CC BY
38-УДК 616.992:617.017.1
ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИЦЕЛИЯ ЕОМЕБ РОМЕИТАШи£ (Ь.:ЕК.)
И ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ НЕГО УГЛЕВОДНЫХ ФРАКЦИЙ
Кожемякина Н.В. (ассистент кафедры микробиологии)**, Ананьева Е.П. (доцент кафедры микробиологии), Турина С.В. (доцент кафедры микробиологии)
Санкт-Петербургская государственная химикофармацевтическая академия (СПХФА), Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов, 2010
Изучены особенности роста базидиомицета РотеБ fomentarius в условиях глубинного культивирования. Из мицелия выделены растворимая и нерастворимая полисахаридные фракции, изучен их состав. Основным углеводным компонентом фракций являлась глюкоза (44,7-65,7%), также были обнаружены значительные количества галактозы (13,2-20,2%) и маннозы (18,6-29,5%). Установлено, что мицелий гриба при пероральном введении и выделенные из него фракции при внутрибрюшинном введении оказывали стимулирующее действие на функциональную активность клеток системы мононуклеарных фагоцитов, причем более выраженный активирующий эффект на макрофаги оказывала растворимая углеводная фракция.
Ключевые слова: базидиомицеты, гликаны, глубинный мицелий, перитонеальные макрофаги, система мононуклеарных фагоцитов
THE STUDY OF IMMUNOBIOLOGICAL ACTIVITY OF CULTIVATED MYCELIUM AND POLYSACCHARIDES FROM FOMES FOMENTARIUS (L,:FR,) FR.
Kozchemyakina N.V. (assistant of microbiology chair), Ananjeva E.P. (associate professor of microbiology chair), Gurina S.V. (associate professor of microbiology chair)
* Контактное лицо: Кожемякина Наталья Владимировна
Тел.: 8-921-572-48-95
Department of Microbiology, St.-Petersburg State Chemical-Pharmaceutical Academy, St. Petersburg,
Russia
© Collective of authors, 2010
Mushrooms have used as a source of therapeutic agents, adaptogens, immunostimulants or health food supplement. The strain of higher Basidiomycetes F. fomentarius (L.: Fr.) Fr. was the object of research. The dynamics of utilization feed elements and accumulation biomass were studied. The soluble and insoluble fractions were isolated from mycelium. The composition of cultured mycelium and aqueous extracts from mycelium has been studied. The objects mainly contained carbohydrates (74,0% and 82,% in insoluble and soluble fractions accordingly, mycelium - 66,2%), 1,0% -10,0% proteins infractions and 13,0% in mycelium and an insignificant amount of mineral substances. The main carbohydrate component of fractions was glucose (44,7% and 65,7%), it also contained galactose, mannose and an insignificant amount offucose and xylose. The aqueous extracts and mycelium have been shown to have immune modulating activity. They have had a stimulative effect in functional activity of macrophages - central cells of reticuloendothelial system. Soluble fraction has had more strongly pronounced effect then insoluble fraction.
Key words: basidiomycetes, carbohydrate, stimulative effect, immune modulating activity, macrophage, reticuloendothelial system.
ВВЕДЕНИЕ
Применение антибиотиков широкого спектра действия, цитостатиков, иммунодепрессантов, гормонов и других лекарственных средств нередко сопровождается развитием иммунологической недостаточности организма, с другой стороны, ухудшение экологической обстановки, падение уровня жизни людей способствуют снижению устойчивости макроорганизма к воздействию неблагоприятных внешних факторов и могут приводить к нарушению функций иммунной системы. В последние годы возрос интерес к получению иммуномодуляторов и адаптогенов на основе природных соединений, в том числе получаемых из грибов-базидиомицетов [1]. Биологическая активность базидиальных грибов определяется присутствием в их мицелии ряда компонентов, важнейшими из которых являются полисахариды [1,2]. Существенное достоинство грибных гликанов заключается в отсутствии токсичности и повреждающего действия на органы и ткани макроорганизма, при этом они способны оказывать стимулирующее влияние на различные звенья иммунитета и корректировать патологические изменения функциональной активности компонентов иммунной системы, приводя их к норме [1,2]. Таким образом, в настоящее время актуальным является всестороннее исследование новых представителей базидиоми-цетов с целью получения препаратов с иммуномодулирующей активностью на основе их мицелия и выделенных из него углеводных полимеров.
Цель настоящей работы — изучение особенностей роста базидиомицета £ fomentarius в глубинных условиях, выделение и характеристика углеводных фракций мицелия, исследование иммунобиологической активности мицелия гриба и его углеводных компонентов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объекта исследования использовали базидиомицет Е /отеМапш. На плотной питательной среде гриб образовывал плоские колонии, в центре пигментированные (пигмент желто-бежевого цвета), со слабо развитым воздушным мицелием. Скорость роста мицелия при температуре 24 °С составляла, в среднем, 2,0 мм/сут. При микроскопии культуры на септированном мицелии обнаружили пряжки, характерные для холобазидиомицетов. При культивировании в жидких питательных средах в динамических условиях культура росла в виде пеллет диаметром 2-4 мм.
Мицелий получали методом глубинного культивирования в глюкозо-пептонной среде в течение 14 суток при 24 °С в динамических условиях. В качестве посевного материала использовали 4-х суточный инокулят глубинной культуры, выращенный на той же среде, в количестве 10% по объёму. Углеводные фракции выделяли водной экстракцией измельченного мицелия гриба при 100 °С в течение 8 часов. Осадок и супернатант разделяли центрифугированием (5000 15 мин). Осадок, который в дальнейшем обо-
значали как нерастворимую фракцию (НФр), обрабатывали спиртом и ацетоном. Супернатант упаривали в 2 раза, полисахарид (РФр) осаждали двумя объемами 96° этилового спирта, отделяли центрифугированием (5000 g, 15 мин), промывали ацетоном и сушили при комнатной температуре [3]. Для изучения биохимических особенностей роста гриба оценивали содержание редуцирующих веществ и а-аминного азота в культуральной жидкости [4, 5]. В гидролизатах полученных фракций определяли содержание редуцирующих веществ [5], белка - по методу Лоури, минеральных примесей - методом сухого озоления, соотношение и тип гликозидных связей - методом перйодатного окисления [5]. С помощью автоматического поляриметра Рег1ап-Е1тег-241 определяли показатели удельного вращения растворимой полисахаридной фракции мицелия. Кислотный гидролиз образцов проводили 8Н раствором серной кислоты в течение 1 часа при кипячении. Качественный мо-носахаридный состав гидролизата мицелия определяли с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках «Силуфол» (8Пи(о1) в системе 40:49:10:1 (н-бутанол : вода : этанол : аммиак), количественный моносахаридный состав - методом ГЖХ в виде триметилсилильных (ТМС) производных сахаров на колонке НР-5 (БЕ-54) 30 ш * 0,25 шш * 0,25 шкш. В качестве свидетелей использовали растворы моносахаридов: глюкозы, ксилозы, маннозы, галактозы, фукозы, арабинозы, рамнозы, галактуроновой и глю-куроновой кислот [6]. ИК-спектры поглощения фракций снимали на инфракрасном Фурье-спектрометре «ФСМ 1201».
Иммунобиологическое действие мицелия гриба и выделенных из него полисахаридных фракций изучали по их влиянию на показатели функциональ-
ной активности перитонеальных макрофагов белых мышей, отражающие стадии фагоцитоза: хемотаксис, распластывание фагоцитов на стекле, их микро-боцидность по отношению к клеткам Staphylococcus aureus и поглотительную способность в отношении убитых нагреванием клеток Candida albicans. Для оценки действия препаратов использовали переживающую культуру перитонеальных макрофагов белых мышей. Углеводные фракции вводили мышам однократно внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг, мицелий гриба - перорально через зонд в дозе 70 мг/кг в течение 10 суток, контрольной группе мышей вводили стерильный физиологический раствор в объеме 1 мл. Макрофаги получали из перитонеальной полости мышей промыванием средой 199, содержащей 20% сыворотки крупного рогатого скота и гепарин в концентрации 5 Ед/мл (pH среды 7,7). Клетки культивировали в монослое в течение 2 суток и затем оценивали их морфофункциональные изменения [7].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Динамику накопления биомассы гриба изучали в течение 14 суток, регистрируя изменение биомассы мицелия, потребление источников углерода и азота (Рис.1, 2). В течение первых 4-х суток культивирования происходило незначительное потребление грибом источников углерода и азота. Резкое уменьшение содержания глюкозы в среде (в 8 раз) наблюдали на 5-е сутки, аминного азота (в 4 раза) - к 4-м суткам культивирования.
N, мг/мл
Сутки
N - концентрация а-аминного азота С, мг/мл
Сутки
С- концентрация сахаров Рис. 1. Динамика утилизации источников углерода и аминного азота в процессе культивирования Fomes fomentarius
Б, г/л
Сутки
Рис. 2. Динамика накопления биомассы Е Ьте^апи$
Активное накопление биомассы мицелия происходило с 2-х по 8-е сутки ферментации, а на 9-10-е и последующие сутки количество биомассы практически не изменялось. Максимальная продуктивность мицелия Е /отеМапш составила 1,0 г/л сут. К 10-м суткам происходила почти полная утилизация культурой питательных веществ, концентрация остаточного сахара в среде не превышала 0,1 мг/мл, остаточного аминного азота - 0,05 мг/мл. На основании полученных результатов было предложено сокращение сроков культивирования исследуемого базидиоми-цета с 14 до 10 суток.
Из полученного в процессе культивирования мицелия гриба были выделены растворимая (РФр) и нерастворимая (НФр) углеводные фракции. Фракции содержали от 74 до 82,5% сахаров, в исходном мицелии количество редуцирующих веществ не превышало 66%. Отмечали высокое содержание белка в мицелии и НФр (10-13%), в РФр его количество снижалось до 1% от сухой массы вещества. Содержание минеральных примесей в исследуемых образцах было незначительным (табл. 1). В результате качественного анализа моносахаридного состава было установлено, что в гидролизатах мицелия основным компонентом являлась глюкоза, при этом на хроматограммах отмечали следовые количества маннозы и галактозы. Для выделенных фракций был определен количественный моносахаридный состав (табл. 1).
Таблица 1.
Характеристика химического состава мицелия и
углеводных фракций Fomes fomentarius
Образец РВ, % Белок, % Золь- ность, % Моносахаридный состав, %
глюко- за кси- лоза ман- ноза га-лак- тоза фу-коза
Мицелий* 66,2 13,0 1,8 + следы следы следы следы
РФр 82,5 1,0 0,3 44,7 3,3 29,5 20,2 2,3
НФр 74,0 10,0 0,6 65,7 1,7 18,6 13,2 0,8
РВ — редуцирующие вещества
*В мицелии определяли только качественный моносахаридный состав.
Содержание глюкозы в растворимой фракции было практически на 20% ниже, чем в нерастворимой, при этом в гидролизате РФр были обнаружены значительные количества маннозы (29,5%) и галактозы (20,2%), а также следовые количества ксилозы и фукозы. Вероятно, растворимая фракция представляла собой смесь гетерогликанов, отличающихся
по молекулярной массе и состоящих из глюкозных, маннозных и галактозных остатков.
Было установлено соотношение гликозидных связей в полученных фракциях. Растворимая фракция содержала различные типы гликозидных связей (48% — 1ч>3, 33% — 1—>4; 1ч>2, 19% — 1ч>6 связей). Следует отметить высокое содержание 1—>3- (50%) и 1—>4-гликозидных связей (32%) в нерастворимой фракции. Известно, что у высших грибов в клеточной стенке содержится хитин, ковалентно связанный с (j-( 1 —>3)-І.)-глюканами [8]. На ИК-спектре НФр отмечали полосы поглощения, характерные для ацета-мидной группы хитина, что подтверждало его присутствие во фракции, поэтому можно предположить, что НФр представляла собой хитин-глюкановый комплекс. Значение показателя удельного вращения растворимой полисахаридной фракции мицелия (+31°) позволило сделать предположение о наличии в изучаемом образце как а-, так и ß-гликозидных связей, наличие которых также подтверждено результатами проведенной ИК-спектроскопии. Известно, что полосы 940-945 см'1 и 850-860 см'1 однозначно указывают на а-аномерное связывание глюкопиранозных колец, плечо при 890-900 см'1 соответствует наличию ß-связей [9]. На ИК-спектрах фракций были обнаружены пики, лежащие в областях 850 и 890-900 см1, следовательно, можно считать, что в образцах присутствовали как а-, так и ß-связи.
Иммунобиологическую активность углеводных фракций определяли по их влиянию на функции перитонеальных макрофагов белых мышей. Макрофаги являются зрелыми клетками системы мононуклеар-ных фагоцитов - важнейшего компонента иммунной системы, участвующими в реализации механизмов врожденного и приобретенного иммунитета. Под влиянием выделенных полисахаридов усиливалась хемотаксическая активность макрофагов в 1,7-3,2 раза по сравнению с контролем. Пластичность цитоплазматической мембраны (способность к распластыванию на стекле) повышалась в 2,0-2,4 раза (Рис. 3). Указанные функции отражают начальные стадии фагоцитоза, за которыми следуют микробоцидность и поглощение объектов фагоцитоза. Микробоцид-ные функции макрофагов под влиянием гликанов оценивали по отношению к S. aureus. Сравнивали выживаемость клеток S. aureus при контакте со стимулированными полисахаридами макрофагами и макрофагами, полученными от контрольной группы. Исследуемые гликаны достоверно повышали микро-боцидный эффект макрофагов в 2,7-3,0 раза по сравнению с контролем (Рис.З). При оценке интенсивности поглотительной способности макрофагов в отношении убитых нагреванием клеток С. albicans под действием исследуемых гликанов было установлено, что процент фагоцитирущих клеток после введения фракций возрастал в 2,1-2,3 раза по сравнению с контролем.
3,5 s 3
S
=г 2 5
го
ш
I 2‘
т 1 5'
и 1 ’э
X
<и 1 ..
ч: 1
= 0,5
0
■ РФр ПНФр □ Биомасса
1 2 3
4
1. Хемотаксис
2. Распластывание на стекле
3. Микробоцидность
4. Поглотительная способность
Рис. 3. Влияние мицелия гриба F. fomentarius и выделенных из него углеводных фракций на показатели функциональной активности макрофагов.
Действие НФр и РФр на функции макрофагов изучали в динамике в течение 10 суток после их однократного введения. Изучаемые полисахаридные фракции достоверно стимулировали функциональную активность макрофагов в течение всего срока наблюдения, причём можно отметить максимум стимулирующего эффекта на 5-е сутки для РФр и длительный стимулирующий эффект НФр вплоть до 10-х суток, который, вероятно, связан с тем, что нерастворимый гликан медленнее выводился из организма.
Измельченный мицелий грибов вводили перорально через зонд. В результате кормления мышей мицелием гриба в течение 10 суток наблюдали повышение вышеуказанных показателей функциональной активности макрофагов (в среднем, в 1,6 раза) (Рис. 3). Полученные данные свидетельствовали о выраженном иммуностимулирующем действии мицелия гриба. В результате сравнительной оценки действия фракций при внутрибрюшинном введении и фракций в составе мицелия при введении per os
было установлено, что показатели активации макрофагов сопоставимы при обеих схемах введения, однако индексы активации хемотаксиса, цитоплазматической мембраны макрофагов (распластывания) и поглотительной способности клеток (фагоцитоза) при пероральном применении мицелия были несколько ниже, чем при внутрибрюшинном введении фракций (Рис. 3).
ВЫВОДЫ
1. Изучена динамика накопления биомассы мицелия гриба Е /отеп1апш и утилизации источников питания в процессе глубинного культивирования. Из глубинного мицелия были выделены нерастворимая и растворимая углеводные фракции. Мицелий и фракции состояли преимущественно из углеводов (66-82%), белка (1-13%) и незначительного количества минеральных примесей.
2. Нами установлено, что основным углеводным компонентом мицелия и полученных полимеров была глюкоза; фракции также содержали значительное количество галактозы и маннозы и следовые количества ксилозы и фукозы.
3. Фракции и мицелий стимулировали функциональную активность клеток системы мононуклеар-ных фагоцитов; это выражалось в активации процессов хемотаксиса, распластывания, микробоцидности и поглотительной способности макрофагов. Более выраженным иммуномодулирующим действием обладала растворимая углеводная фракция по сравнению с нерастворимой. Мицелий гриба также обладал достаточной биологической активностью.
4. В целом, показано, что мицелий Е /отепЬапш и его углеводные компоненты перспективны в качестве компонентов биологически активной добавки, обладающей иммуностимулирующей активностью.
ЛИТЕРАТУРА
1. Wasser S.P., Weis A.L. Medical properties of substances occurring in higher basidiomycetes mushrooms: current perspectives (review) // Int. J. of Medicinal Mushrooms. — 1999. — Vol.l — P.31-62.
2. Mizuno T. The extraction and development of antitumor-active polysaccharides from medicinal mushrooms in Japan (review) // Int. J. of Medicinal Mushrooms. — 1999. — Vol.l — P.195-206.
3. Ананьева Е.П., Гурина C.B., Кожемякина H.B. Характеристика компонентов мицелия Ganoderma applanatum (Pers.) Pat.; изучение их иммунобиологической и противоопухолевой активности //Ж. Проблемы медицинской микологии. — 2007. - Т.9, № 1 — С.ЗО-ЗЗ,
4. Ленинджер А. Основы биохимии. Т. 1.: Пер. с англ. / Под ред. акад. В.А. Энгельгардта и Я.М. Варшавского. - М.: Мир, 1985.-- 1056 с.
5. Захарова И.Я., Косенко А .В. Методы изучения микробных полисахаридов. — Киев: Наук. Думка, 1982. - 189 с.
6. Хорлин А.Я. Методы исследования углеводов. — М.: Мир, 1975. - 135 е.
7. Фрейдлин И.С, Система мононуклеарных фагоцитов. — М.: Медицина, 1984. - 272 с.
8. Феофилова Е.П. Прогресс в области экспериментальной микологии как основа для создания современных биотехнологий // Микробиология. — 1997. — Т.66, №3. — C.302-3Q9.
9. Щерба В.В., Бабицкая В.Г. Углеводы глубинного мицелия ксилотрофных базидиомицетов // Прикладная биохимия и микробиология. —- 2004. — Т. 41, №2. — С.194-199.
Поступила в редакцию журнала 16.12.2009
Рецензент: Игнатьева С.М. \ /
