CC BY
35
Безопасность гриппозных вакцин: примесный белок в живой вакцине и иммунный ответ на него у привитых лиц
О.К. Кузнецов1, Э.П. Корнеева1, Л.А. Степанова1 (stepanoval60@mail.ru), О.В. Гашинская1, А.В. Коротков1, Г.Ф. Шпилюк2, М.В. Дулатова2
1ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития России, Санкт-Петербург (office@influenza.spb.ru)
2ФГУП «Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов» ФМБА России
Резюме
Препараты интраназальной живой гриппозной вакцины (ЖГВ), изготовленные в разные годы в РФ (1992 - 2010), впервые охарактеризованы по содержанию примесного овальбумина (ОА). В ЖГВ выявлены большие количества ОА - от 200 до 1140 мкг/мл, что в 100 - 1000 раз и более превышает показатели предельного содержания ОА в парентеральных инактивированных гриппозных вакцинах. При этом максимальное количество гете-рологичного для человека белка обнаружено не только в давно изготовленных препаратах (1992 г.), но и в сериях ЖГВ, выпущенных недавно (2007, 2010 гг.). В клинических исследованиях в сыворотках крови лиц, иммунизированных интраназально двухкратно моновалентной ЖГВ Инфлювир (ОА - 380 мкг/мл), выявлен почти трехкратный прирост антител IgG к ОА и четырехкратный прирост антител к другим белкам куриного эмбриона. При этом препарат был полностью ареактогенным. Формирование бесполезных для организма вакцинируемых антител (IgG) к ОА с научных позиций следует рассматривать как вид побочного иммунного действия вакцины, не связанного с каким-либо поствакцинальным осложнением. Авторы, исходя из результатов собственных исследований и данных литературы, предлагают безотлагательно внедрить в производство ЖГВ измененную технологию, обеспечивающую достаточную очистку вакцины от примесного яичного белка.
Ключевые слова: живая гриппозная вакцина, примесный яичный белок, иммунный ответ у привитых, безопасность гриппозных вакцин
Safety of Influenza Vaccines: Impurity Protein in the Live Vaccine and Immune Response in Vaccinated Persons
O.K. Kuznetsov1, E.P. Korneeva1,
L.A. Stepanova1 (stepanoval60@mail.ru), O.V. Gashinskaya1, A.V. Korotkov1, G.F. Shpiluk2, M.V. Dulatova2 1Research Institute of Influenza, St. Petersburg (office@influenza.spb.ru)
2Research Institute of Vaccine and Serum and Enterprise for the Production of Bacterial Preparations, St. Petersburg Abstract
The lots of the live influenza vaccines (LIV), prepared in different years (1992 - 2010) in Russian Federation, were tested on content of impurity ovalbumin (OA). A large amount of OA (from 200 to 1400 yg/ml) were detected in LIVs. These values in 100 -1000 times exceeded the limit content of OA in parenteral inactivated influenza vaccines. In addition, maximal amounts of the foreign for human OA were detected not only in preparations, manufactured long ago (1992), but also in lots of LIVs, produced recently (2007,2010). It was shown 3-fold increase of antibodies to other proteins of chicken embryo in clinical trials of volunteers vaccinated intranasal 2-fold of monovalent LIV Influvir (OA - 380 yg/ml). Meanwhile the LIV was fully areactogenic. The formation of useless for organism antibodies (IgG) to OA from scientific point of view should be considered as a kind of side action of vaccine which is not connected with some postvaccinal complication. On the basis of their own results and literary information authors suggest to introduce in LIVs production the modified technology, providing the sufficient purification of vaccines from impurity egg proteins.
Key words: live influenza vaccine, impurity egg protein, immune response in vaccinated, safety of influenza vaccines
Введение
Профилактика гриппа с помощью живой вакцины считается многими исследователями, в том числе и авторами данной статьи, наиболее эффективной мерой борьбы с данным заболеванием. При интраназальной иммунизации этой вакциной, как и при естественной инфекции, у людей появляется перекрестная устойчивость к гриппу, обусловленная как кратковременной эффективной защитой от гомологичного вируса, так и частичной защитой, сохраняющейся несколько лет, от антигенно родственных его вариантов. Локальный иммунитет,
создаваемый живой гриппозной вакциной (ЖГВ) в верхних дыхательных путях, являющихся не только входными воротами вируса, но и основным местом его размножения (колонизации), обеспечивает - в отличие от инъекционных убитых гриппозных вакцин - защиту от гриппа на первом рубеже инфекции [9 - 10, 14, 15].
Положительным фактом считается и то, что вакцинный вирус передается непривитым лицам, находящимся в контакте с привитыми. В результате происходит проэпидемичивание окружающих людей вакцинным вирусом, приводящее в конечном
итоге к увеличению эффективности вакцинации. Полагают, что реактивации вакцинного вируса при этом не происходит, но, по сути, эту проблему по-настоящему глубоко не изучали.
Вместе с тем ЖГВ, являясь оптимальным препаратом для массовой профилактики гриппа, имеет ряд существенных недостатков по сравнению с инъекционными инактивированными гриппозными вакцинами (ИГВ). К недостаткам ЖГВ относятся: низкая степень очистки и большое количество противопоказаний к применению, невозможность использования для защиты самых младших возрастных групп населения (до 3-х лет) и, кроме того, низкая приживляемость вакцинных вирусов в носоглотке. Эффективность ЖГВ максимальна у детей до 10 лет и недостаточно высока у взрослых, особенно у пожилых лиц. Чем выше исходный иммунитет к гриппу у вакцинируемых, тем слабее будет репродукция вируса и, следовательно, тем ниже индуцируемый иммунитет и эффективность вакцинации [10, 15]. Для повышения иммуногенности вакцину насыщают громадным количеством вируса. Количество живого вакцинного вируса в ЖГВ превышает в 10 тысяч раз и более аналогичные показатели специфической активности вирусов в живых вакцинах, например, против таких респираторных инфекций, как корь, паротит и краснуха. Кроме того, при высоких показателях специфической активности ЖГВ (в 2010 г. не менее 1069 эмбриональных инфекционных доз для типа А и 1065 - для типа В) количество термоинактивированного (убитого) вируса в препаратах ЖГВ намного больше, чем живого вируса. По расчетам, убитый вирус составляет около 90% от всех вирусных частиц в препарате, то есть примерно 108 в дозе вакцины. Следовательно, в иммуногенной активности ЖГВ и ее защитной эффективности наверняка принимают участие и живой вирус, и антигены вируса, термоинактивированного в процессе изготовления вакцины.
К недостаткам ЖГВ следует причислить и высокую вероятность ее контаминации латентным эндогенным вирусом лейкоза птиц. Этот вирус не патогенен для кур и людей.
Из перечисленных недостатков и особенностей живой вакцины авторы статьи в своих исследованиях ограничились только рассмотрением безопасности ее применения, конкретно связанной с высоким содержанием примесного яичного белка в препаратах. ЖГВ представляет собой лиофи-лизат цельной или частично разведенной вируссо-держащей аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, предварительно осветленной физическими методами. Содержание примесного куриного белка в препарате фармстатьей не регламентируется. По расчетам, следует ожидать, что в аллантоисной вакцине может быть до 1 мг/мл примесного белка, представленного в основном (54%) овальбуми-ном (ОА). Остальная часть белковой фракции примеси может содержать кональбумин или овотранс-феррин (12%), овомукоид (11%) и лизоцим (3,5%).
Наиболее выраженными аллергенными свойствами обладают ОА и овомукоид [1, 3, 20].
В доступной литературе нет ответа на вопросы о количестве ОА в различных партиях ЖГВ и об иммунном ответе (^0) привитых лиц на примесный антиген. Следует отметить, однако, что о степени аллергизации организма после вакцинации обычно судят по превышению нормальных уровней общих сывороточных ^Б и появлению в сыворотке крови специфических ^Б. В фундаментальных исследованиях, выполненных в НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН в течение 2004 - 2007 годов под руководством профессора А.Н. Найхина [16 - 19], при анализе общих и специфических сывороточных ^Б установлено, что однократная иммунизация людей ЖГВ не приводит к аллергизации вакцинируемых. Тем не менее, как бы ни был оптимистичен этот вывод, можно ожидать наверняка, что высокое содержание балластного антигена(ов) в ЖГВ небезразлично для иммунной системы человека. Особую настороженность должны вызывать повторяющиеся иммунизации одних и тех же лиц (проведенные, естественно, с благими намерениями) не только гриппозными (ЖГВ, ИГВ), но и другими вакцинами, содержащими куриный белок. Имеется в виду синергизм их побочного действия. Если учесть общепризнанный факт, что массовая многолетняя неоднократная иммунизация населения разными вакцинами в рамках Национального календаря прививок и по эпидемическим показаниям - это основной фактор аллергизации, главным образом детей, то вряд ли ЖГВ является исключением из ряда других вакцин, вносящих свою лепту в суммарный эффект побочного действия всей вакцинации.
Исходя из представленных сведений, актуально проведение исследований, направленных на получение и анализ новых данных о содержании примеси куриного белка в ЖГВ и об иммунном ответе (^0) привитых лиц на примесный белок. В данной статье впервые охарактеризованы отечественные препараты ЖГВ, изготовленные в разные годы, по содержанию в них примесного ОА и дана оценка уровня гуморального иммунного ответа (^0) к куриному белку на введение ЖГВ в клинических испытаниях. Обоснована целесообразность производственного усовершенствования ЖГВ путем минимизации содержания в ней указанной примеси.
Материалы и методы
В качестве антигенов использовали: ОА в виде порошка производства Бегов О^аглсв, США (код 400450500), аллантоисную жидкость (АЖ) 13 - 14-дневных незараженных куриных эмбрионов и куриный эмбриональный белок (КЭБ), представляющий собой водно-солевой осветленный экстракт гомогената кожно-мышечных тканей незара-женных куриных эмбрионов. Иммунизировали бе-
лых нелинейных мышей-самцов массой 12 - 16 г и кроликов-самок породы «шиншилла» массой 2,5 - 3 кг. Использовали сыворотки крови: гипериммунные кроличьи сыворотки против антигенов ОА, АЖ и КЭБ; сыворотки крови людей, полученные до и после иммунизации гриппозными вакцинами.
Гриппозные и другие вакцины, содержащие куриный белок, получены из музея лаборатории гриппозных вакцин НИИ гриппа. Количественное определение содержания ОА в гриппозных вакцинах осуществляли двумя методами. Первый - им-муноферментный анализ (ИФА), который проводили с использованием тест-системы (фирма Alpha Diagnostic International, США) «Chicken egg ovalbumin ELISA» согласно прилагаемой инструкции; второй - реакция непрямой гемагглютина-ции (РНГА), реализуемая в соответствии с МУК 3.3.2.1758-03 «Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа с целью установления их эффективности и безопасности».
Количественную оценку содержания сывороточных (IgG) и секреторных антител (sIgA-AT) у мышей, иммунизированных АЖ и ЖГВ, определяли общепринятым методом - реакцией торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА) спустя две недели после окончания цикла иммунизации.
Определение содержания антител (IgG) в сыворотках крови людей, вакцинированных различными препаратами ЖГВ (аллантоисная, культураль-ная), проводили в РТНГА спустя три недели после окончания иммунизации. Использовали параллельные (остаточные) образцы сывороток крови волонтеров, вакцинированных согласно соответствующим Протоколам разрешенных клинических исследований, одобренных национальным и локальным комитетами по этике. Ниже приведены основные необходимые сведения, предоставленные главным исследователем М.К. Ерофеевой, о процедуре клинических испытаний, в ходе которых были получены и переданы нам образцы сывороток крови людей для оценки иммунного ответа на примесный куриный белок (ОА, КЭБ), содержащийся в ЖГВ. Материалами для иммунизации волонтеров служили:
• ЖГВ Инфлювир - моновакцина А(И1И1) (пандемическая) аллантоисная производства ФГУП «НПО «Микроген»;
• ЖГВ-НР (GHB-C302) - нерепликативная моновакцина А(И5И1) культуральная, изготовленная в опытно-промышленных условиях на предприятии «Хеноген АГ», Бельгия (негативный контроль);
• плацебо - апирогенный, стерильный физиологический раствор натрия хлорида.
Живые вакцины вводили интраназально двукратно с интервалом в три (ЖГВ) и четыре (ЖГВ-НР) недели согласно инструкциям по при-
менению. К вакцинации были допущены практически здоровые люди в возрасте 18 - 60 лет. Критерии исключения из исследования: аллергические реакции на куриный белок или предшествующую гриппозную прививку, хронический ринит, острые инфекционные и неинфекционные заболевания, беременность или период лактации.
Обработку полученных результатов проводили с расчетом стандартных иммунологических показателей: частоты сероконверсий анти-ОА у лиц с разными исходными уровнями титров АТ, отрицательных логарифмов среднегеометрических титров АТ до вакцинации (СГТ-1) и после вакцинации (СГТ-2), кратности и индекса прироста АТ.
Результаты и обсуждение
Содержание ОА в различных гриппозных и других коммерческих яичных вакцинах
Результаты определения содержания ОА в препаратах ЖГВ, изготовленных с 1992 по 2010 год разными производителями, представлены в таблице 1. Все исследованные препараты хранили до момента их анализа согласно инструкциям по применению. Как оказалось, лиофилизированный антиген ОА в препаратах ЖГВ сохраняется в заданных условиях много лет и успешно выявляется применяемыми методами ИФА и РНГА, рекомендованными ГИСК им. Л.А. Тарасевича для количественного определения примесного ОА в препаратах ИГВ. При этом наличие в вакцинах стабилизаторов (гидролизаты белков) не мешает определению ОА указанными методами.
Как видно из представленных данных, показатели содержания ОА в ЖГВ очень высокие - от 200 до 1140 мкг/мл. Большое количество ОА выявляли в «старых» препаратах ЖГВ, изготовленных еще в 1992 году в виде моновакцин на Одесском предприятии Минмедбиопрома. Гораздо меньшими эти показатели были в ряде препаратов ЖГВ производства «Микроген», приготовленных в разные годы в виде трехкомпонентных вакцин для профилактики сезонного гриппа (2006, 2008, 2009 гг.) и моновалентной вакцины для профилактики объявленной ВОЗ «пандемии» (2009). Однако в 2005 и опять в 2009 году были изготовлены препараты трехкомпонентной ЖГВ с содержанием ОА в количестве 570 мкг/мл, а в 2007 и 2010 годах - соответственно 1020 и 1130 мкг/мл. Выраженная нестандартность современных препаратов ЖГВ, по нашему мнению, обусловлена не степенью очистки вакцины от балластных белков, а степенью разведения вируссодержащей аллантоисной жидкости с разным исходным уровнем урожая вакцинного вируса на куриных эмбрионах. То есть чем выше выход биомассы вакцинного вируса на производственном участке, тем больше можно добавить разбавителя для получения полуфабриката вакцины и в конечном итоге - тем меньше будет балластного белка в производственной серии препарата.
Таблица 1.
Количество ОА в препаратахЖГВ, изготовленных с 1992 по 2009 год разными производителями
препарат, серия производитель Количество оА в мкг/мл по данным:
ИфА рнга
ЖГВ Ультравак, 3-комп., с. 01.07.10 1130 Н/д**
ЖГВ Инфлювир, моно (ШШ), с. 31.10.09 380 250
ЖГВ Ультравак, 3-комп., с. 12.06.09 210 250
ЖГВ Ультравак, 3-комп., с. 06.05.09 570 370
ЖГВ 3-комп., с. 56.07.08 ФГУП «НПО «Микроген» 200 250
ЖГВ 3-комп., с. 05.06.08 200 370
ЖГВ 3-комп., с. 79.07.07 1020 Н/д
ЖГВ 3-комп., с. 04.08.06 240 250
ЖГВ 3-комп., с. 524.09.05 570 500
ЖГВ детская (ШШ), с. 1к 1845, 1992 1140 1020
ЖГВ детская ^N2), с. 4к 1846, 1992 Одесское предприятие по производству бактерийных препаратов Минмедбиопрома 1140 > 1020
ЖГВ детская (В), с. 8к 2231, 1992 1140 1020
ЖГВ детская ^N2), с. 4к 1848, 1992 1140 1020
ОЖГВ* для взрослых (В), с. 6, 1991 Предприятие по производству бактерийных препаратов ЛенНИИВС Минмедбиопрома < 40 30
* ОЖГВ - очищенная от примесного белка ЖГВ. ** Н/д - не делали.
В опытном образце живой моновакцины (типа В), очищенной от примесного белка в ЛенНИИВС Минмедбиопрома, содержание ОА было довольно низким (30 мкг/мл). Авторам известно, что разработанная в этом институте почти два десятилетия назад опытно-промышленная технология очистки ЖГВ позволяла получать серии препарата с содержанием ОА менее 5 мкг/мл.
В отличие от живых интраназальных вакцин в убитых инъекционных гриппозных вакцинах предельное содержание ОА регламентировано нормативными документами (в России - фармакопейными статьями). Этот показатель очень низкий, соответствует значению < 1 мкг/мл, что в 200 - 1000 раз меньше количества ОА, выявленного нами в препаратах ЖГВ.
В своих дальнейших исследованиях мы подтвердили соответствие различных препаратов ИГВ этому нормативному показателю ОА. Были исследованы пять препаратов ИГВ разных лет изготовления (12 образцов):
• Грипповак - цельновирионная вакцина производства СПбНИИВС (2002, 2008, 2010 гг.);
• Ваксигрип - расщепленная вакцина производства «Пастер-Мерье», Франция (2002, 2010 гг.);
• Грифор - расщепленная вакцина опытного производства НПО «Микроген» (2008 г.);
• Гриппол - субъединичная вакцина производства НПО «Микроген» (2001, 2009, 2010 гг.);
• Инфлювак - субъединичная вакцина производства «Солвей Фарма», Нидерланды (2008, 2010 гг.).
Содержание примесного ОА в перечисленных препаратах ИГВ, проверенных методами ИФА и РНГА, составляет 0,3 - 1 мкг/мл, что соответствует показателям нормативных документов.
Выявление АТ к ОА в сыворотках крови и бронхолегочных смывах мышей, иммунизированных АЖ и ЖГВ
Имеются разные коммерческие тест-системы, позволяющие выявлять специфические ^Б к антигенам куриных белков, чтобы оценить степень ал-лергизации к ним людей. Специфические ^Б обычно определяют в ИФА к таким пищевым моно- и полиаллергенам куриного происхождения, как: овальбумин, овомукоид, яичный белок, яичный желток и куриное мясо. Для обнаружения АТ изо-типов ^ и ^Д к ОА подобных диагностических систем не существует. Поэтому нами были изготовлены соответствующие эритроцитарные диагностику-мы, способные выявлять в РТНГА эти специфические иммуноглобулины.
Были изготовлены жидкие и сухие антигенные эритроцитарные диагностикумы, необходимые для обнаружения АТ к ОА и КЭБ в сыворотках крови и смывах, взятых из респираторного тракта чело-
века и животных. Опыты показали, что изготовленные диагностикумы можно успешно применять для обнаружения антител к ОА в сыворотках крови и бронхолегочных смывах мышей, интенсивно иммунизированных материалом (АЖ, ЖГВ), содержащим большое количество ОА. У мышей до иммунизации АТ к ОА в сыворотках крови и бронхоле-гочных смывах отсутствуют. Нет в них и каких-либо ингибиторов, подавляющих непрямую гемагглюти-нацию, и гетерогемагглютининов, так как материал перед исследованием был от них освобожден. В группе мышей, привитых АЖ трехкратно с интервалом в семь суток (внутрибрюшинно 0,25 мл и дважды интраназально по 50 мкл), отмечено появление специфического в^Д, определяемого в брон-холегочных смывах. Кратность прироста секреторных АТ к ОА через две недели после иммунизации составляет 6,4. В группе мышей, привитых по той же схеме вначале АЖ, а затем два раза препаратом аллантоисной ЖГВ Ультравак (200 мкг/мл ОА), кратность прироста сывороточного анти-ОА (^0) в те же сроки после иммунизации составляет 4,8. Эти показатели являются достаточно высокими.
Иммунный ответ на примесный яичный белок у лиц, привитых ЖГВ
Один из критериев безопасного применения гриппозных вакцин - их реактогенность. Живые вакцины не должны вызывать повышение температуры выше 37,5 °С у более чем 3% привитых. В группах лиц, иммунизированных алланто-исной ЖГВ Инфлювир (380 мкг/мл ОА), культу-ральной ЖГВ-НР 0НВ041.1 (без ОА) и плацебо, подобного подъема температуры не было, то есть вакцины были полностью ареактогенными (данные предоставлены главным исследователем М.К. Ерофеевой).
В сыворотках крови людей еще до иммунизации в 26,8% случаев (обследован 41 человек) выявлены АТ (^0) к ОА (табл. 2). В анамнезе этих волонтеров отсутствуют какие-либо аллергические реакции на куриный белок или предшествующую гриппозную прививку.
После двухкратной иммунизации лиц аллантоисной ЖГВ индекс прироста анти-ОА (^0) составил 2,9, а анти-КЭБ (^0) - 4,0 (табл. 3, 4). В группах лиц негативного контроля, привитых культу-ральной ЖГВ-НР и плацебо, как и ожидалось, никакого прироста АТ к яичному белку (ОА, КЭБ) не было.
Назофарингеальные смывы от волонтеров для исследований нам, к сожалению, не смогли предоставить. Исходя из существующих представлений о преимущественном формировании при интрана-зальной иммунизации секреторных АТ ^Д, а не сывороточных АТ ^0, следует ожидать, что индексы прироста секреторных АТ к ОА и КЭБ после двухкратной иммунизации яичной ЖГВ должны быть довольно высокими.
Безопасность иммунизации населения признана Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) приоритетным направлением. Различные примеси в вакцинах должны быть строго регламентированы нормативной документацией на препарат. Среди примесей особую опасность представляют гетерологичные белки. В гриппозных вакцинах это яичный белок. По требованиям ВОЗ инъекционные препараты ИГВ должны содержать в одной дозе не более 4 мкг ОА [11]. Верхний уровень фактического содержания этого белка в различных отечественных и зарубежных препаратах ИГВ в несколько раз меньше, что подтверждено и нашими исследованиями.
В отечественных препаратах ЖГВ содержание примесного белка не регламентируется. Из приведенных данных видно, что количество примесного ОА в интраназальной ЖГВ в 200 - 1000 раз превышает показатель предельного содержания этого гетерологичного для человека белка в препаратах ИГВ. Как оценить эти данные, исходя из необходимости обеспечения максимальной безопасности многократной массовой иммунизации населения ЖГВ?
Опыты на животных в отличие от наблюдений на людях позволяют полнее и точнее оценить влияние примесных белков при иммунизации гриппозными вакцинами. Эти работы выполнены на высоком методическом уровне еще около 30 лет назад, при внедрении ИГВ в медицинскую практику. Оказалось, что ОА в дозах 16 и 25 мкг, введенный однократно внутримышечно морским свинкам, приводит к возникновению у них анафилактического шока на последующую (через три-четыре недели) внутривенную инъекцию ОА [13]. В реакции бласт-трансформации при повторной иммунизации мышей ИГВ под действием куриных белков формируются клоны антиген-реактивных клеток, что свидетельствует об аллергизации животных к примесному белку. Препараты ИГВ даже с низким содержанием куриного белка (0,06 мкг/мл) способ-
Таблица 2.
Антитела к ОА в сыворотках крови волонтеров до иммунизации гриппозными вакцинами (по результатам РТНГА)
Всего обследовано результаты рТНГА
положительные в различных разведениях сывороток всего положительных всего отрицательных
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 абс. ч. % абс. ч. %
41 4 4 2 1 0 11 26,8 30 73,2
Таблица 3.
Антитела к ОА в парных сыворотках крови у лиц, иммунизированных двухкратно ЖГВ
препарат Титр АТ Кол-во обслед. лиц Конверсии СГТ-1 СГТ-2 Кратность прироста АТ Индекс прироста АТ
абс. ч. %
ЖГВ Инфлювак А(Н1Ш) (аллант.) < 1/8 9 0 0 1,7 1,5 0,9 2,9
0 - 1/8 и > 11 2 18,2 2,1 5,6 2,6
ЖГВ-НР А(Н5Ш) (культ.) < 1/8 6 0 0 1,7 2,0 1,2 0,9
0 - 1/8 и > 7 0 0 3,7 4,3 1,1
Контроль (физ. р-р) < 1/8 14 0 0 1,7 1,7 1,0 1,0
0 - 1/8 и > 15 0 0 2,1 2,1 1,0
Таблица 4.
Антитела к КЭБ в парных сыворотках крови у лиц, иммунизированных двухкратно ЖГВ
препарат Титр АТ Кол-во обслед. лиц Конверсии СГТ-1 СГТ-2 Кратность прироста АТ Индекс прироста АТ
абс. ч. %
ЖГВ Инфлювак А(Н1Ы1) (аллант.) < 1/8 9 0 0 0,7 0,6 0,9 4,0
0 - 1/8 и > 11 2 16,7 0,7 2,7 3,6
ЖГВ-НР А(Н5Ы1) (культ.) <1/8 7 0 0 1,4 1,4 1,0 1,0
0 - 1/8 и > 7 0 0 1,4 1,4 1,0
Контроль (физ. р-р) < 1/8 16 0 0 0,7 0,9 1,3 1,0
0 - 1/8 и > 16 0 0 0,7 0,9 1,3
ны вызвать анафилаксию у морских свинок после трех - пятикратной иммунизации [2]. Причем динамика накопления антител к куриному белку коррелирует с динамикой интенсивности реакции анафилаксии. Суперочищенная от ОА (до концентрации < 0,008 мкг/мл) ИГВ не вызывает анафилаксию и не индуцирует выработку антител к примесному белку даже после семикратной иммунизации животных. В середине 80-х годов было установлено, что не только многократная, но даже однократная иммунизация морских свинок ЖГВ приводит к появлению у них повышенной чувствительности к вакцине [5]. Реакция наблюдалась у сенсибилизированных животных в ответ на внутривенное введение ЖГВ, протекающее по типу острого анафилактического шока. Вакцина для иммунизации животных применялась в дозе, принятой для иммунизации людей, и вводилась интра-назально согласно инструкции по применению к ЖГВ.
В наших исследованиях методами ИФА и РНГА впервые установлено количество примесного ОА (от 200 до 1140 мкг/мл) в различных сериях ЖГВ, изготовленных на куриных эмбрионах за длительный период (1992 - 2010 гг.) разными производителями. Если учесть, что ОА в аллан-тоисной жидкости КЭ составляет лишь половину массы всего пула куриных белков, то фактиче-
ское содержание всех примесных куриных белков в препаратах ЖГВ должно быть в два раза больше, чем определяемое количество одного ОА. В клинических исследованиях в сыворотках крови лиц, иммунизированных интраназаль-но двухкратно моновалентной ЖГВ Инфлювир (ОА - 380 мкг/мл), выявлен почти трехкратный прирост АТ ^ к ОА и четырехкратный прирост АТ к другим белкам куриного эмбриона (по данным РТНГА). Сероконверсии соответствующих АТ в группе негативного контроля у лиц, иммунизированных опытным образцом культуральной ЖГВ-НР и плацебо, в которых куриный белок полностью отсутствует, не обнаружено.
Несмотря на повышенный уровень ^-анти-ОА в сыворотках крови лиц после иммунизации аллан-тоисной ЖГВ, препарат проявил себя полностью ареактогенным. Как трактовать факт образования бесполезных для организма вакцинируемых людей АТ к непротективным антигенам ЖГВ с позиций побочного действия вакцины? Известно, что нарастание АТ к примесному белку не входит в перечень побочных эффектов в поствакцинальном периоде, рекомендованных ВОЗ для регистрации и мониторинга. Тем не менее с научных позиций этот факт следует расценивать как вид побочного действия ЖГВ, хотя и не связанного с каким-либо поствакцинальным осложнением.
Итак, практическое здравоохранение нашей страны имеет более чем 30-летний опыт массового интраназального применения ЖГВ с очень высоким содержанием примесного яичного белка. В 80-х годах прошлого столетия использовали ежегодно 12 - 15 млн доз, в 1990 году - около 50 млн доз ЖГВ, а в последние два десятилетия - 6 млн доз вакцины и более. За это длительное время живая вакцина зарекомендовала себя как безопасный препарат, у которого отсутствуют побочные эффекты в поствакцинальном периоде, официально регистрируемые в первые дни после иммунизации [4].
Но, как и в предыдущие годы, сейчас, исходя из экспериментально накопленных данных, по-прежнему не исключена потенциальная опасность аллергизации вакцинируемых после повторных прививок одной ЖГВ или ЖГВ и ИГВ. Не исключен при этом и синергизм предполагаемого побочного действия гриппозных и других яичных вакцин - вирусных и риккетсиозных. Остается открытым традиционный вопрос: что делать? Очевидно, в данном случае следует руководствоваться необходимостью внедрения в производство ЖГВ измененной технологии, обеспечивающей минимизацию примесного яичного белка в вакцине. Существующие промышленные способы очистки биомассы вируса гриппа позволяют это сделать. Еще в конце прошлого века на предприятии СПбНИИВС были разработаны и официально утверждены экспериментально-производственный регламент (1990 г.) и временная фармакопейная статья (1992 г.) на изготовление и контроль очищенной от примесного яичного белка ЖГВ (ОЖГВ). На препарат получен соответствующий патент (1995 г.), а по разработке технологии производства очищенной вакцины защищена докторская диссертация [3, 6, 12].
В России для интраназального применения разрешены еще цельновирионная центрифужная ИГВ Грипповак и ее аналог - элюатно-центрифужная ИГВ. Контингент прививаемых - дети с 7 лет и взрослые с 18 лет при двухкратном введении вакцины. Возможность интраназального применения отечественных корпускулярных ИГВ является их достоинством. К сожалению, в течение уже многих лет эти вакцины производят в ограниченном количестве, так как не обеспечен выпуск препаратов фасовкой по одной дозе в комплекте с распылителем-дозатором одноразового применения. Для расширения применения вакцины необходимо также уменьшить возрастной порог прививаемых с 7 до 3-х лет и перейти, если это возможно, с двухкратной на однократную вакцинацию. Препарат содержит по 20 мкг/мл гемагглю-тинина вирусов гриппа типа А и 26 мкг/мл - вируса типа В.
Альтернативой коммерческой ЖГВ может быть интраназальная цельновирионная или расщепленная ИГВ с кораубаном (вакцина Грипкор), которая давно разработана в НИИ гриппа [7], но «лежит
на полке» с 1997 года, оставаясь на стадии создания образца вакцины, необходимого для осуществления клинических испытаний (1-я фаза). В проекте вакцина Грипкор обладает главными достоинствами не только ЖГВ, но и ИГВ. В то же время новая вакцина лишена их основных недостатков. Ожидаемые преимущества Грипкора перед ЖГВ: высокая степень очистки от примесного белка, меньшее количество противопоказаний к применению и возможность широкого использования для праймированных лиц (то есть для большинства подростков и взрослых, у которых ЖГВ не «приживляется»). Ожидаемые преимущества перед ИГВ: более удобный и безопасный мукозальный путь введения, формирование гомологичного (штаммо-специфического) и гетерологичного (субтипического и гетеросубтипического) иммунитета на первом рубеже защиты от гриппа - в верхних дыхательных путях, являющихся не только воротами инфекции, но и основным местом размножения вируса, а также ранний неспецифический защитный эффект в отношении гриппа и других респираторных вирусных инфекций (за счет индукции интерферона). Внедрение в медицинскую практику мукозальной вакцины с указанными положительными свойствами могло бы сократить частоту профилактических гриппозных прививок для населения.
Выводы
1. Методами ИФА и РНГА впервые установлено количество примесного ОА в сериях ЖГВ, изготовленных с 1992 по 2010 год разными отечественными производителями. Показатели содержания ОА в препаратах ЖГВ очень высокие - от 200 до 1140 мкг/мл. При этом максимальное количество гетерологичного для человека белка обнаружено не только в давно изготовленных препаратах (1992 г.), но и в сериях ЖГВ, выпущенных недавно (2007, 2010 гг.). Следовательно, технология производства ЖГВ, касающаяся очистки от примесного белка, за многие годы не изменилась или вообще не предусмотрена промышленным регламентом.
2. В клинических исследованиях в сыворотках крови лиц, иммунизированных интраназально двухкратно моновалентной (И1И1) ЖГВ Инфлювир (380 мкг/мл ОА), выявлен почти трехкратный прирост АТ ^0 к ОА и четырхкратный прирост антител к другим белкам куриного эмбриона (по данным РТНГА с эритроцитарным диагно-стикумом). Сероконверсии этих антител в группе негативного контроля у лиц, иммунизированных культуральной ЖГВ-НР и плацебо, в которых куриный белок полностью отсутствует, не обнаружено.
3. В сыворотках крови людей еще до иммунизации в 26,8% случаев (обследован 41 человек) обнаружены АТ (^0) к ОА, хотя в анамнезе этих лиц отсутствовали какие-либо аллергические реакции на куриный белок или предшествовавшую грип-
позную прививку. При иммунизации волонтеров аллантоисной ЖГВ препарат был полностью ареактогенным, несмотря на существенное повышение уровня ^-анти-ОА в сыворотках крови после вакцинации. Факт образования бесполезных для организма вакцинируемых АТ к непротективным антигенам ЖГВ с научных позиций следует рассматривать как вид иммунного побочного действия вакцины, не связанного с каким-либо поствакцинальным осложнением.
4. Практическое здравоохранение РФ имеет более чем 30-летний опыт массового интрана-зального применения ЖГВ с очень высоким содержанием примесного яичного белка. За этот длительный период ЖГВ зарекомендовала себя как безопасный препарат. Исходя из представленных и ретроспективных экспериментально накопленных данных, по-прежнему не исключена потенциальная опасность аллергизации вакцинируемых после повторных прививок одной ЖГВ или ЖГВ, ИГВ и другими яичными (вирусными, риккетсиозными) вакцинами. Учитывая вышеизложенное и руководствуясь рекоменду-
емым ВОЗ принципом создания технологий производства, предусматривающих максимальное удаление примесей из вакцинных препаратов, следует безотлагательно внедрить усовершенствованную технологию изготовления ЖГВ, обеспечивающую минимизацию в ней примесного яичного белка. ■
Авторы выражают глубокую благодарность сотрудникам ФГБУ «НИИ гриппа» МЗиСР РФ М.К. Ерофеевой, М.А. Стуковой, В.Л. Максаковой, М.Г. Поздняковой и И.Ю. Никонорову за предоставление образцов сывороток крови, полученных в ходе официальных клинических испытаний гриппозных вакцин - аллантоисной ЖГВ Инфлювак и культураль-ной ЖГВ-НР (вИй04И), и за ценную консультативную помощь.
Особая благодарность - главному специалисту Управления Роспотребнадзора по Санкт-Петербургу Т.И. Крайновой за оперативную помощь в получении для исследований актуальных гриппозных вакцин.
Литература
1. Аллергия на куриные яйца / Режим доступа: http://www.medeffect.ru/ allergy/allergy-0085.shtml
2. Бичурина М.А., Розаева Н.Р., Полянская Н.Ю. и др. Безвредность инак-тивированной гриппозной хроматографической вакцины в свете данных экспериментального изучения результатов массовой иммунизации населения / Проблема конструирования гриппозных вакцин. - Л., 1988. С. 118 - 124.
3. Вакцина гриппозная аллантоисная очищенная живая сухая для интра-назального введения: Экспериментально-производственный регламент ЛенНИИВС Министерства медицинской промышленности СССР, 1990; Временная фармакопейная статья 42-316 ВС-92.
4. Ерофеева М.К., Максакова В.Л., Стукова М.А. и др. Проблемы вакци-нопрофилактики гриппа в современных условиях // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2006. № 5 (30). С. 14 - 20.
5. Каландадзе Т.В. Показатели аллергизирующих свойств гриппозных вакцин: Автореф. дис. ... к.м.н. - М., 1985. - 23 с.
6. Крашенюк А.И. Разработка и производство нового поколения вирион-ныхгриппозных вакцин: Автореф. дис. ... д.м.н. - СПб., 1995. - 81 с.
7. Кузнецов О.К., Корнеева Э.П., Степанова Л.А. и др. Доклиническое изучение специфической активности мукозальных инактивирован-ных гриппозных и аденовирусных вакцин с адъювантом // Мед. акад. журн. 2008. Т. 8. № 3. С. 46 - 54.
8. Кузнецов О.К., Степанова Л.А. Продолжительность защиты от гриппа после инфицирования и вакцинации // Эпидемиология и Вакцинопро-филактика. 2009. № 4 (47). С. 29 - 38.
9. Кузнецов О.К., Степанова А.А., Коротков А.В. Особенности вакцино-профилактики гриппа // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2006. № 1 (26). С. 3 - 7.
10. Кузнецов О.К., Степанова Л.А., Мигунов А.И. Специфическая профилактика вирусных инфекций / Вопросы общей вирусологии: Учебное пособие / Под ред. О.И. Киселева, И.Н. Жилинской. - СПб.: СПбГМА им. И.И. Мечникова, 2007. С. 165 - 235.
11. Медуницын Н.В. Побочное действие вакцин // Биопрепараты. 2001. № 3. С. 10 - 12.
12. Патент № 2033182. Очищенная живая гриппозная вакцина жидкая для интраназального применения / А.И. Крашенюк; заявлено 19.10.1991 г.; зарегистрировано 20.04.1995 г.
13. Перадзе Т. В., Фридман Э.А., Бичурина М.А. и др. К вопросу о стандартизации инактивированной гриппозной вакцины / Вакцинопрофилактика и иммунология гриппа. - Л., 1980. С. 29 - 35.
14. Руденко Л.Г., Ларионова Н.В., Киселева И.В. и др. Живая гриппозная вакцина: итоги разработок и перспективы применения // Мед. акад. журн. 2010. Т. 10. № 4. С. 235 - 239.
15. Степанова Л.А., Мигунов А.И., Коротков А.В. и др. Научные основы и перспективы создания мукозальных инактивированных гриппозных вакцин // Мед. акад. журн. 2006. Т. 6. № 4. С. 3 - 16.
16. Чиркова Т.В. Оценка влияния гриппозной инфекции и иммунизации живой реассортантной гриппозной вакциной на возникновение и течение ^Е-опосредованных аллергических реакций организма: Автореф. дис. ... к.б.н. - СПб., 2007. - 21 с.
17. Чиркова Т.В., Донина С.А., Григорьева Е.П. и др. Изучение влияния гриппозной инфекции и вакцинации на возникновение ^Е-опосредованных иммунных реакций у людей разного возраста // Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4. № 3. С. 148, 149.
18. Чиркова Т.В., Донина С.А., Петухова Г.Д. и др. Иммунный ответ на гриппозную инфекцию и вакцинацию живой гриппозной вакциной в условиях аллергической сенсибилизации организма // Аллергология и иммунология. 2006. Т. 7. № 3. С. 341.
19. Чиркова Т.В., Найхин А.Н., Донина С.А. и др. Продукция сывороточных и локальных ^Е у молодых людей при гриппозной инфекции и иммунизации живой гриппозной вакциной // Аллергология. 2006. № 1. С. 33 - 38.
20. Чубарова Н.И., Жебрун А.Б. Анализ неовальбуминовых примесных антигенов в препаратах гемагглютинина вируса гриппа / Молекулярная вирусология и медицинская биотехнология. - Л., 1990. С. 152 - 158.
