CC BY
154
Биомедицина • № 1, 2010, С. 37-50
Моделирование системной анафилаксии на мышах линии ВА1_Ь/с
Н. В. Вельская, М. Г. Данилец, Ю. П. Вельский, Е. С. Трофимова,
Е. Г. Учасова, О. С. Борсук, В. И. Агафонов
Научно-исследовательский институт фармакологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, Томск
Контактная информация: НИИ фармакологии СО РАМН, 634028, г. Томск, пр. Ленина, 3
В данной работе поставлена цель обосновать возможность и показать преимущества модедирова ния системной анафилаксии на мышах линии ВАШс с использованием овальбумина. Эксперименты были проведены на мышах линии ВАШс в сравнении с мышами С57В1У6. Использованы различные режимы и схемы иммунизации овальбумином и проведена оценка степени тяжести анафилактического шока в зависимости от линии животных и схемы иммунизации. Оценена продукция Т-лимфоцитами селезенки цитокинов ТЫ и ТЬ2'профиля, а также определено содержание иммуноглобулинов класса Е в сыворотке крови в зависимости от числа иммунизаций. Показано, что результаты анафилактического шока в случае использования лошадиной сыворотки ниже, чем в случае применения овальбумина в качестве антигена. Авторы заключают, что индукция системной анафилаксии с использованием мышей линии ВАЬВ/с и овальбумина является добротной, адекватной и экономичной биологической моделью для исследования аллергических (иммуноглобулин-Е-зависимых) заболеваний.
Ключевые слова: анафилаксия; цитокины ТЫ и 1112-профиля; иммуноглобулины класса Е.
Заболевания, связанные с патологией иммунной системы, являются важной медико-социальной проблемой современного общества. Наиболее интенсивный рост наблюдается в следующих группах иммунных болезней: аллергические и онкологические заболевания, а также синдром пониженной сопротивляемости организма инфекциям. Несмотря на успехи в области иммунофармакологии и разработки в последние годы рекомбинантных препаратов на основе человеческих цитокинов, индукторов интерферо-нов и др., проблема остается нерешенной, а указанные патологии, напротив, выходят на первое место в развитых странах и в мире.
Повышение распространенности инфекций, утяжеление протекания некоторых из них (например, туберкулеза),
возрастание лекарственно-устойчивых форм возбудителей, а также появление новых факторов, таких как глобализация, приводящих к усложнению эпидемиологической обстановки, - все это вынуждает мировое сообщество объединять усилия. Примером чего может служить проведение в Российской Федерации программ ВОЗ, три из пяти которых связаны с борьбой с инфекциями [10].
Частота встречаемости онкологических заболеваний неуклонно растет, при этом увеличивается и количество заболевших детей. Так, за последние 30 лет XX века ежегодный статистически значимый прирост данной патологии в странах Европы у детей в возрасте 1-14 лет составил 1%, у подростков 15-19 лет -1,5% [29].
По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), частота встречаемости аллергических патологий за последние десятилетия возросла в 2-3 раза; аллергическими заболеваниями страдают около 1-3% взрослого и 10-20% детского населения планеты, а на протяжении жизни аллергические реакции проявляются почти у каждого третьего человека планеты [15].
Известно, что центральное место в регуляции иммунологической реакции принадлежит цитокинам, которые вырабатывают Т-хелперы (Th). Показано, что после дифференцировки и созревания в тимусе наивные Th-прекурсоры мигрируют в периферические органы иммунной системы, где под действием антигена необратимо дифференцируются в два разных типа Till или Th2 [27], которые различаются по набору секретируемых цигокинов [20]. Именно от качества поляризации зависят характер течения и итог иммунного ответа. Клинические проявления дисбаланса Thl/Th2 разнообразны и включают как инфекционные, так и неинфекционные патологи и: хронические инфекции, аллергические, онкологические, аутоиммунные заболевания. Аллергии и аутоиммунные заболевания связаны с патологически избыточным Th2 либо Till-типом иммунного ответа соответственно, хронические инфекции и онкологические заболевания сопровождаются недостаточным'Ihl-типом [12,
17, 21, 24, 25]. Характерными признаками Thl являются повышенная секреция интерферона-у, интерлейкина-2, фактора некроза опухоли (3, индукция продукции В-клетками антител IgG2a, участие в реакции гиперчувствителыгости замедленного типа, защита от внутриклеточных паразитов, противоопухолевая активность. ТЬ2-клетки выраба-
тывают интерлейкин-4, интерлейкин-5, интерлейкин-10, преобладают при гельминтозах и аллергиях, способствуют генерации иммуноглобулин-Е-синтезирующих В-клеток, играют важную роль в гуморальном иммунном ответе [13, 20, 28]. Основным фенотипическим признаком Till является высокая продукция интерферона-у, а характерным признаком Th2 - повышенная продукция интерлейкина-4 [5, 22, 26]. Если 1 тип поляризации обеспечивает протективный клеточный иммунитет, то клинические проявления ТЪ2-ответа более разнородны. Это либо реакции гиперчувствительности немедленного типа (анафилактические реакции, бронхиальная астма, гельминтозы), характерными признаками которых являются эозинофилия и повышенный синтез иммуноглобулинов класса Е (Ig Е), либо состояния толерантности (оральная толерантность, беременность, опухолевый рост), для которых характерна гиперпродукция Т-лимфоцитами трансформирующего фактора роста ff и интерлейкина-10 [11,16].
Среди аллергических заболеваний наиболее распространенными являются иммуноглобулин-Е-зависимые болезни (такие, как бронхиальная астма, атопический бронхит, аллергический ринит, поллиноз, атопическая экзема, атопический конъюктивит, крапивница). В основе иммуноцатогенеза этих заболеваний лежит активация Th2, что приводит к повышенной продукции ряда цитоки-нов, основной из них - интерлейкин-4, который, в свою очередь, вызывает появление и поддержание на повышенном уровне синтеза иммуноглобулинов класса Е [6, 15]. Основными препаратами, используемыми в настоящее время для лечения иммуноглобулин-Е-
зависимых аллергических заболеваний, являются гистаминолитики, представленные блокаторами Н,-рецепторов и стабилизаторами мембран тучных клеток, а в угрожающих жизни ситуациях (при бронхиальной астме) используются глюкокортикоидные средства [4]. Необходимость в лекарственных средствах, подавляющих эту избыточную активность ТЪ2, для использования в терапии ^Е-зависимых патологий достаточно очевидна и широко обсуждается в научной литературе (см., например, обзор [3]). Однако фармакологические средства, которые были бы направлены на основную причину иммуноглобулин -Е-зависимых патологий - на коррекцию баланса ТЫ/ТЬ2, пока не созданы, хотя поиск таких средств является актуальным.
Совершенно очевидно, что поиск и создание такого типа противоаллергических препаратов нового класса невозможен без добротной, адекватной и экономичной биологической модели. С точки зрения целесообразности, наиболее подходящей моделью является системная анафилаксия, поскольку она позволяет дать интегральную оценку аллергенспе-цифическому ТЬ2-типу иммунного ответа. Действительно, развитие и исход данной реакции охватывает все этапы и звенья патогенеза иммуноглобулин-Е-зависимых заболеваний от поляризации иммунного ответа в 1Ь2-тип с последующей гиперпродукцией интерлейкина-4 и иммуноглобулинов класса Е, до этапа выброса медиаторов воспаления (таких, как гистамин, серотонин, брадикинин), повышения проницаемости кровеносных сосудов, развития отеков тканей, бронхоспазма, гиперсекреции мокроты в дыхательных путях и других гистохимических изменений, приводящих к угрозе
жизни организма. В методических рекомендациях по доклиническому изучению новых фармакологических веществ для моделирования системной анафилаксии предлагаются морские свинки, а в качестве сенсибилизирующего агента
- лошадиная сыворотка [2]. Однако такой экспериментальный подход обладает рядом существенных недостатков. Морские свинки, во-первых, не экономичны как по стоимости, так и по содержанию. Кроме того, генетически контролируемые морские свинки (линейные) в нашей стране практически не доступны экспериментаторам, а проведение работ на беспородных животных приводит к низкой воспроизводимости результатов и широкому диапазону реакции внутри исследуемых групп. В-третьих, лошадиная сыворотка практически не стандартизуема, ее характеристики могут значительно отличаться партия от партии, что, соответственно, не может не влиять на воспроизводимость результатов анафилактического шока в разных сериях экспериментов.
Всех этих недостатков можно избежать в случае использования линейных мышей и коммерчески стандартизированного антигена. Целью дан ной работы было обосновать возможность и показать преимущества моделирования системной анафилаксии на мышах линии ВАЬЬ/с с использованием овальбумина.
Материалы и методы
Эксперименты проведены на конвенциональных линейных мышах линий С57ЪЫ6Х (159 голов) и ВАЬЬ/сУ (210 голов). Использованы животные обоего пола в возрасте 8-9 недель, полученные из питомника НИИ фармакологии СО РАМН (1 категории согласно сертификату). Мыши содержались в неполной барьерной системе
(воздухообмен составлял 10-12 крат/ч, температура 22х2°С, влажность 65x10%, световой режим 12:12 ч). Мыши размещались по 4-5 особей в клетках (VELAZ) со стерилизованной мелкой стружкой в качестве подстила, имели постоянный доступ к пище (стерилизованный гранулированный корм) и воде (кипяченая питьевая вода, подкисленная соляной кислотой до pH 4-4,5).
Сенсибилизацию мышей осуществляли подкожным (бедро) введением оваль-бумина (100 мкг/мышь, «Sigma») с гидроокисью алюминия (5 мг/мышь, «Sigma») в качестве адъюванта в объеме 0,1 мл 1, 2 или 3 раза с интервалом 1 или 2 недели между иммунизациями. Животным контрольной группы вводили по ОД мл изотонического раствора хлорида натрия.
Сенсибилизацию мышей линии BALb/cY лошадиной сывороткой проводили, как описано ранее [1]. Разведешгуго изотоническим раствором хлорида натрия лошадиную сыворотку (1:10) вводили подкожно (в бедро) по 0,2 мл; контрольные животные получали только изотонический раствор хлорида натрия. Интервал между повторными инъекциями составлял 4 дня.
Для получения спленоцитов животных забивали дислокацией шейного отдела позвоночника под легким эфирным наркозом, выделяли селезенку, гомогенизировали ее. Полученную суспензию фильтровали через четырехслойный капрон, трижды промывали холодным изотоническим раствором хлорида натрия, ресуспендировали в культуральной среде (RPMI 1640 («Sigma») с добавлением 10% ЭТС («ICN», «Serva»), 20 мМ HEPES («Sigma»), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола («Sigma»), 50 мкг/мл гентамицина («Sigma») и 2 мМ L-глютамина («Sigma»)). Жизнеспособность клеток суспензии оценивали в тесте с 0,1% трипановым
синим. В экспериментах использовали суспензии, содержащие не менее 95% жизнеспособных клеток. Клетки культивировали в атмосфере с 5% С07 и аб солютной влажности.
Получение супернатантов Т-лимфоцитов для определения продукции цито-кинов получали, как описано ранее [30]. Для этого спленоциты культивировали 24 ч в концентрации 5х106 клеток/мл в присутствии Т-клеточного митогена (конканавалин A, «Sigma», 4 мкг/мл). Затем клетки удаляли центрифугированием, надосадок разливали на аликвоты и хранили при -20°С.
Определение продукции интерферо-на-у Т-клетками в функциональном тесте осуществляли по способности их супернатанта индуцировать выработку оксида азота миелокариоцитами ин-тактных сингенных животных [18]. Супернатант (‘/3 и V от общего объема) Т-лимфоцитов добавляли в 96-луночные круглодониые планшеты («Costar»), содержащие свежевыделенные клетки костного мозга (по 2-Зх105 в лунке), культивировали 48 ч, собирали супернатант и измеряли в нем количество нитритов при помощи реактива Грейса [7]. Реактив (0,1 мл) смешивали с эквивалентным объемом супернатанта и измеряли абсорбцию при длине волны 550 нм. Концентрацию нитритов определяли по калибровочной кривой, построенной с использованием стандартных растворов нитрита натрия.
Определение продукции интерлейкина-2 (ИЛ-2) Т-лимфоцитами осуществляли в функциональном тесте по способности их супернатанта стимулировать пролиферацию ИЛ-2-зависимых спленоцитов [18]. Для получения ИЛ-2-зависимых спленоцитов клетки селезенки культивировали в концентрации4х106/мл
с конканавалином А (4 мкг/мл) 36 ч, затем отмывали митоген центрифугированием и культивировали 48 ч в круглодонных 96-луночных планшетах (5x10' кл/лун-ку) с различными разведениями исследуемого супернатанта. Затем оценивали пролиферацию клеток радиоизотопным или колориметрическим методом и выражали соответственно в имп/мин или единицах оптической плотности. При использовании радиоизотоп ного метода за 16 ч до окончания культивирования клеток в лунки вносили по 0,5 мкКю/лунку 3Н-тимидина. Затем содержимое лунок
переносили на стекловолокнистые фильтры («Titertek»), промывали изотоническим раствором хлорида натрия, высушивали и переносили в сцинтилляционную жидкость, включение изотопа оценивали на ß-счетчике. Оценку пролиферации колориметрическим методом осуществляли как описано ранее [19]. Клетки культивировали 4 суток в круглодонных 96-луночных планшетах (2-5х104 кл/лун-ку) в указанных выше условиях. За 4 ч до окончания культивирования в лунки вносили 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (МТТ, «Serva»), концентрация которого в лунках составляла 200 мкг/мл. Затем из лунок удаляли надосадок, а осадок растворяли диметилсульфоксидом (димексид, «Татхимфармпрепараты»), Абсорбцию полученных растворов замеряли при помощи многоканального спектрофотометра («Titertek») при длине волны 550 нм.
Определение количества интерлейкина-4 (ИЛ-4) в исследуемых супернатантах осуществляли твердофазным им-муноферментным методом при помощи тест-систем («Amersham Biosciences») согласно прилагаемым протоколам.
Содержание иммуноглобулинов Е в сыворотке крови определяли иммуно-
ферментным методом, для чего животных забивали через 7 дней после последней иммунизации, забирали кровь из сердца, получали сыворотку, разливали на аликвоты и хранили при -20°С. Содержание иммуноглобулинов в сыворотках измеряли с использованием соответствующих тест-систем («Immunology Consultants Lab.», США) согласно прилагаемому протоколу.
Общую анафилаксию моделировали, используя иммунизированных овальбу-мином или лошадиной сывороткой мышей. В ответ на внутривенное введение овальбумина (по 100 мкг в 0,1 мл физиологического раствора хлорида натрия в ретроорбитальный синус) или лошадиной сыворотки (по 0,2 мл неразведенной лошадиной сыворотки в ретроорбитальный синус) у них развивалась анафилактическая реакция. Выделяли следующие степени выраженности:
— 1 (слабая) степень - угнетенное состояние, взъерошенность шерстного покрова,
— 2 (средняя) степень - угнетенное состояние, взъерошенность шерстного покрова, цианоз конечностей, дыхание поверхностное и учащенное, клониче-ские судороги, парезы, параличи,
— 3 (тяжелая) степень - гибель в течение 2-4 ч.
Полученные данные обрабатывали статистически с помощью программного обеспечения Statistica 6.0. Для каждой выборки вычисляли среднее значение величины признака X и ошибку средней величины т. Проверка гипотезы о равенстве средних проводилась с использованием t-критерия Стьюден-та. Вычисленное значение t сравнивали с табличным при заданном уровне значимости р<0,05. Если расчетная t была
больше табличной, то гипотеза о равенстве средних отвергалась.
Результаты
Введение разрешающей дозы антигена животным через 7 дней после однократной иммунизации (табл. 1) вызвало у всех мышей линии ВАЬЬ/с слабую анафилактическую реакцию (1 степень), что проявлялось в изменении поведения животных (они выглядели угнетенными, вялыми, неподвижными). Указанные изменения появлялись через 5-10 минут после внутривенного введения антигена и наблюдались на протяжении 1-2 ч. Введение разрешающей дозы овальбумина мышам линии ВАЬЬ/с через 7 дней после второй иммунизации, проведенной с интервалом 1 неделя, вызывало у большинства животных (у 26 из 27) анафилактическую реакцию 1 степени. Анафилактический шок, вызванный у мышей через 7 дней после второй иммунизации с интервалом 2 недели между инъекци-
ями, был более тяжелый. Все мыши выглядели угнетенными, вялыми, теряли подвилсность, их шерстяной покров был взъерошен, конечности цианозны, дыхание поверхностное и учащенное, развивались параличи конечностей, животные принимали боковое положение через 30-40 минут после инъекции. У небольшого количества животных наблюдались кяонические судороги, 57% (у 42 из 74) животных погибли в течение 2-4 ч. Еще более тяжелым был анафилактический шок у трехкратно иммунизированных мышей. В этом случае смертность составила 93% (54 из 58 животных).
У мышей линии С57В1/6 при тех же режимах иммунизации выраженность анафилактической реакции была слабее. Если у всех мышей линии ВА1,Ь/с после однократной иммунизации реакция была 1 степени, то у 40% животных линии С57В176 ее вообще не было. Отсутствовала реакция и у 37,5% дважды им-
Таблица 1
Выраженность анафилактической реакции у мышей линий ВАЬЬ/с и С57ВУ6, сенсибилизированных одно-, двух- или трехкратным введением овальбумина (7 дней после последней иммунизации)
Линия мышей Выраженность реакции Однократная иммунизация Двукратная иммунизация с интервалом 1 неделя Двукратная иммунизация с интервалом 2 недели Трехкратная иммунизация с интервалом 2 недели
абс. к-во % абс.к-во % абс. к-во % абс. к-во %
ВАШс Всего мышей 15 100,0 27 100,0 74 100,0 58 100,0
нет реакции 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0
1 степень 15 100,0 26 96,3 0 0,0 0 0,0
2 степень 0 0,0 1 3,7 32 43,2 4 6,9
3 степень 0 0,0 0 0,0 42 56,8 54 93,1
С57Виб Всего мышей 15 100,0 24 100,0 69 100,0 51 100,0
нет реакции 6 40,0 9 37,5 0 0,0 0 0,0
1 степень 9 60,0 15 62,5 10 14,5 0 0,0
2 степень 0 0,0 0 0,0 53 76,8 30 58,8
3 степень 0 0,0 0 0,0 6 8,7 21 41,2
Таблица 2
Продукция ИФ-у (концентрация нитритов, мкМ) и ИЛ-2 (включение 3Н-тимидина, имп/мин или оптическая плотность) Т-лимфоцитами селезенки мышей линии ВАЬЬ/с, сенсибилизированных одно-, двух- или трехкратным введением овальбумина с интервалом 2 недели между иммунизациями (Х±ш)
Коли- чество иммуни- заций Сроки после последней иммунизации, дни Разве- дение иссле- дуемого супер- натанта ИФ-у ИЛ-2
контроль опыт контроль ОПЫТ
концен- трация нитритов, мкМ концен- трация нитритов, мкМ % от контроля включение 3Н-тимидина (имп/мин)“ или оптическая плотность6 включение 3Н-тириидина (имп/мин}а или оптическая плотность6 % от контроля
1 7 1/6 1/3 6,1 ±0,8 9,6±1,1 5,8±0,7 8,6+0,8 95,3 89,7 »12600 ±1144 8532 ±1484 *14063+-|210 9246 ± 994 108,4 111,6
14 1/6 1/3 10,1+1,9 16,3+2,9 9,5+1,6 17,2+2,1 94,4 105,5 б0,268 ±0,018 0,397 ±0,018 ”0,236 ±0,015 0,377±0,017 88,2 94,9
2 7 1/6 1/3 15,1 ±0,9 21,5+1,5 10,5±1,3* 16,1+1,0* 69,7 74,9 б0,347 ±0,014 0,439 ±0,017 60,296 ± 0,007’ 0,348 +0,022* 85.3 79.4
14 1/6 1/3 12,2±1,2 20,6±1,4 7,6 ±1,1' 14,9 ±0,8* 62,0 72,4 60,379 ±0,017 0,525 ±0,038 60,267 ± 0,035* 0,393 ±0,019' 70,5 74,8
3 7 1/6 1/3 8,0±0,6 12,7±0,4 <2 3,0 ±0,8* 24,0 »16361 ±2915 23174 ±2490 "5334 ± 1251* 12701+1751* 32,6 54,8
14 1/6 1/3 12,3+0,8 17,9±1,8 <2 6,4+1,2* 35,7 60,282 ±0,010 0,396 ±0,033 б0,17 ±0,016* 0,243 ±0,005* 60,6 61,5
Примечание: * - различия с контролем достоверны (р<0,05), п=6
мунизированных мышей линии С57ВЬ/6 (интервал между иммунизациями 1 неделя), в то время как у всех мышей линии ВАЬЬ/с при аналогичной схеме иммунизации реакция была. У значительной части (76,8%) двукратно иммунизированных животных линии С57ВЬ/6 (интервал между инъекциями овальбумина 2 недели) наблюдался анафилактический шок средней степени, и только 8,7% мышей погибли (среди мышей линии ВАЬЬ/с смертность составила 56,8%). Среди трижды иммунизированных мышей ли-
нии С57ВЬ/6 смертность от шока составила 41,2%, а у аналогично подготовленных мышей линии ВАЬЬ/с - 93,1%.
Результаты исследования продукции основных цитокинов ТЫ-профиля представлены в табл. 2. После однократной иммунизации овальбумином с гидроокисью алюминия мышей линии ВАЬЬ/с как через 7, так и через 14 дней после введения достоверных изменений в количестве продуцируемого интерферона-^ (ИФ-у) и ИЛ-2 не наблюдалось. Двукратная иммунизация овальбумином приводила к сни-
Таблица 3
Продукция ИЛ-4 Т-лимфоцитами селезенки трижды иммунизированных овальбумином мышей линии ВА1.Ь/с (7 дней после последней инъекции) (Х±ш)
Контроль (интактные животные) Опыт (иммунизированные животные)
концентрация ИЛ-4 (пг/мл) концентрация ИЛ-4, пг/мл % от контроля
163,1 ±14,0 282,7±18,6* 173,3
Примечание: * - различия с контролем достоверны (р<0,05), п=6
Таблица 4
Содержание иммуноглобулинов класса Е (1|?Е) в сыворотке крови иммунизированных овальбумином мышей линии ВАЬЬ/с (Х±ш)
Количество иммунизаций Содержание ІдЕ, мкг/мл
- (контроль) 2,74±0,46
1 4,90±0,64‘
2 7,36+0,81*
Примечание: *- различия с контролем достоверны, р<0,05, п=6
жению выработки ИФ-у: через
7 дней после второй иммунизации до 69,7% и 74,9% от контроля при разведениях исследуемого супернатанта '/, и Ч6 (р<0,05) и через 14 дней после второго введения овальбумина
- до 62,0% и 72,4% от контроля при разведениях исследуемого супернатанта ‘/3 и '/ (р<0,05). Так же достоверно (р<0,05) снижалась продукция ИЛ-2: до 85,3% и 79,4% от контрольного уровня через 7 дней после последней инъекции: до 70,5% и 74,8% от контроля через 14 дней. Через 7 дней после третьей иммунизации при использовании супернатанта в разведении '/ уровень нитритов был не детектабелен, что свидетельствовало о незначительном содержании в супернатанте ИФ-у. При разведении '/, некоторое количество данного цито-кина определялось и составляло 24% от контроля (р<0,05). В эти же сроки (7 дней после третьей иммунизации) наблюдалось падение выработки И Л-2: до 32,6% и 54,8% от контрольных
значений (в разведенияхсупернатанта ‘/6 и '/3 соответственно; р<0,05). Через
14 дней после третьей сенсибилизи-
Таблица 5
Продукция ИФ-у (концентрация нитритов, мкМ) и ИЛ-2 (включение ’Н-тимидина, имп/мин) Т-лимфоцигами селезенки мышей линии ВАЬЬ/с, сенсибилизированных лошадиной сывороткой (Х+гп)
Количество иммуни- заций Сроки после последней иммунизации ИФ-у ИЛ-2
контроль опыт контроль опыт
концентрация нитритов, мкМ концен- трация нитритов, мкМ % от контроля включение 3Н-тимидина, имл/мин включение 3Н-тимидина, имп/мин %от кон- троля
1 7 13,8±1,0 15,1 ±0,7 109,2 20956±1194 2061211271 98,4
5 3 12,5±0,8 5,2±0,8* 41,8 16878±1545 6710±1069* 39,8
7 15,8+0,6 5,7±0,7* 35,8 14649±1779 7298±402* 49,8
Примечание: * - различие с контролем достоверны (р<0,05), п=6; разведение исследуемого супернатанта составляло ;/3
Смертность мышей линии ВАЬЬ/с, иммунизированных лошадиной сывороткой (пятикратное введение) или овадьбумином (двукратное введение), в результате анафилактического шока, вызванного через 7 дней после последней иммунизации
Серия эксперимента Количество животных Доля погибших мышеи, % от контроля
всего погибших
Иммунизация лошадиной сывороткой
1 12 2 17
2 12 5 42
3 10 5 50
4 11 10 91
5 12 12 100
Иммунизация овальбумином
1 9 3 33
2 10 4 40
3 10 5 50
4 10 5 50
5 12 7 58
Примечание: все эксперименты были проведены в осенне-зимний период в разные годы
рующей инъекции супернатант в разведении '/6 не стимулировал продукцию оксида азота, что говорит о незначительном
содержании в нем ИФ-у. При разведении 1/, ИФ-у определялся, его количество составляло 35,7% от контрольного уровня (р<0,05). В эти же сроки содержание ИЛ-2 составляло около 60% от контрольных значений в обоих разведениях супернатанта (р<0,05).
Определение содержания ИЛ-4 в супернатантах, полученных от трижды иммунизированных мышей линии ВАЬЬ/с (7 дней после последнего введения оваль-бумина), показало (табл. 3) значительное увеличение содержания данного цито-кина - 173% от контрольного уровня.
Содержание иммуноглобулинов класса Е в сыворотке крови мышей линии ВАЬЬ/с, иммунизированных овальбумином, закономерно увеличивалось (табл. 4). Так, у однократно иммунизированных животных
его количество в 1,8 раза превышало контрольный уровень, у двукратно иммунизированных содержание иммуноглобулинов Е в 2,7 раза превосходило показатели интактных мышей.
Многократные сенсибилизирующие введения лошадиной сыворотки мышам линии ВАЬЬ/с приводили к снижению продукции Т-лимфоцитами селезенки цитокинов ТЫ профиля (табл. 5). При этом показатели, полученные через 3 и 7 дней после последней иммунизации, мало различались между собой: снижение вырабатываемого лимфоцитами ИФ-у составляло 41,8% и 35,8% от контроля (3 и 7 сутки соответственно), а уровень ИЛ-2 достигал 39,8% и 49,8% от контроля (3 и 7 сутки соответственно). Однократная инъекция лошадиной сыворотки не вызывала какого-либо изменения в количестве вырабатываемых
Т-лимфоцитами исследуемых цитоки-нов.
Смертность мышей линии ВАЬЬ/с от анафилактического шока при пятикратном введении лошадиной сыворотки составляла в разных серия 17, 42, 50, 91, 100%, что сопоставимо с показателями в группах двукратно иммунизированных овальбумином мышей с интервалом между иммунизациями 2 недели - 33, 40, 50, 50, 58% (в таблице 6 приведены результаты 5 серий экспериментов для каждой из сенсибилизирующих схем). Доля животных, погибших после введения разрешающей дозы лошадиной сыворотки, колебалась от 17% до 100% в зависимости от серии экспериментов, в то время как процент смертности среди мышей, получавших овальбумин, находился в диапазоне 33-58%.
Обсуждение результатов
Анафилаксия представляет собой одну из типичных иммунологических реакций, обусловленных поляризацией 2 типа. В качестве стандартного антигена, вызывающего данный вид поляризации, общепринятым является овальбумин, который используется чаще всего с гидроокисью алюминия в качестве адъюванта [23]. В своей работе мы сравнили тяжесть анафилактического шока, вызванного у мышей линии ВАЬЬ/с, после одно-, двух- и трехкратной иммунизации (табл. 1). Кроме того, сравнили выраженность реакции при разных схемах в случае двукратной иммунизации: одна из них проводилась с интервалом 1 неделя между инъекциями, а другая - с двухнедельным интервалом. Оказалось, что анафилактический шок происходил даже после однократного введения овальбумина, однако при увеличении количества сенсибилизирующих инъ-
екций тяжесть шока нарастала, достигая максимальных значений у трехкратно иммунизированных животных - 93% погибших мышей. Интересно, что выраженность анафилактического шока у двукратно иммунизированных животных значительно зависела от интервала между сенсибилизирующими введениями овальбумина: практически все мыши (96%), иммунизированные с однонедельным интервалом, имели 1 степень тяжести шока, в то время как животные, иммунизированные с интервалом 2 недели, проявляли вторую (43%) и третью (57%) степень тяжести. Если при первой схеме гибели не наблюдалось, то при удлиненном интервале между инъекциями от шока погибали около половины мышей. Полученные результаты позволяют заключить, что оптимальной схемой подготовки животных к анафилактическому шоку является двух- или трехкратные иммунизации с интервалом 2 недели между инъекциями. Причем, двукратная схема пригодна для выявления веществ, способных как повышать, так и снижать выраженность '1Ь2-зависимого иммунного ответа. Трехкратная схема, на наш взгляд, лучше соответствует цели выявить вещества с противоаллергическим действием.
Хорошо известно, что направление поляризации может зависеть не только от антигена, способа его попадания в организм, но и от генотипа. Показано, что линии мышей В10Л>2, С57ВЬ/6 и ВАЬЬ/с в ответ на один и тот же стимул развивают разные типы иммунного ответа: В Ю.Б2 и С57В176 склонны развивать ТЬ1-зависимый клеточный ответ, связанный с высоким уровнем ИФ-у, низким ИЛ-4, в то время как ВАЬЬ/с - ТИ2-зависимый с высокой продукцией ИЛ-4 и низкой секрецией ИФ-у [8, 9, 14]. Нам было интересно, возможно ли вызвать системную
анафилаксию у мышей линии С57ВЬ/6, а также сравнить степень тяжести анафилактического шока у животных линий С57ВЬ/6 и ВАЬЬ/с (табл. 1). У почти половины (40%) однократно иммунизированных мышей линии С57ВЬ/6, в отличие от ВАЬЬ/с, анафилактическая реакция не выявлялась. У 63% двукратно сенсибилизированных мышей линии С57ВЬ/6 реакция была 1 степени, в то время как почти у всех (96%) мышей линии ВАЬЬ/с эта степень наблюдалась. Также значительно слабее реагировали мыши С57ВЬ/6 на разрешающее введение антигена при двукратной схеме иммунизации с двухнедельным интервалом - только 8,7% из них погибли (по сравнению с 56,8% животных ВАЬЬ/с). Также вдвое меньше погибли мышей линии С57ВЬ/6, иммунизированных трижды - 41,2%, в то время как почти все мыши линии ВАЬЬ/с при данной схеме иммунизации погибали. Таким образом, можно заключить, что системную анафилаксию можно вызвать у мышей линии С57ВЬ/6, имеющих склонность развивать ТЫ-зависимый иммунный ответ, однако для достижения степени тяжести, аналогичной наблюдаемой у линии мышей ВАЬЬ/с, требуется большее количество сенсибилизирующих инъекций овальбумина. Как и для мышей линии ВАЬЬ/с, оптимальным режимом иммунизации для мышей линии С57ВЬ/6 является двухнедельный интервал между повторными введениями антигена (овальбумина).
Как было сказано выше, развитие анафилаксии связано с ТЬ2-типом поляризации иммунного ответа, для которого характерно снижение уровня цитокинов ТЫ-профиля (прежде всего, ИФ-у) и увеличение выработки Т-лимфоцитами цитокинов '1112-типа (ИЛ-4), а также гиперпродукция иммуноглобулинов класса Е.
Однократная иммунизация мышей линии ВАЬЬ/с вызывала значительное увеличение концентрации иммуноглобулинов класса Е в сыворотке крови (табл. 4), при этом продукция ИФ-у и ИЛ-2 не изменялась (табл. 2). Двукратная иммунизация вызывала снижение выработки Т-лимфоцигами данных цитокинов, при этом концентрация иммуноглобулинов класса Е в сыворотке крови еще больше повышалась. При трехкратной иммунизации происходило значительное подавление продукции лимфоцитами цитокинов ТЫ-профиля (ИФ-у и ИЛ-2) и повышение выработки основного ТЬ2-цитокина - ИЛ-4 (табл. 3). Эти данные свидетельствуют о том, что при введении мышам линии ВАЬЬ/с овальбумина по выбранной нами схеме баланс ТЫ/7Ъ2 сдвигается в сторону ТЬ2 с развитием поляризации ТЬ2-типа.
Известно, что парентеральное введение мышам лошадиной сыворотки приводит к анафилаксии |1]. Мы оценили признаки ТЬ2-зависимого иммунного ответа (по продукции ИФ-у и ИЛ-2) при иммунизации мышей линии ВАЬЬ/с лошадиной сывороткой по схеме, рекомендованной вышеуказанными авторами. Как и в случае с овальбумином, однократное введение лошадиной сыворотки не вызывало изменений продукции цитокинов ТЫ-профиля (табл. 5). Пятикратная иммунизация с интервалом 4 дня приводила к значительному снижению уровня продукции данных цитокинов, по выраженности снижения сопоставимого с трехкратной иммунизацией овальбумином. Снижение продукции ИФ-у и ИЛ-2 лимфоцитами селезенок при многократном введении лошадиной сыворотки следует рассматривать как свидетельство активации иммунной системы, происходящей по второму типу
поляризации (1Ъ2), для которого характерно понижение продукции этих цито-шнов {20].
Подтверждением того, что при многократных инъекциях лошадиной сыворотки развивается ТЬ2-зависимый иммунный ответ, служат и данные анафилактического шока, наблюдавшегося после внутривенного введения лошадиной сыворотки иммунизированным животным (табл. 6). Количество погибших в результате анафилактического шока мышей колебалось от 17% до 100% в зависимости от серии эксперимента. Доля погибших животных при использовании для их иммунизации овальбумина также колебалась в разных сериях, но диапазон все же был гораздо уже, чем при иммунизации мышей лошадиной сывороткой. Поскольку все представленные серии проведены в аналогичное время года с использованием генетически контролируемых животных, то единственной причиной такого значительного разброса данных является качество самого антигена (лошадиной сыворотки), использованного для индукции системной анафилаксии. Экспериментаторы, имеющие дело с сывороткой, полученной из крови животных, и использующие ее для содержания клеточных культур, знают, что каждая партия сыворотки (причем любого производителя) может сильно отличаться от предыдущей. Поэтому каждую партию тестируют на клеточных культурах.
Следует заметить, что пятикратная иммунизация лошадиной сывороткой и двукратная овальбумином вызывают в среднем гибель половины животных от анафилактического шока. Хорошо известно, что стресс лабораторных животных, вызванный экспериментальными
манипуляциями, может в значительной мере влиять на результаты эксперимента. Поэтому задачей экспериментатора является снижение до минимума стрес-сорных влияний. С такой точки зрения двукратные инъекции предпочтительней пятикратных. Приведенные нами данные показывают, что иммунологические характеристики системной анафилаксии, вызванной лошадиной сывороткой или овальбумином, свидетельствуют об аналогичном типе поляризации. При этом воспроизводимость результатов в случае овальбумина несравнимо выше, чем при использовании лошадиной сыворотки.
Выводы
1. Двукратная и трехкратная иммунизация овальбумином мышей линии ВАТ,Ь/с с интервалом 2 недели между инъекциями позволяет получить модель системной анафилаксии с выраженным сдвигом баланса цитокинов ТЫ/ТЬ2 в сторону ТЬ2 и гиперпродукцией иммуноглобулинов класса Е.
2. Использование лошадиной сыворотки для моделирования системной анафилаксии на мышах линии ВАТ,Ь/с вызывает развитие 'Независимого иммунного ответа, однако воспроизводимость результатов анафилактического шока значительно уступает модели, использующей овальбумин в качестве антигена.
3. Индукция системной анафилаксии с использованием мышей линии ВАТ,Ь/с и овальбумина является добротной, адекватной и экономичной биологической моделью для исследования аллергических (иммуноглобулин-Е-зависимых) заболеваний.
Список литературы
1. Емепьяненко И. Н., Душкин В. А. Характеристика общей анафилаксии // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1971. N«10. С. 69-71.
2. Руководство по экспериментальному доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (под ред. Р.У. Хабрие ва). М.:ОАО Изд-во Медицина, 2005. С. 494-495.
3. Хаитов Р. М., Пинегин Б. В. Иммуномодуляторы: механизм действия и клиническое применение // Иммунология. 2003. №4, С. 196-203.
4. Энциклопедия лекарств № 11. М.: Изд-во ООО РЛС-2004, 2004. С. 1086-1088.
5. Abbas А. К., Murphy К. М., Sher А. Functional diversity of helper T lymphocytes // Nature. 1996. Vol.383. P. 787-793.
6. Calder V. L. Cellular mechanisms of chronic cell-mediated allergic conjunctivitis // Clinical 8c Experimental Allergy. 2002. Vol.32, № 6. P. 814-817.
7. Green L. C., Wagner D. A., Glogowski J. et al. Analysis of nitrate, nitrite and [15N] nitrate in biological fl uids // Anal. Biochem. 1982. Vol. 126. P. 131-143.
8. Heinzel F .P., Sadick M. D., Holaday B. /. et al. Reciprocal expression of interferon gamma or interleukin 4 during the resolution or progression of murine leishmaniasis. Evidence for expansion of distinct helper T cell subsets // J. Exp. Med. 1989. Vol. 169. P. 59-72.
9. Hsieh C. S., Macatonia S. E., O’Garra A., Murphy К. М. T cell genetic background determines default T helper phenotype development in vitro // J. Exp. Med. 1995. Vol. 181. P. 713-721.
10. http://www.unrussia.ru/institutions/ who.html.
11. Khoury S. J., Hancock W. W., Weiner H. L Oral tolerance to myelin basic protein and natural recovery from experimental autoimmune encephalomyelitis are associated with down regulation of infl ammatory cytokines and differential upregulation of transforming growth factor beta, interleukin 4, and prostaglandin Eexpression in the brain // J. Exp. Med. 1992. Vol.176, №5. P. 1355-1364.
12. Krug N., Frew A. J. The Th 2 cell in asthma: initial expectation yet to be realized 11 Clin. Exp. Allergy. 1997. Vol.27. P. 142-148.
13. Le Gros G., Ben Sasson S. Z., Seder R. et al. Generation of IL-4-producing cells in vivo and in vitro: IL 2 and IL-4 are required for the in vitro generation of IL-4 producing cells II J. Exp. Med. 1990. Vol. 172. P. 921-924.
14. LocksleyR. M„ Heinzel F. P., Holaday B.J. et al. Induction of Till and Th2CD4+ subsets during murine Leishmania major infection // Res. Immunol. 1991. Vol.142. P. 28-32.
15. Mackay I. R., Rosen F. S. Allergy and allergic diseases //N. Engl. J. Med. 2001. Vol.344, №1. P. 30-37.
16. Maeda H., Shiraishi A. TGF-beta contributes to the shift toward Th 2-type responses through direct and IL 10-mediated pathways in tumor-bearing mice // J. Immunology. 1996. Vol. 156, №1. P. 73-78.
17. Mason D., Powrie F. Control of immune pathology by regulatory T cells II Curr. Opin. Immunol. 1998. Vol.10. P. 649-655.
18. Moore S. C., 'Ill eus S. A., Barnett J. B., Soderberg L. S. F. Cytokine regulation of bone marrow natural suppressor cell activity in the suppression of lymphocyte function // Cell. Immunol. 1992. Vol. 141. P. 398-408.
19. Mosmann T. R. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol. Methods. 1983. Vol.65. P. 55-63.
20. Mosmann T. R., CherwinskiH., BondM. W. et al. Two types of murine helper T cell clone I. Definition according to profi les of lymphokine activities and secreted proteins // j. Immunol 1986. Vol. 136, №7. P. 2348-2357.
21. Nomura I., Goleva /:., Howell M. D et al. Cytokine milieu of atopic dermatitis, as compared to psoriasis, skin prevents induction of innate immune response genes // J. Immunol. 2003. Vol. 171. P. 3262-3269.
22. O’Garra A. Cytokines induce the development of functionally heterogeneous T helper cell subsets // Immunity 1998. Vol.8. P. 275-283.
23. Oshiba A., Hamelrnann E., Haczku A. et al. Modulation of antigen-induced B and T cell
responses by antigen-specifi c IgE antibodies // J. Immunol. 1997. Vol. 159. P. 4056-4063.
24. Pakala S. V., Kurrer M.O., Katz J. D. T helper 2 (Hi 2) cells induce acute pancreatitis amd diabetes in immunc-compromised nonobese diabetic (NOD) mice // J. Exp. Med. 1997.Vol.lB6. P. 299-306.
25. Postlethwaite A. E., Holness M. A., Ka-tai H., Raghow R. Human fi. broblasts synthesize elevated levels of extracellular matrix proteins in response to interleukin-4 // J. Clin. Invest. 1992. Vol.90. P. 1479-1482.
26. Romagnani S. Human TH1 and TH2 subsets: doubt no more // Immunol. Today. 1991. Vol.12. P. 256-260.
27. Seder R. A., Gazzinelli R., Sher A., Paul W. E. 11,-12 acts directly on CD4+ T cells to enhance priming for IFN-y production and
diminishes IL-4 inhibition of such priming // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1993. Vol.90. P. 10188-10192.
28. Sornasse T., Larenas P. V, Davis K. A. et al. Diff erentiation and stability of T helper 1 and 2 cells derived from naive human neonatal CD4 h T cells, analyzed at the single-cell level // J. Exp. Med. 1996. Vol. 184. P. 473-478.
29. Steliarova-FoucherE.,StillerC.,KaatschP. et al. Geographical patterns and time trends of cancer incidence and survival among children and adolescents in Europe since the 1970s (the ACCIS project): an epidemiological study // Lancet 2004. Vol.364. P. 2097-2105.
30. Williamson E., Garside P., Bradley J. A. IL-12 is a central mediator of acute graft-versushost disease in mice 11 J. Immunol. 1996. Vol. 157, № 2. P. 689-699.
Modelling of an anaphylaxis using BALb/c mice
N. V. Belska, M. G. Danilets, Y. P. Belsky, E. S. Trophimova, E. G. Utchasova, O. S. Borsuk,
V. I. Agaphonov
The aim of the research was to substantiate a possibility and to demonstrate an advantage of an anaphylaxis model using mice BALb/c and ovalbumin as antigen. Study had been carried out with mice BALb/c for comparison mice C57BL/6. Various procedures and plans of immunization by ovalbumin had been used; also, extent of anaphylactic shock weight had been evaluated in dependence of mice strains and immunization procedure. 'Ihl/Th2 cytokine production by spleen-derived T cells and immurioglobuiin E content in serum blood had been measured. It had been shown, that repeatability data of anaphylactic shock induced by a horse serum were lower than ones induced by ovalbumin. Authors concluded, that model of anaphylaxis in mice BALb/c induced by ovalbumin is a good, adequate and economical biological model for an investigation of allergic immunoglobulin E-dependent diseases.
Key words: anaphylaxis; Till and Th2 cytokines; immunoglobulin E.
