CC BY
1
Для корреспонденции
Гмошинский Иван Всеволодович - доктор биологических наук, главный научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Адрес: 109240, Российская Федерация, г. Москва, Устьинский проезд, д.2/14 Телефон: (495) 698-53-71 E-mail: gmosh@ion.ru https://orcid.org/0000-0002-3671-6508
Симоненко Е.С.1, Симоненко С.В.1, Гмошинский И.В.2, Ригер Н.А.2, Шумакова А.А.2, Зорин С.Н.2
Влияние лактоферрина и ферментативных гидролизатов белков коровьего и кобыльего молока на анафилактическую чувствительность и цитокиновый профиль крыс
Научно-исследовательский институт детского питания - филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи», 143500, г. Истра, Московская область, Российская Федерация
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, 109240, г. Москва, Российская Федерация
Research Institute of Child's Nutrition - branch of the Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 143500, Istra, Moscow region, Russian Federation Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 109240, Moscow, Russian Federation
Influence of lactoferrin and enzymatic hydrolysates of cow's and mare's milk proteins on anaphylactic sensitivity and cytokine profile of rats
Simonenko E.S.1, Simonenko S.V.1, Gmoshinski I.V.2, Riger N.A.2, Shumakova A.A.2, Zorin S.N.2
2
2
Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта Минобрнауки России, соглашение № 075-15-2022-1211. Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Симоненко С В., Гмошинский И.В.; сбор и обработка данных - Симоненко Е С., Гмошинский И.В., Шумакова А.А., Ригер Н.А., Зорин С.Н.; статистическая обработка данных - Гмошинский И.В.; написание статьи -Гмошинский И.В., Ригер Н.А.; редактирование, утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи - все авторы.
Благодарность. Авторы благодарят сотрудника ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» Иванову Г.Н. за помощь в составлении экспериментальных рационов.
Для цитирования: Симоненко ЕС., Симоненко СВ., Гмошинский И.В., Ригер НА., Шумакова А.А., Зорин С.Н. Влияние лактоферрина и ферментативных гидролизатов белков коровьего и кобыльего молока на анафилактическую чувствительность и цитокиновый профиль крыс // Вопросы питания. 2024. Т. 93, № 2. С. 31-40. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-2-31-40 Статья поступила в редакцию 19.01.2024. Принята в печать 25.03.2024.
Funding. The study was carried out with financial support from the Ministry of Education and Science of the Russian Federation, agreement No. 075-15-2022-1211.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Contribution. Concept and design of the study - Simonenko S.V., Gmoshinski I.V.; data collection and processing - Simonenko E.S., Gmoshinski I.V., Shumakova A.A., Riger N.A., Zorin S.N.; statistical data processing - Gmoshinski I.V.; writing the article - Gmoshinski I.V., Riger N.A.; editing, approval of the final version of the article, responsibility for the integrity of all parts of the article - all authors.
Acknowledgment. The authors thank the employee of the Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety G.N. Ivanova for assistance in preparing experimental diets.
For citation: Simonenko E.S., Simonenko S.V., Gmoshinski I.V., Riger N.A., Shumakova A.A., Zorin S.N. Influence of lactoferrin and enzymafe hydrolysates of cow's and mare's milk proteins on anaphylactic sensitivity and cytokine profile of rats. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2024; 93 (2): 31-40. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-2-31-40 (in Russian) Received 19.01.2024. Accepted 25.03.2024.
Разработка инновационных ингредиентов специализированных продуктов для питания детей с непереносимостью белков коровьего молока требует учета влияния белкового компонента продуктов на аллергическую чувствительность организма.
Цель работы - изучение влияния лактоферрина (ЛФ) из коровьего молозива, гидролизатов белков коровьего (ГБКМ) и кобыльего (ГБКобМ) молока на тяжесть реакции системной анафилаксии, уровни специфических антител IgG и цитокинов у крыс, парентерально сенсибилизированных овальбумином (ОВА).
Материал и методы. Эксперимент проведен на 4 группах по 26 крыс-самцов Вистар, которых внутрибрюшинно сенсибилизировали ОВА и у которых на 29-е сутки вызывали реакцию системной анафилаксии путем внутривенного введения разрешающей дозы антигена (6 мг на 1 кг массы тела). ЛФ, ГБКМ и ГБКобМ вводили в состав рациона в дозах 1,4-2,0 г на 1 кг массы тела в сутки (в среднем соответственно 1,59±0,04; 1,53±0,05 и 1,48±0,05 г на 1 кг массы тела в сутки). Содержание антител класса IgG в сыворотке крови определяли непрямым иммуноферментным методом, уровни цитокинов [интерлейкин (ИЛ) 1а, ИЛ-1в, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12(р70), ИЛ-13, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), интерферон у (ИФН-у), фактор некроза опухоли а (ФНОа)] с помощью мультиплексного иммуноанализа.
Результаты. Введение ЛФ в состав рациона не оказывало значимого влияния на аллергическую чувствительность, концентрации антител и цитокинов в крови животных. В результате потребления крысами ГБКМ достоверные изменения тяжести активного анафилактического шока и уровня антител IgG к ОВА отсутствовали, наблюдалось значимое повышение концентрации ФНОа при снижении уровня ИЛ-1а (р<0,05). У животных, получавших ГБКобМ, достоверные изменения тяжести анафилактического шока также отсутствовали, но отмечался сниженный в 1,9раза уровень антител IgG к ОВА (р<0,001) наряду со значимым увеличением концентрации ИЛ-12(р70) (р<0,05) и на уровне тенденции ИЛ-10 (р<0,10).
Заключение. Потребление ЛФ сенсибилизированными крысами не оказывает существенного влияния на их анафилактическую чувствительность и цитокиновый профиль, тогда как при включении в рацион ГБКМ отмечаются признаки развития воспалительной реакции. Потребление животными ГБКобМ сопровождается формированием противовоспалительного профиля цитокинов, чему соответствует снижение гуморального иммунного ответа на модельный аллерген. Различия в воздействиях ГБКМ и ГБКобМ, имеющих сходную степень гидролиза, могут быть связаны со специфическим составом гликопептидов, образующихся при ферментолизе молочного белка 2 видов дойных животных. Ключевые слова: пищевая аллергия; гипоаллергенная смесь; гидролизат; кобылье молоко; коровье молоко; лакто-феррин; системная анафилаксия; Т-лимфоциты; цитокины
The development of innovative ingredients of specialized formula for children with intolerance to cow's milk proteins requires accounting the influence of the protein component on the allergic sensitivity.
The aim of the research was to study the effect of lactoferrin (LF) from cow colostrum, cow's milk protein hydrolysate (CMPH) and mare's milk protein hydrolysate (MMPH) on the severity of the systemic anaphylaxis reaction, the levels of specific IgG antibodies and cytokines in rats parenterally sensitized with ovalbumin (OVA).
Material and methods. The experiment was carried out on 4 groups of 26 male Wistar rats, which were sensitized intraperitoneally with chicken egg OVA and a systemic anaphylaxis reaction was induced on the day 29 by intravenous administration of a challenge dose of the antigen (6 mg per kg body weight). LF, CMPH and MMPH were introduced into the diet in doses of 1.4-2 g/kg body weight per day (on an average 1.59±0.04, 1.53±0.05 and 1.48±0.05 g per kg body weight respectively). The content of IgG antibodies in the blood serum was determined by an indirect ELISA; the levels of cytokines IL-1a, IL-1fi, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12(p70), IL-13, GM- CSF, IFN-y and TNF-а were detected by multiplex immunoassay.
Results. Dietary LF did not have a significant effect on the severity of active anaphylactic shock (AAS), concentrations of antibodies and cytokines in the blood of animals. As a result of CMPH consumption, there were no significant changes in AAS severity and IgG antibodies to OVA but significant increase in TNF-а level was observed as well as a significant decrease in IL-1a (p<0.05). In animals receiving MMPH, there were also no significant changes in the severity of AAS, but a 1.9-fold decrease in the level of IgG antibodies to OVA (p<0.001) was noticed along with a significant increase in IL-12(p70) (p<0.05) and IL-10 (p<0.10) level. Conclusion. Cosumption of LF by sensitized rats didn't significantly affect their anaphylactic sensitivity and cytokine profile, while CMPH intake induced some signs of pro-inflammatory processes. Consumption of MMPH was accompanied by the formation of an anti-inflammatory cytokine profile, which corresponds to a decrease in the intensity of the humoral immune response to the model allergen. Differences in the effects of two hydrolisates, which have similar degrees of hydrolysis, may be associated with the specific composition of glycopeptides formed during the enzymatic cleavage of milk protein produced by these two species of dairy animals. Keywords: food allergy; hypo allergenic formula; hydrolysate; mare's milk; cow's milk; lactoferrin; systemic anaphylaxis; T-lymphocytes; cytokines
Злиминационный принцип профилактики и лечения пищевой аллергии в настоящее время наиболее широко применяется среди других подходов к терапии данного заболевания [1, 2]. Применительно к детям раннего возраста, находящимся на искусственном вскармливании, это выражается в замене в их питании нативного белка коровьего молока на его глубокие ферментативные гидролизаты, смеси аминокислот или белок молока других видов дойных животных [3].
Наибольший интерес в этом отношении представляет белок кобыльего молока, производство которого в промышленных масштабах налажено в России. Большая эволюционная дистанция между коровой и лошадью, принадлежащими к различным отрядам класса млекопитающих, создает надежду на отсутствие перекрестных реакций с белком кобыльего молока у антител вырабатываемых организмом пациентов с аллергией к белкам коровьего молока [4].
Лактоферрин (ЛФ) является важным биологически активным компонентом женского грудного молока с высокой аффинностью к ионам железа, за счет чего повышается биодоступность данного микроэлемента для ребенка [5] и одновременно тормозится развитие условно-патогенной микрофлоры вследствие связывания в просвете кишки необходимых для ее развития свободных ионов Fe2+ [6]. При этом содержание ЛФ в зрелом коровьем молоке и в большинстве стандартных смесей для искусственного вскармливания очень мало. Однако ЛФ может быть выделен из коровьего молозива. В клинических испытаниях показана безопасность коровьего ЛФ для здоровых детей на искусственном вскармливании [7] и наличие у этого ингредиента позитивного влияния на когнитивную функцию младенцев [8].
Однако практика использования кобыльего молока, гидролизатов на его основе и ЛФ в детском питании, в частности у пациентов с непереносимостью коровьего молока, имеет ограниченный характер. Недостаточно изучен вопрос о способности пептидов, образующихся при протеолизе ЛФ и кобыльего молока как in vitro, так и in vivo, а также остаточных количеств применяемых при гидролизе ферментных препаратов вызывать иммунологические и аллергические реакции либо же влиять на аллергенность других пищевых белков или метаболитов кишечной микрофлоры. Это указывает на необходимость проведения доклинических исследований in vivo указанных инновационных белковых компонентов.
При оценке собственной аллергенности пищевых белков и их влияния на аллергическую реактивность организма используется несколько биологических моделей. В первую очередь модель гастроинтестинальной аллергии у новорожденного теленка [9]. К ее преимуществам относятся физиологический характер воздействия, естественный путь поступления антигена, близость патогенетической картины наблюдаемого состояния к гастроинтестинальной аллергии у детей раннего возраста. Ограничением модели является ее высокая стоимость и трудоемкость. Альтернативой служит модель орально индуцируемой пищевой анафилаксии у морской свинки, состоящая во внутрижелудочной сенсибилизации изучаемым аллергенным белком с последующим введением его разрешающей дозы внутривенно [10]. Однако у морских свинок аллергическая реакция развивается в основном в бронхолегочной системе и отсутствуют патологические изменения в слизистой оболочке кишки, в отличие от аллергических реакций на пищу у человека [11]. Для преодоления этих проблем в настоящее время предпринимаются попытки воспроизведения аллергических реакций у генетически модифицированных мышей [12]. Интерес также представляет in vivo модель системной анафилаксии у крыс при внутрибрю-шинной сенсибилизации и внутривенном разрешении модельным пищевым аллергеном. Основной мишенью
реакции анафилаксии при этом является тонкая кишка [13]. Данная модель широко применяется при тестировании влияния различных инновационных пищевых продуктов и ингредиентов на аллергическую реактивность организма. Модель включена в стандартный протокол оценки безопасности новых источников пищевых веществ, полученных из генетически модифицированных растительных организмов1.
Цель работы - изучение влияния ЛФ из коровьего молозива, гидролизата белков кобыльего молока (ГБКобМ) и гидролизата сывороточных белков коровьего молока (ГБКМ), обладающего сходным с ГБКобМ пептидным профилем, на тяжесть реакции системной анафилаксии, уровни специфических антител IgG, про-и противовоспалительных цитокинов у крыс, парентерально сенсибилизированных модельным пищевым аллергеном - овальбумином (ОВА).
Материал и методы
Исследуемые пищевые белковые ингредиенты
В работе использовали ЛФ из молозива коровьего молока (ООО «Победа-1», РФ) с содержанием основного вещества, по данным производителя, не менее 98% по массе белка. Подлинность продукта оценивали методом гель-проникающей хроматографии с использованием системы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) «Стайер» (ЗАО «Аквилон», РФ) со спектрофотометрическим детектором (Х=280 нм), на колонке «Супероза 12» (1x30 см) с подвижной фазой 0,2 M NaCl и скоростью элюирования 0,4 см3/мин и с применением стандартного образца электрофоретически гомогенного коровьего ЛФ.
При выработке ГБКобМ использован концентрат цельного белка кобыльего молока, полученного из обезжиренного молока. При выработке ГБКМ использован концентрат сывороточных белков коровьего молока. Гидролиз проводили в водяной термостатируемой бане при температуре 50±1 °С с постоянным перемешиванием и поддержанием рН 7,4-7,6 раствором 1,0 М NaOH. По окончании гидролиза полученный продукт инактиви-ровали (75 °С) в течение 15 мин, охлаждали до комнатной температуры и центрифугировали при 3500 об/мин в течение 30 мин на центрифуге Beckman J-6B (Beckman Coulter, США). Супернатант собирали и в дальнейшем подвергали ультрафильтрации в тангенциальном потоке на установке для микро- и ультрафильтрации на базе фильтродержателя АСФ-018 (ЗАО «Владисарт», РФ) через мембрану с размером пор 10 кДа (на основе поли-эфирсульфона) со сбором низкомолекулярной фракции. Молекулярно-массовое распределение пептидов в гидролизатах оценивали методом гель-проникающей ВЭЖХ, как указано выше.
1 МУ 2.3.2.2306-07 «Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов раститель-
ного происхождения».
Дизайн эксперимента
Эксперимент проведен на 4 группах крыс-самцов линии Вистар численностью по 26 животных, с равной исходной массой тела 173±2 г (здесь и далее M±m), полученных из питомника «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. Порядок ухода, содержания, эвтаназии и экспериментальных процедур соответствовал международным руководствам по надлежащей лабораторной практике и ГОСТ 33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами». Дизайн исследования был одобрен этическим комитетом ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», протокол № 4 от 21 марта 2023 г. В течение 28 дней эксперимента животные 1-й контрольной группы получали полусинтетический рацион на основе казеина, соответствующий по составу ГОСТ Р 70355-2022 «Продукция пищевая специализированная. Общие требования к проведению доклинических испытаний на лабораторных животных». В рацион животных 2-й опытной группы вводили ЛФ, 3-й группы - ГБКМ и 4-й -ГБКобМ. Вносимые количества всех указанных белковых ингредиентов составляли в 1-ю неделю кормления 2 г на 100 г сухого рациона (вместо 2 г казеина). Впоследствии, начиная со 2-й недели эксперимента, это количество было повышено до 2,6 г/100 г, а с 4-й недели до конца эксперимента - до 2,8 г (ГБКМ) и 3,0 г (ГБКобМ) с целью обеспечить поддержание потребляемой суточной дозы добавляемых продуктов на уровне 1,4-1,6 г на 1 кг массы тела животных по общему белку.
Модель системной анафилаксии у крыс была воспроизведена в соответствии со стандартизованной методикой МУ 2.3.2.2306-07. На 1-е, 3-и, 5-е сутки эксперимента крыс внутрибрюшинно сенсибилизировали модельным пищевым аллергеном - 5-кратно перекристаллизованным ОВА в дозе 100 мкг на крысу вместе с 10 мг гидроксида алюминия в качестве адъю-ванта. На 21-е сутки дополнительно внутрибрюшинно вводили 10 мкг ОВА в тех же условиях. На 29-е сутки внутривенно вводили разрешающую дозу ОВА в дозе 6 мг на 1 кг массы тела в 0,5 мл стерильного апироген-ного 0,15 М NaCl. В течение 1 сут после этого оценивали тяжесть реакции анафилаксии, выраженной в баллах (+ - легкая реакция; ++ - реакция средней тяжести, +++ - тяжелая реакция; ++++ - летальный исход). Непосредственно перед введением разрешающей дозы отбирали 1,0 мл крови из хвостовой вены для определения содержания антител к ОВА и цитокинов. Выживших в течение суток животных выводили из эксперимента путем ингаляции CO2.
Методы иммунохимического анализа
В сыворотке крови крыс определяли концентрацию специфических антител IgG к ОВА, выполняющих у животных данной линии функцию аллергических (реа-гиновых) антител, методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа на полистироле согласно МУ 2.3.2.2306-07.
Уровень цитокинов [гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), интерферон у (ИФН-у), интерлейкин (ИЛ) 1а, ИЛ-Iß, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12(р70), ИЛ-13, фактор некроза опухоли а (ФНОа)] в образцах сыворотки определяли с использованием коммерческого набора Bio-Plex Pro™ Rat Cytokine Th1/Th2 Panel 12-plex (Cat. #171K1002M) (Bio-Rad Laboratories, Inc., США) на анализаторе Luminex 200 (Luminex Corporation, США) по технологии xMAP с использованием программного обеспечения Luminex xPONENT Version 3.1.
Статистическая обработка данных
Статистическую обработку результатов исследования проводили путем расчета выборочного среднего (M) и стандартной ошибки (m) после установления соответствия распределения данных нормальному закону в соответствии с критерием Колмогорова-Смирнова. Исключение грубо выпадающих значений измеряемых величин, обусловленных погрешностями анализа, проводили в соответствии с критерием Граббса, в числе не более 1 на группу. Достоверность различий средних значений массы животных, уровней антител к ОВА и цитокинов между группами определяли с использованием непараметрического рангового U-критерия Манна-Уитни. Достоверность различия долевых показателей тяжести анафилактического шока (% летальности, % тяжелых реакций) проверяли с использованием точного теста Фишера. Сравнение распределения животных по тяжести активного анафилактического шока (ААШ), выраженной в баллах, выполняли с помощью многомерного критерия х2. Во всех случаях различия признавали достоверными на уровне значимости р<0,05. При расчетах использовали пакеты программ Excel 365 и IBM SPSS Statistics 20.0 (IBM, США).
Результаты
Характеристика белковых ингредиентов
Как следует из данных, приведенных на рис. 1, хрома-тограмма ЛФ характеризуется наличием практически единственного пика, содержащего более 98% всего белкового материала образца и совпадающего по времени удержания со стандартным образцом ЛФ. Хрома-тограммы ГБКМ и ГБКобМ характеризовались почти полным отсутствием негидролизованного белка с молекулярными массами более 20 кДа; основная часть пептидного материала (более 70% в ГБКМ и более 90% в ГБКобМ) отвечала по времени удержания диапазону молекулярных масс менее 8,7 кД. Таким образом, исследуемые продукты могли быть характеризованы как частичные ферментативные белковые гидролизаты со сходной степенью гидролиза.
Интегральные показатели животных
В ходе сенсибилизации и кормления крыс опытными рационами гибель, заболеваемость животных в 1-й
А/А 350 -300 -250 -200 -150100 -50-
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
В/С
6050403020100
0
10
6050403020100
20 30
Л
20 30
40
50
60
70
80
Время удержания, мин / Retention time, min
Рис. 1. Хроматограммы образцов лактоферрина из молозива коровьего молока (А); гидролизата сывороточных белков коровьего молока (Б) и гидролизата белков кобыльего молока (В)
Fig. 1. Chromatograms of lactoferrin samples from cow's milk colostrum (A); cow's milk whey protein hydrolyzate (B) and mare's milk protein hydrolyzate (C)
(контроль), 2-й (ЛФ) и 4-й (ГБКобМ) группах не отмечались. В 3-й группе (ГБКМ) погибла 1 крыса. Все остальные животные были активны, имели нормальный внешний вид и поведение. Средняя масса тела крыс всех групп на протяжении эксперимента монотонно возрастала практически в одинаковом темпе (рис. 2), за исключением кратковременного отставания в прибавке массы тела крыс 2-й группы, получавшей ЛФ, на 22-е сутки опыта.
Количество гидролизатов, потребляемое крысами в сутки в расчете на кг массы тела, в 1-ю неделю эксперимента значительно колебалось (рис. 3), что соответствовало адаптации животных к применяемым рационам. Однако в дальнейшем это количество стабилизировалось на уровне 1,4-1,6 г на 1 кг массы тела. Средняя доза ЛФ, потребленная животными за все время эксперимента, составила 1,59±0,04 г на 1 кг массы тела в сутки, ГБКМ - 1,53±0,05 г на 1 кг массы тела в сутки, ГБКобМ -1,48±0,05 г на 1 кг массы тела в сутки.
Результаты воспроизведения реакции системной анафилаксии
Основные результаты воспроизведения ААШ у крыс в течение 1 сут после введения разрешающей дозы ОВА представлены в табл. 1. Как следует из полученных данных, летальность, число тяжелых реакций анафилаксии (количество +++ и ++++ реакций в сумме) и анафилактический индекс (арифметическое среднее балльных оценок тяжести реакции по группе) у крыс, получавших ЛФ, ГБКМ и ГБКобМ, достоверно не отличались от показателей животных контрольной группы. Как следует из данных рис. 4А, В группе животных, получавших ЛФ, отмечалась тенденция к росту числа крыс, проявивших реакцию ААШ средней тяжести (++) за счет снижения в 2 раза животных со слабой реакцией (+). Однако распределения крыс во всех 3 опытных группах по тяжести анафилактического шока в целом отличались от контроля незначимо (р>0,10, критерий х2).
350 1
300 -
250 -
1
^ 200
о
оа
5 150-
100
□ Контроль / Control
□ ЛФ / LF
■ ГБКМ / CMPH
■ ГБКобМ / MMPH
I
fi
fiH
fed
fei
Iii
fei
fe*
iflfji-
50 "
0 |l
1 5 8 10 12 15 17 19 22 24 26 29
Сутки эксперимента / Days of experiment Рис. 2. Масса тела крыс 4 групп на протяжении эксперимента, M±m (n=26 в группе)
* - статистически значимое отличие (p<0,05) от показателя животных контрольной группы.
Здесь и на рис. 3, 4: ЛФ - лактоферрин из коровьего молозива; ГБКМ - гидролизат белков коровьего молока; ГБКобМ - гидролизат белков кобыльего молока.
Fig. 2. Body weight of rats from 4 groups during the experiment, M±m (n=26 per group)
* - statistically significant difference (p<0.05) from the control group of animals.
Here and in Fig. 3, 4: LF - lactoferrin from cow colostrum; CMPH - cow's milk protein hydrolysate; MMPH - mare's milk protein hydrolysate.
2,25 -|
2,00
1,75
1,50
1,25
Контроль / Control ЛФ / LF ГБКМ / CMPH ГБКобМ / MMPH
12 16 20 Сутки эксперимента / Days of experiment
24
28
32
Рис. 3. Потребление крысами исследуемых белковых ингредиентов рациона на протяжении эксперимента, M±m (n=26 в группе) Fig. 3. Consumption of the dietary protein ingredients by rats during the experiment, M±m (n=26 per group)
8
Таблица 1. Результаты воспроизведения реакции активного анафилактического шока (ААШ) у крыс (M±m) Table 1. Results of inducing the reaction of active anaphylactic shock in rats (M±m)
Показатель / Indicator Группа животных / Group of animals
1-я (контроль) 1st (control) 2-я (ЛФ) 2nd (LF) 3-я (ГБКМ) 3rd (CMPH) 4-я (ГБКобМ) 4th (MMPH)
Масса тела исходная, г / Initial body weight, g 173±3 173±3 173±2 173±2
Масса тела конечная, г / Final body weight, g 327±5 317±6 318±5 322±5
Летальность ААШ, % / Lethality of active anaphylactic reaction, % 30,8 38,5 36,0 30,8
Число тяжелых реакций анафилаксии (+++ и +++), % Number of severe anaphylactic reactions (+++ and +++), % 30,8 38,5 36,0 30,8
Анафилактический индекс / Anaphylactic index 2,27±0,25 2,58±0,24 2,36±0,28 2,27±0,26
П р и м е ч а н и е. ЛФ - лактоферрин из коровьего молозива; ГБКМ - гидролизат белков коровьего молока; ГБКобМ - гидролизат белков кобыльего молока.
N o t e. LF - lactoferrin from cow colostrum; CMPH - cow's milk protein hydrolysate; MMPH - mare's milk protein hydrolysate.
А/А
501
40-
30-
20-
10-
Б/B
Контроль Control
ЛФ LF
ГБКМ CMPH
ГБКобМ MMPH
с a s f=
4+ И 2+ П 1+ П 0+
9-, 87654321 -
nh rh
'# t
Контроль ЛФ Control LF
i
ГБКМ ГБКобМ CMPH MMPH
0
0
Рис. 4. Распределение крыс 4 групп по тяжести реакции активного анафилактического шока (А) и концентрация в сыворотке крови антител !дй к овальбумину (М±т) (Б)
Число животных - по 26 в группе. Статистически значимое отличие (р<0,001), согласно и-критерию Манна-Уитни, от показателя животных: * - контрольной группы; ? - группы ЛФ; # - группы ГБКМ.
Fig. 4. Distribution of rats in 4 groups according to the severity of the active anaphylactic shock (A) and the concentration of IgG antibodies to ovalbumin in the blood serum (M±m) (B)
The number of animals is 26 per group. Statistically significant difference (p<0.001) according to the Mann-Whitney U test from the indicator of animals: * - control group;f - LF group; # - CMPH group.
Определение ответа циркулирующих антител класса ^ к ОВА у животных 4 групп показало (рис. 4Б), что в группах крыс, получавших с рационом ЛФ и ГБКМ, концентрация антител не отличалась от контроля, тогда как в группе, получавшей ГБКобМ, ответ антител к модельному пищевому аллергену был достоверно (р<0,001) снижен в 1,9 раза по сравнению с контролем и с животными, получавшими ЛФ, а также в 1,6 раза по сравнению с крысами, потреблявшими ГБКМ.
Анализ профиля цитокинов сыворотки крови
Результаты определения уровней секретируемых ТИ1-и ТИ2-лимфоцитами цитокинов в сыворотке крови крыс четырех групп представлены в табл. 2. Как следует из этих данных, потребление сенсибилизированными
животными рациона с добавлением ЛФ значимо не повлияло на исследуемый цитокиновый профиль по сравнению с крысами контрольной группы.
Добавление в рацион сенсибилизированных крыс ГБКМ и ГБКобМ вызывало ряд изменений исследуемых показателей системы клеточного иммунитета. А именно, у крыс, которых содержали на рационе с добавкой ГБКМ, достоверно снизился уровень ИЛ-1а (в 1,52 раза; р<0,05) и возрос - ФНОа (в 1,33 раза; р<0,05) по сравнению с показателем животных контрольной группы. С другой стороны, потребление крысами рациона с добавлением ГБКобМ вызвало на уровне тенденции увеличение уровня ИЛ-10 (в 1,37 раза; р=0,09) и значимое повышение концентрации ИЛ-12(р70) (в 1,38 раза; р=0,05) по сравнению с контролем.
Таблица 2. Концентрация цитокинов в сыворотке крови крыс 4 групп (M±m), пг/мл Table 2. Cytokine level in blood serum of rats from 4 groups (M±m), pg/ml
Показатель Indicator Группа животных / Group of animals
1-я (контроль) / 1st (control) n=10 2-я (ЛФ) / 2nd (LF) n=10 3-я (ГБКМ) / 3rd (CMPH) n=10 4-я (ГБКобМ) / 4th (MMPH) n=9
GM-CSF 1,08±0,21 1,15±0,29 1,78±0,44 1,21±0,22
ИФН-у / IFN-y 8,75±1,80 12,79±1,96 9,94±1,56 10,90±1,64
ИЛ-1а / IL-1a 2,13±0,23 2,01±0,19 1,40±0,18* 2,17±0,27#
ИЛ-1 р / IL-1/3 1,76±0,38 1,58±0,38 1,72±0,44 2,26±0,33
ИЛ-2 / IL-2 6,57±0,48 7,36±0,64 7,65±0,56 7,82±0,51
ИЛ-4 / IL-4 0,95±0,11 1,14±0,12 1,13±0,06 1,11 ±0,09
ИЛ-5 / IL-5 7,05±0,51 6,72±0,37 7,98±0,27+ 7,12±0,45
ИЛ-6 / IL-6 4,69±0,68 6,32 ±1,06 5,18±0,63 5,81±0,63
ИЛ-10 / IL-10 2,04±0,26 2,32±0,37 2,09±0,25 2,79±0,19#, ®
ИЛ-12(р70) / IL-12(p70) 1,52±0,24 1,74±0,17 2,00±0,27 2,10±0,15*
ИЛ-13 / IL-13 0,98±0,19 1,21±0,23 0,90±0,14 1,02±0,24
ФНОа / TNF-a 0,24±0,02 0,27±0,04 0,32±0,03* 0,28±0,05
П р и м е ч а н и е. Статистически значимое отличие (p<0,05) согласно U-критерию Манна-Уитни от показателя животных: * - контрольной группы;f - группы ЛФ; # - группы ГБКМ; @ - отличие от контроля при p<0,10.
N o t e. Statistically significant difference (p<0.05) according to the Mann-Whitney U test from the indicator of animals: * - control group; f - LF group; # - CMPH group; @ - difference from control at p<0.10.
Кроме того, концентрация ИЛ-10 и ИЛ-1а в сыворотке крыс, потреблявших с кормом ГБКМ, была достоверно снижена по сравнению с показателями животных, получавших ГБКобМ (соответственно в 1,33 раза; p<0,05 и в 1,55 раза, p=0,05). При этом уровень ИЛ-5 был статистически значимо выше у крыс, получавших ГКМБ, по сравнению с таковым у животных, получавших ЛФ (в 1,19 раза; p<0,05).
Обсуждение
Проведенные исследования показали, что у сенсибилизированных крыс, получавших рацион с добавлением ЛФ из коровьего молозива в дозе, которая в расчете на 1 кг массы тела была значительно (приблизительно 10-кратно) аггравирована в сравнении с потреблением этого белка детьми в составе смесей для искусственного вскармливания, не наблюдалось достоверного изменения аллергической реактивности (тяжести реакции системной анафилаксии на модельный пищевой антиген), достоверного изменения ответа специфических антител IgG к ОВА и уровней про- и противовоспалительных цитокинов в сравнении с крысами, получающими контрольный сбалансированный рацион. Этот результат показывает, что включение ЛФ в состав детских формул, по-видимому, не повлечет за собой утяжеления аллергических реакций на такие белки, как р-лактоглобулин, а-лактальбумин, as-казеин и другие наиболее значимые [14] аллергены коровьего молока. Вместе с тем вопрос о возможности развития аллергической реакции у ребенка собственно на ЛФ, входящий в состав смеси, в рамках использования данной in vivo модели остается открытым. Простейший способ установить наличие у ЛФ собственных аллергенных свойств - это проведение скрининга перекрестно
реагирующих антител класса 1дЕ к этому белку у пациентов с поливалентной пищевой сенсибилизацией [15], что является предметом дальнейших исследований. Однако уместно отметить, что ЛФ не рассматривается в числе наиболее клинически значимых аллергенов коровьего молока [16], вероятно, это связано с его низким содержанием в сыворотке зрелого молока и, соответственно, смесей на его основе или с низкой резистентностью антигенных структур этого белка к термической инактивации [15]. При этом возможность включения нативного ЛФ в состав гипоаллергенных смесей на основе глубоких гидролизатов белка или аминокислотных смесей, предназначенных для детей с поливалентной пищевой аллергией, в настоящее время не рассматривается даже теоретически.
В случае включения в рацион крыс ГБКМ значимых изменений в тяжести реакции анафилаксии и ответа специфических антител ^ к ОВА также не было выявлено. Стоит отметить, что потребление этого продукта сенсибилизированными животными приводит к возрастанию у них уровня ФНОа при снижении концентрации ИЛ-1а и существенно меньшем, по сравнению с группой ГБКобМ, уровне ИЛ-10. Это может указывать на наличие провоспалительного эффекта веществ, входящих в состав ГБКМ (предположительно, гликопептидов), реализуемого через систему То11-подобных рецепторов определенных субпопуляций ТИ2-хелперных лимфоцитов [17-19]. Тот факт, что эти изменения у животных данной группы не приводили к достоверным изменениям аллергической чувствительности к гетерологичному пищевому аллергену (ОВА), вводимому парентерально, не позволяет исключить возможности возникновения подобных проблем при длительной пероральной экспозиции различными пищевыми белками. В этой связи уместно подчеркнуть, что имеющиеся клинические рекомендации
не предусматривают возможность использования частичного ГБКМ в составе питания пациентов, страдающих тяжелой формой аллергии к белкам коровьего молока. Для этой цели рекомендуются только глубокие гидроли-заты на казеиновой основе или аминокислотные смеси [20]. Однако использование данного частичного гидроли-зата для продуктов с пониженной аллергенностью допустимо и является перспективным направлением.
Включение ГБКобМ в рацион крыс не вызывало у них достоверного изменения тяжести реакции анафилаксии, но сопровождалось снижением ответа антител ^ к ОВА, возрастанием концентрации ИЛ-12(р70) и выраженной тенденцией к увеличению продукции ИЛ-10 при сравнении как с контролем, так и с группой, получавшей ГБКМ. Повышенная продукция ИЛ-10 в данном случае может быть результатом взаимодействия специфических гликопептидов ГБКобМ (по-видимому, отсутствующих в ГБКМ) с различными типами То11-подобных рецепторов дендритных клеток, индуцирующего их специфическое созревание, стимулирующего пролиферацию Т-клеток и созревание Тгед-клеток [17]. Увеличение активности Тгед-клеток и рост уровня ИЛ-10 через сигнальные пути с регуляторным участием То11-подоб-ных рецепторов может подавлять секрецию цитокинов, презентацию антигенов, активацию CD4+-Т-клеток и, как следствие, ограничивать продукцию специфических антител.
Полученный результат указывает на наличие у ГБКобМ, в отличие от ГБКМ, имеющего близкую степень гидролиза и молекулярно-массовое распределе-
Сведения об авторах
ние пептидных фрагментов, определенного потенциала десенсибилизирующего действия, обусловленного видовыми особенностями состава белков молока коровы и лошади, принадлежащих к разным отрядам класса млекопитающих. Это открывает перспективы для разработки и клинических испытаний инновационных гипоал-лергенных продуктов, в том числе смесей - заменителей грудного молока, с использованием ГБКобМ в качестве их белкового компонента.
Заключение
Проведенные исследования показали, что все 3 тестированных белковых ингредиента: ЛФ из коровьего молозива, ГБКМ и ГБКобМ - не увеличивают анафилактическую чувствительность животных на модели системной анафилаксии и могут быть рекомендованы для использования в специализированных пищевых продуктах для детского питания с пониженной аллергенностью, в том числе смесях для искусственного вскармливания детей, не страдающих непереносимостью молока и поливалентной сенсибилизацией. При этом у ГБКобМ выявлен определенный потенциал десенсибилизирующего действия по данным его влияния на продукцию специфических антител к модельному аллергену, цитокинов ИЛ-1а, ИЛ-10, ИЛ-12(р70), что открывает перспективы его использования в гипоаллергенных продуктах, доказательство клинической эффективности которых должно быть предметом отдельного исследования.
Симоненко Елена Сергеевна (Elena S. Simonenko) - научный сотрудник лаборатории технологий продуктов питания детей дошкольного и школьного возраста НИИ детского питания - филиала ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Истра, Московская область, Российская Федерация) E-mail: nir@niidp.ru
https://orcid.org/0000-0002-2878-8069
Симоненко Сергей Владимирович (Sergey V. Simonenko) - доктор технических наук, директор НИИ детского питания - филиала ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Истра, Московская область, Российская Федерация) E-mail: dir@niidp.ru
https://orcid.org/0000-0002-6999-5048 Гмошинский Иван Всеволодович (Ivan V. Gmoshinski) - доктор биологических наук, главный научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: gmosh@ion.ru https://orcid.org/0000-0002-3671-6508
Ригер Николай Александрович (Nikolay A.Riger) - доктор медицинских наук, главный специалист лаборатории иммунологии ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: n_rieger@icloud.com https://orcid.org/0000-0001-7149-2485
Шумакова Антонина Александровна (Antonina A. Shumakova) - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: antonina_sh@list.ru http://orcid.org/0000-0003-1373-4436 Зорин Сергей Николаевич (Sergey N. Zorin) - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории пищевых биотехнологий и специализированных продуктов ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: zorin@ion.ru https://orcid.org/0000-0003-2689-6098
Литература
1. Козлова Е.В., Боровик Т.Э., Звонкова Н.Г., Фисенко А.П., Бушуе-ва Т.В., Скворцова В.А. и др. Нутритивный статус у детей с атопи-ческим дерматитом, обусловленным пищевой аллергией // Педиатрия. Журнал имени Г.Н. Сперанского. 2021. Т. 100, № 2. С. 119— 126. DOI: https://doi.org/10.24110/0031-403X-2021-100-2-119-126
2. Bright D.M., Stegall H.L., Slawson D.C. Food allergies: diagnosis, treatment, and prevention // Am. Fam. Physician. 2023. Vol. 108, N 2. P. 159—165.
3. D'Auria E., Salvatore S., Acunzo M., Peroni D., Pendezza E., Di Pro-fio E. et al. Hydrolysed formulas in the management of cow's milk allergy: new insights, pitfalls and tips // Nutrients. 2021. Vol. 13, N 8. P. 2762. DOI: https://doi.org/10.3390/nu13082762
4. Musaev A., Sadykova S., Anambayeva A., Saizhanova M., Balka-nay G., Kolbaev M. Mare's milk: composition, properties, and application in medicine // Arch. Razi Inst. 2021. Vol. 76, N 4. P. 1125-1135. DOI: https://doi.org/10.22092/ari.2021.355834.1725
5. Ke C., Lan Z., Hua L., Ying Z., Humina X., Jia S. et al. Iron metabolism in infants: influence of bovine lactoferrin from iron-fortified formula // Nutrition. 2015. Vol. 31, N 2. P. 304-309. DOI: https://doi. org/10.1016/j.nut.2014.07.006
6. Chichlowski M., Bokulich N., Harris C.L., Wampler J.L., Li F., Ber-seth C.L. et al. Effect of bovine milk fat globule membrane and lactoferrin in infant formula on gut microbiome and metabolome at 4 months of age // Curr. Dev. Nutr. 2021. Vol. 5, N 5. Article ID nzab027. DOI: https://doi.org/10.1093/cdn/nzab027
7. Bjormsjo M., Hernell O., Lonnerdal B., Berglund S.K. Immuno-logical effects of adding bovine lactoferrin and reducing iron in infant formula: a randomized controlled trial // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 2022. Vol. 74, N 3. P. e65-e72. DOI: https://doi.org/10.1097/ MPG.0000000000003367
8. Colombo J., Harris C.L., Wampler J.L., Zhuang W., Shaddy D.J., Liu B.Y. et al. Improved neurodevelopmental outcomes at 5.5 years of age in children who received bovine milk fat globule membrane and lactoferrin in infant formula through 12 months: a randomized controlled trial // J. Pediatr. 2023. Vol. 261. Article ID 113483. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jpeds.2023.113483
9. Lalles J.P., Dreau D., Salmon H., Toullec R. Identification of soyabean allergens and immune mechanisms of dietary sensitivities in prerumi-nant calves // Res. Vet. Sci. 1996. Vol. 60, N 2. P. 111-116. DOI: https:// doi.org/10.1016/s0034-5288(96)90003-x
10. Шатерников В.А. Роль пищевых белков в иммунологических и аллергических реакциях // Вестник АМН СССР. 1986. № 11. С. 34-39.
11. Aiuti F., Paganelli R. Food allergy and gastrointestinal diseases // Ann. Allergy. 1983. Vol. 51, N 2. Pt 2. P. 275-280.
12. Kazemi S., Danisman E., Epstein M.M. Animal models for the study of food allergies // Curr. Protoc. 2023. Vol. 3, N 3. P. e685. DOI: https:// doi.org/10.1002/cpz1.685
13. Мурашев А.Н., Коршунов В.А., Хохлова О.Н., Ржевский Д.И., Гмошинский И.В., Лысиков Ю.А. и др. Количественная характеристика модели системной анафилаксии у крыс линии Спрейг-Доули // Российский физиологический журнал имени И.М. Сеченова. 2000. Т. 86, № 2. С. 190-195.
14. Jensen S.A., Fiocchi A., Baars T., Jordakieva G., Nowak-Wegrzyn A., Pali-Scholl I. et al. Diagnosis and rationale for action against cow's milk allergy (DRACMA) guidelines update — III — cow's milk allergens and mechanisms triggering immune activation // World Allergy Organ. J. 2022. Vol. 15, N 9. Article ID 100668. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.waojou.2022.100668
15. Kamath S.D., Bublin M., Kitamura K., Matsui T., Ito K., Lopata A.L. Cross-reactive epitopes and their role in food allergy // J. Allergy Clin. Immunol. 2023. Vol. 151, N 5. P. 1178—1190. DOI: https://doi. org/10.1016/j.jaci.2022.12.827
16. Villa C., Costa J., Oliveira M., Mafra I. Bovine milk allergens: a comprehensive review // Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. 2018. Vol. 17, N 1. P. 137—164. DOI: https://doi.org/10.1111/1541-4337.12318
17. Losada Méndez J., Palomares F., Gómez F., Ramírez-López P., Ramos-Soriano J., Torres M.J. et al. Immunomodulatory response of Toll-like receptor ligand-peptide conjugates in food allergy // ACS Chem. Biol. 2021. Vol. 16, N 11. P. 2651—2664. DOI: https://doi. org/10.1021/acschembio.1c00765
18. Zhu Q., Wang J., Ma J., Sheng X., Li F. Changes in inflammatory factors in the Brown Norway rat model of food allergy // BMC Immunol. 2021. Vol. 22, N 1. P. 8. DOI: https://doi.org/10.1186/s12865-021-00398-9
19. Figueroa-Lozano S., Valk-Weeber R.L., Akkerman R. Abdulahad W., van Leeuwen S.S., Dij khuizen L. et al. Inhibitory effects of dietary N-glycans from bovine lactoferrin on Toll-like receptor 8; comparing efficacy with chloroquine // Front. Immunol. 2020. Vol. 11. P. 790. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.00790
20. Боровик Т.Э., Макарова С.Г., Дарчия С.Н., Гамалеева А.В. Роль смесей — гидролизатов белка в профилактике и диетотерапии пищевой аллергии у детей раннего возраста // Вопросы современной педиатрии. 2010. Т. 9, № 1. С. 150—156.
References
1. Kozlova E.V., Borovik T.E., Zvonkova N.G., Fisenko A.P., Bushueva T.V., Skvortsova V.A., et al. Nutritional status in children with atopic dermatitis caused by food allergies. Pediatriya. Zhurnal imeni G.N. Speran-skogo [Pediatrics. Journal named after G.N. Speransky]. 2021; 100 (2): 119-26. DOI: https://doi.org/10.24110/0031-403X-2021-100-2-119-126 (in Russian)
2. Bright D.M., Stegall H.L., Slawson D.C. Food allergies: diagnosis, treatment, and prevention. Am Fam Physician. 2023; 108 (2): 159-65.
3. D'Auria E., Salvatore S., Acunzo M., Peroni D., Pendezza E., Di Profio E., et al. Hydrolysed formulas in the management of cow's milk allergy: new insights, pitfalls and tips. Nutrients. 2021; 13 (8): 2762. DOI: https:// doi.org/10.3390/nu13082762
4. Musaev A., Sadykova S., Anambayeva A., Saizhanova M., Balkanay G., Kolbaev M. Mare's milk: composition, properties, and application in medicine. Arch Razi Inst. 2021; 76 (4): 1125-35. DOI: https://doi. org/10.22092/ari.2021.355834.1725
5. Ke C., Lan Z., Hua L., Ying Z., Humina X., Jia S., et al. Iron metabolism in infants: influence of bovine lactoferrin from iron-fortified formula. Nutrition. 2015; 31 (2): 304-9. DOI: https://doi.org/10.1016/j. nut.2014.07.006
6. Chichlowski M., Bokulich N., Harris C.L., Wampler J.L., Li F., Berseth C.L., et al. Effect of bovine milk fat globule membrane and lactoferrin in infant formula on gut microbiome and metabolome at 4 months of age. Curr Dev Nutr. 2021; 5 (5): nzab027. DOI: https://doi.org/10.1093/cdn/ nzab027
7. Björmsjö M., Hernell O., Lönnerdal B., Berglund S.K. Immunological effects of adding bovine lactoferrin and reducing iron in infant formula: a randomized controlled trial. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2022; 74 (3): e65-72. DOI: https://doi.org/10.1097/MPG.0000000000003367
8. Colombo J., Harris C.L., Wampler J.L., Zhuang W., Shaddy D.J., Liu B.Y., et al. Improved neurodevelopmental outcomes at 5.5 years of age in children who received bovine milk fat globule membrane and lacto-ferrin in infant formula through 12 months: a randomized controlled trial. J Pediatr. 2023; 261: 113483. DOI: https://doi.org/10.1016/j. jpeds.2023.113483
9. Lalles J.P., Dreau D., Salmon H., Toullec R. Identification of soyabean allergens and immune mechanisms of dietary sensitivities in preruminant calves. Res Vet Sci. 1996; 60 (2): 111-6. DOI: https://doi.org/10.1016/ s0034-5288(96)90003-x
10. Shaternikov V.A. The role of food proteins in immunological and allergic reactions. Vestnik AMN SSSR [Bulletin of the USSR Academy of Medical Sciences]. 1986; (11): 34—9. (in Russian)
11. Aiuti F., Paganelli R. Food allergy and gastrointestinal diseases. Ann Allergy. 1983; 51 (2 pt 2): 275—80.
12. Kazemi S., Danisman E., Epstein M.M. Animal models for the study of food allergies. Curr Protoc. 2023; 3 (3): e685. DOI: https://doi. org/10.1002/cpz1.685
13. Murashev A.N., Korshunov V.A., Khokhlova O.N., Rzhevsky D.I., Gmoshinsky I.V., Lysikov Yu.A., et al. Quantitative characteristics of the systemic anaphylaxis model in Sprague-Dawley rats. Rossiyskiy fizio-logicheskiy zhurnal imeni I.M. Sechenova [Russian Journal of Physiology named after I.M. Sechenov]. 2000; 86 (2): 190—5. (in Russian)
14. Jensen S.A., Fiocchi A., Baars T., Jordakieva G., Nowak-Wegrzyn A., Pali-Scholl I., et al. Diagnosis and rationale for action against cow's milk allergy (DRACMA) guidelines update — III — cow's milk allergens and mechanisms triggering immune activation. World Allergy Organ J. 2022;
15 (9): 100668. DOI: https://doi.org/10.1016/j.waojou.2022.100668
15. Kamath S.D., Bublin M., Kitamura K., Matsui T., Ito K., Lopata A.L. Cross-reactive epitopes and their role in food allergy. J Allergy Clin Immunol. 2023; 151 (5): 1178—90. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jaci.2022.12.827
16. Villa C., Costa J., Oliveira M., Mafra I. Bovine milk allergens: a comprehensive review. Compr Rev Food Sci Food Saf. 2018; 17 (1): 137—64. DOI: https://doi.org/10.1111/1541-4337.12318
17. Losada Méndez J., Palomares F., Gómez F., Ramírez-López P., Ramos-Soriano J., Torres M.J., et al. Immunomodulatory response of Toll-like receptor ligand-peptide conjugates in food allergy. ACS Chem Biol. 2021;
16 (11): 2651—64. DOI: https://doi.org/10.1021/acschembio.1c00765
18. Zhu Q., Wang J., Ma J., Sheng X., Li F. Changes in inflammatory factors in the Brown Norway rat model of food allergy. BMC Immunol. 2021; 22 (1): 8. DOI: https://doi.org/10.1186/s12865-021-00398-9
19. Figueroa-Lozano S., Valk-Weeber R.L., Akkerman R. Abdulahad W., van Leeuwen S.S., Di khuizen L., et al. Inhibitory effects of dietary N-glycans from bovine lactoferrin on Toll-like receptor 8; comparing efficacy with chloroquine. Front Immunol. 2020; 11: 790. DOI: https:// doi.org/10.3389/fimmu.2020.00790
20. Borovik T.E, Makarova S.G., Darchiya S.N., Gamaleyeva A.V. The role of compounds based on hydrolyzed protein in prophylaxis and diet treatment of alimentary allergy in infants. Voprosy sovremennoy pediatrii [Problems of Modern Pediatrics]. 2010; 9 (1): 150—6. (in Russian)
