CC BY
61УДК 582.284:57.083.13:678.048
ИЗУЧЕНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ МИЦЕЛИЯ БАЗИДИОМИЦЕТА PHALLUS IMPUDICUS (ВЕСЕЛКА ОБЫКНОВЕННАЯ)
Ананьева Е.П. (зав. кафедрой)*, Турина с.В. (доцент кафедры микробиологии), Алексеева Г.М. (доцент кафедры аналитической химии)
Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия (кафедры микробиологии и аналитической химии), Россия
© Коллектив авторов, 2014
Подобраны условия глубинного культивирования базидио-мицета Phallus impudicus Linnaeus, 1753: Persoon 1801, штамм 0781. Установлено, что в модифицированной среде с повышенным содержанием источников углерода и азота выход биомассы мицелия увеличивался на 50%. Изучен углеводный состав мицелия, основным компонентом которого является глюкоза (47,0%), а также обнаружены значительные количества маннозы (24,0%) и галактозы (18,4%). Показано, что водные и водно-спиртовые извлечения мицелия Phallus impudicus обладают антиоксидантной активностью, причем более активным было водное извлечение.
Ключевые слова: антиоксидантная активность, базидиомице-ты, глубинное культивирование, мицелий
STUDY OF CULTIVATION CONDITIONS AND ANTIOХYDANT ACTIVITY OF BASIDIOMYCET PHALLUS IMPUDICUS (FUNGUS-FUN ORDINARY)
Ananjeva E.P. (head of the chair), Gurina S.V. (associate professor of the chair), Alekseeva G.M. (associate professor of the chair)
State Chemico-Pharmaceutical Academy (chairs of microbiology and analytical chemistry), St. Petersburg, Russia
© Collective of authors, 2014
The conditions of biomass mycelium production by Phallus impudicus Linnaeus, 1753: Persoon 1801, strain 0781 have been studied. It was found that biomass mycelium production increased (on 50%) in modified cultural medium with increased content of carbon
* Контактное лицо: Ананьева Елена Петровна, e-mail: [email protected]
and nitrogen sources. The carbohydrate composition of mycelium was investigated. The main component of mycelium appeared to be glucose (47,0%), and also it was found a significant amounts of mannose (24,0%) and galactose (18,4%). It was shown an antioxidant activity of aqueous and aqueous-alcohol extracts from mycelium. The aqueous extracts manifestated more higher activity then aqueous-alcohol extracts.
Key words: antioxidant activity, basidiomycetes, immersed cultivation, mycelium
ВВЕДЕНИЕ
Высшие базидиальные грибы известны как продуценты ряда ценных биологически активных веществ, используемых в качестве лечебно-профилактических средств. Известно, что метаболиты Phallus impudicus (веселки обыкновенной) оказывают противоопухолевое и антимикробное действие, способствуют снижению холестерина, обладают ра-нозаживляющим действием. В народной медицине применяют экстракты плодовых тел веселки обыкновенной [1]. Благодаря развитию биотехнологии стало возможным выращивание базидиомицетов в глубинной периодической культуре.
Цель работы - изучение особенностей глубинного культивирования P. impudicus для накопления биомассы мицелия и сравнительная оценка антиок-сидантной активности метаболитов мицелия этого базидиомицета.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объекта исследования использовали P impudicus Linnaeus, 1753: Persoon 1801, штамм 0781 из коллекции культур Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН (г. Санкт-Петербург).
На плотной питательной среде культура образовывала колонии с хорошо развитым пушистым, войлочным воздушным мицелием. Колония белого цвета, с бахромчатым краем (поднимающимся) и неровной внешней линией. Субстратные нити мицелия не окрашены. Запах слабый, неопределенный. При микроскопии гриба были найдены ветвящиеся тонкостенные гифы шириной 2,5-5,0 мкм, с пряжками. Можно видеть прорастающие пряжки и анастомозы. При выращивании в жидкой питательной среде гриб образует пеллеты (шарообразные скопления мицелия диаметром 2-3 мм и более).
Мицелий тест-культуры получали методом глубинного культивирования в жидкой глюкозопеп-тонной среде (ГПС) [2] и жидком сусле, содержащем 7,5% углеводов.
Культуру выращивали на лабораторной «круговой» качалке при 120 об/мин. при t = 24 оС в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл. В качестве исходного посевного материала использовали штамм P. impudicus, выращенный на скошенном сусло-агаре в течение 3-4 суток. Затем 10 мл посевного материала переносили в ферментационные колбы, содержащие 150 мл среды. Ферментацию проводили в течение 9 суток.
Мицелий из культуральной жидкости отделяли фильтрованием с последующим обезвоживанием
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МИКОЛОГИЯ
биомассы этанолом и высушиванием при 24 оС.
Качественный моносахаридный состав мицелия устанавливали методом тонкослойной хроматографии, количественный анализ - методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) триметилсилильных (ТМС) производных углеводов, полученных из мицелия [2] .
Для определения антиоксидантной активности Р 1трий1сш культивировали в ГПС в течение 6 суток. Нативную культуральную жидкость фильтровали. Водные и водно-спиртовые извлечения получали из сухой биомассы мицелия. Для получения водной фракции к измельченной в фарфоровой ступке биомассе мицелия добавляли воду в соотношении 1: 10, выдерживали на водяной бане 2 часа при 80-90 оС при перемешивании. Для получения водно-спиртового извлечения измельченную биомассу мицелия и 40% этанол смешивали в соотношении 1:10, выдерживали в термостате 2 часа при 36 оС при перемешивании.
Антиоксидантную активность (АОА) извлечений мицелия определяли по методике кулонометриче-ского титрования электрогенерированным бромом [3]. Для этого использовали специальную установку, в которой осуществляют моделирование окислительного стресса и оценивают способность объекта проявлять АОА (за единицу принимают количество электричества - Q, расходуемого на окисление 100 мл анализируемого раствора). Время конца титрования фиксируют с помощью секундомера при появлении скачка потенциала. АОА вычисляли по уравнению:
Q = i х t / 10х^ где
Q - антиоксидантная активность объекта, Кл/100 мл;
1 - сила тока в цепи, мА;
1 - время анализа, с;
V - объем титранта, мл.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для изучения процесса культивирования Р. т-риШсш в качестве базовой питательной среды использовали синтетическую глюкозопептонную среду (ГПС), а также естественную среду - жидкое сусло, содержащее 7,5% сахаров.
Биомассу гриба в жидком сусле накапливали в течение 14 суток и более, при этом выход биомассы мицелия не превышал 4 г/л. В ГПС гриб начинал активно расти с третьих суток с достижением максимального накопления биомассы к 6-7 суткам. Для дальнейших исследований была выбрана глюкозо-пептонная среда, обеспечивающая более быстрый рост культуры и, в отличие от жидкого сусла, имеющая постоянный определенный компонентный состав (особенно - по источнику углерода), что необходимо для стандартизации условий культивирования и получения конечного продукта с постоянными характеристиками.
В процессе роста базидиомицета в стандартной
ГПС изучали некоторые биохимические показатели: скорость утилизации источников углерода и азота, интенсивность накопления биомассы, изменение рН среды.
Установлено, что в течение первых 3-х суток культивирования концентрация источника углерода значительно уменьшалась - от 10 до 2,7 мг/мл. К шестым суткам глюкоза в среде практически полностью утилизировалась (Рис. 1).
Рис. 1. Динамика утилизации источника углерода Р. ¡три/Лсиз
При изучении динамики утилизации источника азота в процессе выращивания гриба содержание аминного азота в среде постепенно снижалось до 7 суток, что коррелировало с активным ростом биомассы мицелия.
В течение первых трех суток культивирования ба-зидиомицета значение рН культуральной жидкости значительно снижалось - от 5,5 до 3,2, сохраняясь на этом уровне в последующие трое суток, а затем - постепенно возрастало до 4,5. Повышение рН среды, вероятно, связано с образованием аминов, содержащих основные группы, в результате декарбоксилиро-вания аминокислот культурой.
При изучении динамики изменения биомассы в процессе культивирования Р. ШриШсш активное накопление мицелия начиналось с третьих суток и сопровождалось значительным уменьшением содержания глюкозы и азота в среде. Максимальный выход биомассы (5,3 г/л) наблюдали на шестые сутки культивирования. С седьмых по девятые сутки ее количество оставалось постоянным. При этом в среде практически не обнаруживали глюкозы, и оставалось незначительное количество азота
С целью повышения интенсивности накопления биомассы мицелия, Р. ШриШсш варьировали концентрации источников азота, пептона и дрожжевого экстракта, а также источника углерода.
Установили прямую зависимость накопления биомассы от концентрации глюкозы (в диапазоне от 5 до 15 г/л), при этом выход биомассы увеличивался на 25- 30% (Рис.2).
Масса <v*ero w нц»чич. г/л
7
0123*56749 10 еутни
Рис. 2. Динамика накопления биомассы мицелия Р. ¡три/Лсиз
При изучении влияния источников азота на выход биомассы мицелия в экспериментах последовательно изменяли концентрации пептона от 2,5 до 4,5 г/л; это приводило к заметному повышению интенсивности накопления биомассы, при этом выход возрастал на 30%. При увеличении концентрации пептона с 3,5 до 4,5 г/л выход мицелия был практически одинаковым, поэтому в модифицированную среду вносили 3,5 г/л пептона.
Таким образом, модифицированная ГПС содержала: 3,5 г/л пептона, 2 г/л дрожжевого экстракта и 15 г/л глюкозы.
При культивировании Р. impudicus в модифицированной ГПС выход биомассы мицелия составил 8,8±0,3 г/л, что на 50% превышало выход мицелия в стандартных условиях.
В образцах мицелия гриба определяли содержание углеводов, белка и минеральных примесей.
В мицелии обнаружили 45% углеводов, достаточно высокое содержание белка - 15,0% и незначительное количество минеральных примесей. Низкое значение количества редуцирующих сахаров в гидроли-затах мицелия может быть связано с содержанием большого количества хитина, который плохо подвергается гидролизу.
Количественный анализ моносахаридного состава проводили методом ГЖХ. Выявили, что полисахариды мицелия состояли из глюкозы (47,0%), маннозы (24,0%), галактозы (18,4%), ксилозы (9,4%) и следовых количеств фукозы (0,8%).
Антиоксидантную активность метаболитов Р. impudicus определяли в водных, водно-спиртовых извлечениях и в нативном растворе. В качестве пре-
парата сравнения был выбран 0,05% раствор рутина. Рутин относят к витаминам группы Р, он содержит комплекс биофлавоноидов, обладающих антиокси-дантными свойствами.
Установлено, что изучаемые экстракты мицелия обладали антиоксидантной активностью. Более выраженную АОА проявляли фракции водных извлечений по сравнению с водно-спиртовыми. Значения показателей АОА водных извлечений превышали уровень контроля (раствора рутина) в 1,5 раза. Анти-оксидантная активность нативного раствора оказалась ниже контрольного значения (Рис. 3).
Рис. 3. Антиоксидантная активность извлечений мицелия и нативного раствора Phallus impudicus; 1 - АОА рутина, 2 -водного извлечения, 3 - спиртового извлечения, 4 - нативного раствора
Таким образом, АОА исследованных фракций мицелия P. impudicus сопоставима с активностью препарата сравнения рутина.
ВЫВОДЫ
1. Установлена возможность накопления биомассы мицелия базидиомицета P. impudicus при глубинном выращивании в глюкозо-пептонной среде стандартного состава. Выход биомассы достигал максимума к 7 суткам при полной утилизации культурой источников углерода и азота.
2. Показано, что при культивировании P. impudicus в модифицированной глюкозо-пептонной среде выход биомассы мицелия возрастал на 50%.
3. Установлено, что водные и водно-спиртовые извлечения мицелия и нативный раствор P. impudicus обладают выраженной антиоксидантной активностью.
АОА, КЛ/100МЛ
ЫИ ISO 400 350
Iii.
1 г 1 *
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Заикина Н.А. Коваленко А.Е. и др. Основы биотехнологии высших грибов.- СПб.: Проспект науки, 2007. - 315 с.
2. Кожемякина Н.В., Ананьева Е.П., Гурина С.В. Условия культивирования, состав и биологическая активность мицелия Flamulina velutipes (Fr/). P.Karst. // Прикл. биохим. и микробиол.- 2010.- №5.- С. 583-586.
3. Алексеева Г.М., Смола Е.И., Поляков Л.В. Разработка методики кулонометрического определения антиоксидантной активности лекарственных водно-спиртовых экстрактов // Мат. Межд. научно-практ. конф. «Наука и образование». - 2005.- часть V. - С. 90.
Поступила в редакцию журнала 11.07.2014 << ¡г
Рецензент: Н.П. Блинов
