CC BY
22
УДК 616.379-008.64:617.7:57.083.3
A.V Karaulov1,1. V Evsegneeva1, E. B. Tuleneva1, M. A. Kryzhanova2, T. G. Martynova2,
V. V. Koroleva2, T. V. Chesnokova3, V. V. Novikov2-3
SOLUBLE MEMBRANE ANTIGENS CONTENT IN PATIENTS WITH DIABETES TYPE 2 EXAMINED AT THE STAGE OF DIABETIC RETINOPATHY
11. M. Sechenov Academy of Medicine, Moscow 21. N. Blokhin Institute of Epidemiology and Microbiology, Nizhny Novgorod 3 N. I. Lobachevsky State University of Nizhny Novgorod
ABSTRACT
The content of soluble membrane antigens in patients with diabetes type 2 at the stage of diabetic retinopathy has been studied by immune enzyme assay. The increased level of serum soluble CD38, CD54 (ICAM-1) antigens and soluble HLA class 1 molecules has been observed. The diabetic retinopathy is accompanied by increasing the serum adhesion molecules including CD50 (ICAM-3) and CD54 (ICAM-1), the soluble activating antigens (CD38, CD95, HLA-DR) and soluble molecules of HLA class 1. The expression of these proteins was observed at the proliferative stage of disease.
Key words: diabetes type 2, diabetic retinopathy, soluble antigens (CD38, CD50 (ICAM-3), CD54 (ICAM-1), CD95 (fas)), soluble molecules of HLA class 1 and HLA-DR.
А. В. Караулов1, И. В. Евсегнеева1, Е. Б. Тюленева1, М. А. Крыжанова2, Т. Г. Мартынова2,
В. В. Королева2, Т. В. Чеснокова3, В. В. Новиков2 3
ИЗУЧЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ РАСТВОРИМЫХ ФОРМ МЕМБРАННЫХ АНТИГЕНОВ У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ ТИПА 2 ПРИ РАЗВИТИИ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ РЕТИНОПАТИИ
1 Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова 2 Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. И.Н. Блохиной 3 Нижегородский государственный университет им. Н. И. Лобачевского
РЕЗЮМЕ
С помощью иммуноферментного метода определено содержание растворимых форм мембранных антигенов у больных сахарным диабетом (СД) типа 2 при развитии диабетической ретинопатии. Обнаружено повышение сывороточного уровня растворимых антигенов CD38 и CD54 (ICAM-1), а также растворимых молекул HLA I класса у всех больных сахарным диабетом. Установлено, что развитие диабетической ретинопатии сопровождается увеличением сывороточного содержания растворимых молекул адгезии CD50 (ICAM-3) и CD54 (ICAM-1), растворимых активационных антигенов (CD38, CD95, HLA-DR) и растворимых молекул гистосовместимости I класса, что особенно ярко наблюдается в клинически выраженной (пролиферативной) стадии заболевания, при которой выявлены достоверные различия практически по всем изучаемым показателям с группой как доноров, так и контроля.
Ключевые слова: сахарный диабет типа 2, диабетическая ретинопатия, растворимые антигены CD38, CD50 (ICAM-3), CD54 (ICAM-1), CD95 (Fas), растворимые молекулы HLA I класса и HLA-DR.
ВВЕДЕНИЕ
В патогенезе сахарного диабета (СД) типа 2 и развитии его осложнений традиционно обращается внимание на обменные нарушения. Полагают, что конечные продукты неферментативного гликозилирования, свя-
зываясь с рецепторами различных клеток, стимулируют продукцию провоспалительных цитокинов, которые вызывают усиление экспрессии адгезивных молекул, усиливают апоптогенный потенциал клеток и задолго до клинико-инструментальных признаков обусловлива-
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ют развитие воспаления сосудов низкой степени. Наиболее характерное осложнение — диабетическая ретинопатия (ДР) — рассматривают как воспалительное заболевание с аутоиммунным компонентом [5; 8].
Экспериментальные исследования убедительно свидетельствуют, что каждая стадия развития ДР связана с иммунологическими механизмами развития хронического воспаления с вовлечением молекул адгезии, инициацией апоптоза, нарушением клеточных и гуморальных реакций, которые можно предотвратить блокадой адгезии лейкоцитов и угнетением апоптоза [13]. Несмотря на очевидную важность изучения растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы, таких работ при СД типа 2 не проводилось, а большинство исследований, связанных с анализом роли дифференцировочных антигенов при СД проводилось изолированно. Внимание к ним продиктовано и тем, что с помощью этих биологически важных показателей можно не только оценивать активационную и/или адгезионную способность клеток, но и, возможно, прогнозировать развитие СД и его осложнений [5].
Цель работы — исследование сывороточного содержания растворимых форм мембранных антигенов у больных СД типа 2 во взаимосвязи с развитием его осложнений.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследование включало 92 пациента с СД типа 2. Все больные были разделены на три группы:
1-я группа (n = 40) — СД типа 2 на разных стадиях (компенсации и декомпенсации) и отсутствие мик-рососудистых осложнений;
2-я группа (n = 14) — длительное течение СД типа 2 и ДР в препролиферативной стадии;
3-я группа (n = 38) — длительное течение СД типа 2 и выраженные сосудистые осложнения (пролиферативная стадия ДР).
Из исследований исключались пациенты с наличием других аутоиммунных заболеваний, воспалительных очагов любой локализации и злокачественных новообразований. Исследование больных 1-й и 3-й групп проводили в динамике в течение 6 мес. на фоне оптимальной коррекции метаболических нарушений и ан-тиоксидантной терапии (при ДР).
Сывороточное содержание растворимых форм антигенов CD38 (sCD38), CD50 (sCD50), CD54 (sCD54), HLA-DR (sHLA-DR) и растворимых молекул HLA I класса (sHLA-I) определяли разработанными ранее иммуноферментными методами [10; 12]. Результаты выражали в условных единицах (ед./мл). Иммунофе-нотипирование клеток периферической крови проводили при помощи моноклональных антител серии ИКО в реакции непрямой поверхностной иммунофлюоресценции. Результаты учитывали на проточном ци-тофлюориметре FACScan (Becton Dickinson, США) [3]. В качестве контроля использовали образцы сыворотки крови 520 здоровых доноров, а также гепарини-зированную кровь 10 практически здоровых лиц, сопоставимых по возрасту с больными СД типа 2.
№1/том 5/2006
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При сравнении результатов определения сывороточного уровня растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы у больных СД, лиц контрольной группы и доноров крови были выявлены следующие закономерности (табл. 1). Содержание $С038-антигена было повышенным у больных СД без ретинопатии и у больных с пролиферативной формой ДР, у которых оно возросло в 2,5 раза. Сходная картина наблюдалась при исследовании уровня $С095-ан-тигена, хотя достоверные различия как с донорами крови, так и с контрольной группой наблюдались лишь при пролиферативной ДР. Больные пролиферативной ДР отличались самыми высокими показателями, отражающими концентрацию растворимых молекул адгезии: содержание антигенов бС050 и бС054 было повышено в сравнении с донорами крови в 1,8 и 3,4 раза соответственно. В меньшей степени наблюдалось увеличение сывороточного уровня антигена бС054 при СД без ДР, а уровень бС050 вообще не был изменен. У больных СД отмечалось также повышенное содержание молекул бНЬА-1 в сравнении с нормой. Более сложной закономерностью характеризовались изменения уровня бНЬА-ОЯ. При СД без ДР сывороточное содержание антигенов бНЬА-ОЯ не отличалось от нормы, но при развитии ДР в препролиферативной стадии отмечалось достоверное уменьшение, а при пролиферативной, напротив, увеличение содержания бНЬА-ОЯ (см. табл. 1).
Таблица 1.
Содержание растворимых форм мембранных антигенов у больных СД, ед./мл
Антиген Норма (доноры Группа контроля (здоровые Без ретинопатии Ретннопатнж (формы)
Компенсированный СД Препролифера- Пролиферативная
СДбет
sCD38 200,3*65,4 230,0*96,6 380,4±97,4’Т 322,7*61,7 Y 173,3*42,5 555,0±120,7’Т
aCD50 348,2*65,4 375,8*70,1 445,5*78,2 434,5*64,1 406,8*41,8 619Д*62,2'Т
aCD54 65,0*10,0 68,9*14,2 207,9*67,3’Т 158,2*25,8'Т 66,9*28,2 222,9*40,6*Т
SCD95 374,0*23,5 417,3*66,7 554,9±110,6 553,9±45,3Y 434,3*104,8 1222*124,44
eHLA-I 1012*36 2159±152Т 2553*206Y 2419*308,7 Y 1940*169,1 Т 2538*271Т
flHLA-DR 99,0±11,5 30,6±4,9Т 153,4*41,7* 98,1*19,9* 22,1±3,7Т 203,9*52,5’Т
* Достоверные различия с группой контроля.
Т Достоверные различия в сравнении с нормой (доноры крови).
Закономерное повышение сывороточного содержания растворимых молекул адгезии, обладающих проангиогенными свойствами, отмечается нами при ДР. Оно также сопровождается повышением содержания растворимых форм активационных молекул, БаБ-антигена и антигенов гистосовместимости. ДР, в патогенезе которой лежат нарушения межклеточных взаимодействий и активация свободнорадикальных процессов, приводит к возникновению зон окклюзий и ускорению контроля скрытой патологии в виде аутоиммунных и иных заболеваний. Значительное увеличение уровня сывороточных молекул адгезии и активации при развитии ДР отражает иммунопатогенез данного заболевания. Новообразование сосудов при ДР является ответом на ишемию, при этом новообразованные неполноценные сосуды потенциально являют-
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ся местом образования микроангиопатий в пролиферативной стадии [8].
Таким образом, развитие ДР у больных СД сопровождается увеличением сывороточного содержания растворимых форм мембранных молекул адгезии, активации и молекул гистосовместимости, что особенно выражено в пролиферативной стадии заболевания, при которой выявлены достоверные различия практически по всем изучаемым показателям с группой как доноров, так и контроля.
Последние две группы также отличались между собой по сывороточному содержанию молекул бНЬА-1 и бНЬА-ОЯ. В последнем случае это различие достаточно существенно, что связано с возрастными особенностями сравниваемых групп. Закономерное повышение содержания растворимых молекул адгезии, обладающих проангиогенными свойствами, обнаруженное нами при ДР, сопровождается также повышением содержания растворимых форм активационных молекул, что может отражать начало аутоиммунных и иных проявлений иммунных нарушений при СД. Повышение всех изученных показателей при ДР, возможно, отражает один из механизмов активации эндотелиальных клеток, который может быть также связан с гипергликемией [9].
Молекулы адгезии обеспечивают контакт между клетками, поддерживают целостность тканей, миграцию лейкоцитов, взаимодействие клеток в процессе иммунных реакций. В инициации иммунного ответа и в формировании иммунологического синапса между лимфоцитами и антигенпредставляющими клетками важная роль отводится антигену СЭ50 (1САМ-3). В растворимой форме последний, связываясь с ЬБА-1 и ОС-ВЮК на поверхности антигенпредставляющих клеток, может тормозить процессы запуска иммунного ответа. После первичного контакта ЬБА-1 с молекулой 1САМ-3 вследствие более высокой аффинности начинает доминировать связывание ЬБА-1 с антигеном 1САМ-1. Растворимые молекулы 1САМ-1 способны модулировать адгезию лейкоцитов на эндотелии сосудов и межклеточные взаимодействия [11].
Повышение сывороточного содержания растворимых молекул адгезии является неблагоприятным фактором с точки зрения хронизации воспаления и прогрессирования течения заболевания. Можно также предположить, что повышенные концентрации антигенов СЭ50 и СЭ54, приводящие к ингибированию взаимодействия 1САМ-1 с ЬРА-1-антигеном, приводят к преимущественной дифференцировке Т-лимфоци-тов в сторону Т-хелперов 2-го типа, что также неблагоприятно с точки зрения возрастания вероятности усиления активности аутоиммунных проявлений и снижения реакций клеточного иммунитета, отмеченных при СД типа 2 [4].
В неблагоприятных условиях при наличии метаболических, гемореологических, гемодинамических сдвигов указанные процессы нарастают, способствуя более интенсивному присоединению клеток к стенкам сосудов. Таким образом, создаются условия для разви-
тия ишемии с последующей выработкой факторов роста, обладающих проангиогенной активностью. Вероятно, этими причинами можно объяснить повышенное содержание молекул активации и бНЬА-1 у больных ДР. О напряженности иммунитета при ДР также свидетельствует обнаруженные нами многочисленные корреляционные связи (данные не представлены).
Взаимосвязь между сывороточным содержанием растворимых форм различных мембранных антигенов обусловлена общими патогенетическими механизмами, лежащими в основе подъема уровней изучаемых параметров. Как клинические, так и экспериментальные исследования указывают на то, что метаболические нарушения не являются единственным и определяющим фактором развития иммунных нарушений при СД. Уже в ранней стадии в сосудах сетчатки глаза активируются каспазы, участвующие в формировании апоптотического сигнала, вследствие чего происходит облитерация капилляров [5]. Как только скорость гибели клеток превышает скорость репарации, образуются ацеллюлярные капилляры, начинается необратимая ишемия сетчатки с формированием пролиферативных процессов. Процесс пролиферации запускается сосудистым эндотелиальным фактором роста (УЕОБ), экспрессия которого определяется концентрацией глюкозы, гликозилированными продуктами и свободными радикалами, образуемыми в избытке в результате как местного, так и системного окислительного стресса [14].
Именно поэтому наряду с оптимальной коррекцией метаболических нарушений при СД типа 2 необходимо назначение препаратов с доказанной антиокси-дантной активностью. Мы применяли целый комплекс препаратов, относящихся к этой группе: эмоксипин, гистохром и милдронат. Длительные наблюдения за больными убедительно свидетельствуют об их эффективности. Положительный результат иммунореабилитации при использовании антиоксидантов (эмоксипина, гистохрома, милдроната) выражался в более выраженном улучшении зрения, рассасывании кровоизлияний и положительной динамике показателей микроциркуляции на глазном дне, что коррелировало с изменениями в ге-мостазиограмме и восстановлением почти всех исходно нарушенных уровней растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы (табл. 2). Анализ этих данных показывает, что сразу же после лечения отмечается тенденция к нормализации уровня бС095, которая усиливается спустя 3 и 6 мес. после начала лечения. Это подтверждает концепцию об активном участии процессов апоптоза в реализации механизмов стресса и эффективности антиоксидантов в предотвращении различных негативных эффектов клинических проявлений стресса [7]. Быстрая динамика регуляторной молекулы, модулирующей активность апоптоза, может быть связана и с изменением цитоки-нового профиля, который оказывает значительное влияние на эти процессы.
Почти синхронные изменения концентраций молекул адгезии (бС050, бС050, бС038), которые норма-
Таблица 2.
Сывороточный уровень растворимых форм мембранных антигенов у больных ДР в пролиферативной стадии, ед./мл
Таблица 3.
Динамика популяций лимфоцитов периферической крови больных ДР в процессе терапии, %
Антиген Норма До лечения Послелечения Через 3 мес. Через 6 мес.
SHLA-I 1012,6+36,2 2386,3+187,4* 2294,6±132,0* 2809,7+205,2 1479,3+67,4*
SHLA-DR 99,1 ±11,5 183,4±24,6* 216,8144,1*
SCD38 200,8±17,3 569,1143,0* 650,9±73,1* 437,0±36,8* 216,0±26,5
SCD50 353,8±65,9 591,1 ±98,0* 678,1 ±127,5* 856,3±108,3 406,6147,2
sCD54 65,2±10,3 238,4±41,9* 316,2±29,7* 125,9±14,0* 81,5±12,6
sCD95 374,7±23,8 1331,5±108,3* 862,4±53,9* 626,7±45,7* 531,3±39,1*
Антиген+ клетки До терапии После терапии Норма
CD54+ 6,4+0,43 6,5±0,51 9,3±6,6
CD56+ 5.2±0,32 4,7±0,38 5,8 ±3,2
CD25+ 2,8±0,2 3,4±0,3 4,9±3,1
CD95+ 44,1+5,0* 39,4±4,7 25,6±12,3
CD38+ 28,0±3,6 25,2±2,9 28,5±4,8
HLA-DR + 13,2±1,58 13,5±1,9 9,1 ±2,9
' Достоверные различия в сравнении с нормой (доноры крови). * Достоверные различия в сравнении с нормой (доноры крови)
лизуются только спустя 6 мес. с начала терапии, подтверждают ключевую роль изменений растворимых молекул адгезии в быстром прогрессировании ДР, что продемонстрировано ранее для sCD62-антигена (Е-се-лектина) [9]. Об этом же свидетельствуют наши наблюдения, подтверждающие необходимость повторных курсов антиоксидантной терапии для получения оптимального клинического эффекта. Именно благодаря окислительному стрессу регистрируется дисфункция эндотелия при СД, которая может предотвращаться при назначении препаратов, обладающих антиоксидантной активностью [2; 13].
Нам не удалось наблюдать нормализации сывороточного уровня антигенов sHLA-DR в период нахождения больного в стационаре. Повышенный уровень sHLA-I имел тенденцию к снижению только спустя 6 мес. после начала лечения, что указывает на независимость этого параметра от проводимой терапии. Возможно, это объясняется тем, что sHLA-I скорее отражает состояние Р-кле-ток поджелудочной железы, которое может не изменяться при проведении антиоксидантной терапии. После терапии каких-либо корреляционных связей между изученными параметрами мы не наблюдали.
Исследование динамики популяционного состава лимфоцитов у больных ДР указывает на отсутствие существенных изменений по основным изучаемым показателям в сравнении с нормой (табл. 3). Отмечалось только повышение числа CD95 (Fas)-положительных клеток, которое не изменялось в период пребывания больного в стационаре. По-видимому, активация процесса апоптоза многих клеточных систем при ДР является определенной закономерностью. Повышенный апоптотический потенциал лимфоцитов при ДР может лежать в основе иммунных нарушений, наблюдаемых при ДР [13], что является основанием для дополнительного назначения иммунотерапии [6]. Нам также не удалось выявить каких-либо достоверных корреляционных связей между сывороточным уровнем растворимых антигенов и относительным содержанием антиген-поло-жительных клеток при ДР. Отсутствие таких связей свидетельствует о независимом характере изменений изучаемых иммунологических параметров при ДР.
Таким образом, нам удалось выявить существенные изменения в сывороточном содержании раство-
№1/том 5/2006
римых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы при СД типа 2, установить их роль в развитии осложнений, в частности ДР, и возможность использования этих показателей при осуществлении мониторинга иммунных нарушений в процессе лечения. На основании результатов проведенных исследований и анализа данных литературы можно утверждать, что развитие ДР сопровождается комплексом иммунных нарушений: имеет место активация эндотелиальных клеток и лимфоцитов, нарастает апоптотический потенциал клеток, создаются условия для аутоиммунных нарушений и снижаются реакции клеточного иммунитета. В такой среде трудно осуществить эффективный иммунный ответ. Поэтому увеличивается возможность развития инфекционных и иных осложнений. Часть этих изменений связана и с возрастными изменениями, в основе которых также лежит окислительное повреждение, вызванное нормальными процессами метаболизма [15], чьи уровень и направленность меняются на фоне сахарного диабета [1; 4]. В процессе работы нам также удалось не только обосновать патогенетическую направленность антиоксидантной терапии, но и показать целесообразность использования изучаемых показателей сывороточного уровня растворимых форм мембранных антигенов в реализации программы иммунореабилитации в условиях длительных наблюдений. В процессе лечения, направленного только на контроль уровня сахара, возникновение ДР практически неизбежно. Включение в комплексную терапию больных СД типа 2 антиоксидантов может предотвратить это осложнение.
ВЫВОДЫ
У больных сахарным диабетом типа 2 отмечается увеличение сывороточного содержания растворимых антигенов СЭ38, СЭ50 и растворимых молекул НЬАI класса.
Развитие и прогрессирование диабетической ретинопатии сопровождается увеличением сывороточного уровня растворимых молекул адгезии, активации, растворимого БаБ-рецептора и растворимых молекул гистосовместимости I класса, что корригируется назначением антиоксидантной терапии.
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
■ ■
79
ЛИТЕРАТУРА
1. Балаболкин М. И. Сахарный диабет. — М: Медицина, 2000. — 350 с.
2. Балаболкин М. И., Клебанова Е. М. Роль окислительного стресса в патогенезе сосудистых осложе-ний СД (лекция) // Пробл. эндокринол. — 2000. — Т. 46, № 6. — С. 29-34.
3. Барышников А. Ю., Шишкин Ю. В. Программированная клеточная смерть (апоптоз). — М.: УРСС,
2002. — 318 с.
4. Дедов И. И., Фадеев В. В. Введение в диабето-логию: Руководство для врачей. — М., 1998. — 450 с.
5. Делягин В. М., Румянцев А. Г., Мельникова М. Б. Патогенез диабетической ретинопатии/ретинита // Вопр. гематол., онкол. и иммунопатол. в педиатр. —
2003. — Т. 2, № 4. — С. 67-70.
6. Клиническая иммунология и аллергология. (2-е изд.) / Под ред. А. В. Караулова. — М.: МИА, 2002. — 651 с.
7. Караулов А. В. Механизмы развития иммунологических нарушений при стрессе и методы их коррекции. Руководство по реабилитации лиц, подвергшихся стрессорным нагрузкам. — И., 2004. — С. 326-337.
8. Кочемасова Т. В. Состояние эндотелия и адгезия лейкоцитов при сахарном диабете (Обзор литературы) // Сахарный диабет. — 2000. — № 3. — С. 59-62.
9. Кочемасова Т. В., Шестакова М. В., Миленькая Т. М. и др. Участие Е-селектина в развитии микро-
сосудистых осложнений сахарного диабета 1 типа // Сахарный диабет. — 2002. — № 1. — C. 50-52.
10. Худякова Н. Е., Новиков В. В., Кравченко Г. А. и др. Уровень растворимых антигенов HLA I и II классов в сыворотке крови ВИЧ-инфицированных лиц // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. — 2004.
— № 1. — С. 42-45.
11. Caron-Leslie A. M., Cidlowski J. A. Evaluation of the role of protein synthesis inhibition in apoptosis in glucocorticoid sensitive and glucocorticoid resistant S42 cell // Endocrinol. J. — 1994. — Vol. 2. — P. 47-52.
12. Khudyakova N. E., Egorova N. I., Ptytsina Ju. S. et al. Serum Level of Soluble Adhesion Molecules in HIV Infected with Markers of Other Viral Diseases // Rus. J. Immunol. — 2003. — No. 4. — Р. 245-250.
13. Mohr S., Xi X., Tang J. et al. Caspase activation in retinas of diabetic and galactosemic mice and diabetic patients // Diabetes. — 2002. — Vol. 51, No. 4. — P. 1171-1179.
14. Schedlowski M. Stress, Stress Hormones and the Immune System // Immunol. Today. — 1998. — No. 19.
— 535 p.
15. Schigenaga M. K., Hagen T. M., Ames B. N. Oxidative damage and mitochondrial decay in aging // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1994. — Vol. 91. — P. 10771-10778.
Поступила 27.01.2006.
