экспериментов на крысах // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 3. -С. 25-30.
9. Распопов Р.В., Трушина Э.Н., Мустафина О.К. и др. Характеристика эффективности использования наночастиц
оксида цинка в питании. Эксперименты на лабораторных животных // Вопр. питания. - 2011. - Т. 80, № 5. -С. 39-44.
10. Трушина Э.Н., Мустафина О.К., Бекетова Н.А. и др. Влияние пищевых волокон на апоптоз гепатоцитов крыс с алиментарной поливитаминной недостаточностью // Вопр. питания. - 2014. - Т. 83, № 1. - С. 33-40.
11. Фоломкина А.А., Орлова Н.В., Базян А.С Влияние однократного введения мелипрамина на двигательную активность и оборонительные условные рефлексы пассивного и активного избегания у крыс // Журн. высш. нервн. деят. -2004. - Т. 54, № 6. - С. 829-834.
12. Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Вопросы современной проточной цитометрии, клиническое примечание. - Челябинск, 2008. - C. 63-112.
13. De Martinis B.S., Bianchi M.L.P. Methodology for urinary 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine analysis by HPLC with electrochemical detection // Pharmacol. Res. - 2002. -Vol. 46, N 2. - P. 129-131.
14. Eom H.J., Choi J. Oxidative stress of silica nanoparticles in human bronchial epithelial cell, Beas-2B // Toxicol. In Vitro. - 2009. - Vol. 23, N 7. - P. 1326-1332.
15. Eom H.-J., Choi J. Nanoparticles induced cytotoxicity by oxidative stress in human bronchial epithelial cell, Beas-2B // Environ. Health Toxicol. - 2011. - Vol. 26. - P. e2011013.
16. Nabeshi H., Yoshikawa T., Matsuyama K. et al. Amorphous nanosilica induce endocytosis-dependent ROS generation and DNA damage in human keratinocytes // Part Fibre Toxicol. -2011. - Vol. 8, N 1. - P. 1-10.
17. Napierska D., Thomassen L.C., Rabolli V. et al. Size-dependent cytotoxicity of monodisperse silica nanoparticles in human endothelial cells // Small. - 2009. - Vol. 5, N 7. - P. 846853.
18. Park E.J., Park K. Oxidative stress and pro-inflammatory responses induced by silica nanoparticles in vivo and in vitro // Toxicol. Lett. - 2009. - Vol. 184, N 1. - P. 18-25.
19. Park M.V., Annema W., Salvati A. et al. In vitro developmental toxicity test detects inhibition of stem cell differentiation by silica nanoparticles // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 2009. - Vol. 240, N 1. - P. 108-116.
20. Reeves P.G., Nielsen F.H., Fahey G.C. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet // J. Nutr. - 1993. - Vol. 123, N 11. -P. 1939-1951.
61
ГИГИЕНА ПИТАНИЯ
#
21. Rossi E.M., Pylkkgnen L, Koivisto A.J. et al. Airway exposure 25. to silica-coated TiO2 nanoparticles induces pulmonary neutrophilia in mice // Toxicol. Sci. - 2010. - Vol. 113, N 2. -
P. 422-433.
22. Sayes C.M., Reed K.L., Glover K.P. et al. Changing the 26. dose metric for inhalation toxicity studies: short-term study in rats with engineered aerosolized amorphous silica nanoparticles // Inhal. Toxicol. - 2010. - Vol. 22, N 4. -
P. 348-354. 27.
23. Silicon dioxide, amorphous. - Rome: J EC FA, 1973-1992. -2 p. http://www.fao.org/food/food-safety-quality/scientific-advice/jecfa/jecfa-additives/en/. 28.
24. Stuart C.A., Twistelton R, Nicholas M.K., Hide D.W. Passage of cow's milk proteins in breast milk // Clin. Allergy. -1984. - Vol. 14, N 6. - P. 533-535.
Thomassen L.C., Aerts A., Rabolli V. et al. Synthesis and characterization of stable monodisperse silica nanoparticle sols for in vitro cytotoxicity testing // Langmuir. - 2010. -Vol. 26, N 1. - P. 328-335.
Yang H., Wu Q., Tang M. et al. In vitro study of silica
nanoparticle-induced cytotoxicity based on real-time cell
electronic sensing system // J. Nanosci. Nanotechnol. -
2010. - Vol. 10, N 1. - P. 561-568.
Yang X., Liu J., He H. SiO2 nanoparticles induce cytotoxicity
and protein expression alteration in HaCaT cells // Part Fibre
Toxicol. - 2010. - Vol. 7, N 1. - P. 1-10.
Ye Y., Liu J., Xu J. et al. Nano-SiO2 induces apoptosis via
activation of p53 and Bax mediated by oxidative stress
in human hepatic cell line // Toxicol. In Vitro. - 2010. -
Vol. 24, N 3. - P. 751-758.
62
