CC BY
43
УДК 616-006.44:612.112.94.014.481
A. K. Golenkov1, G. A. Dudina1, A. V Kildushevsky1, A. Yu. Baryshnikov2, V. V. Novikov3
THE INFLUENCE OF EXTRACORPORAL UV-IRRADIATION OF PERIPHERAL BLOOD LYMPHOCYTES ON THE EXPRESSION OF MEMBRANE-BOUND AND SOLUBLE MOLECULES IN MULTIPLE MYELOMA AND WALDENSTREAM MACROGLOBULINEMIA
1 M. F. Vladimirsky Moscow Scientific Clinical Institute
2 N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow 31. N. Blokhina Institute of Epidemiology and Microbiology, Nizhny Novgorod
ABSTRACT
The expression of membrane-bound and soluble CD38, CD50, HLA-1, CD95 molecules in plasma of patients with multiple myeloma and Waldenstream macroglobulinemia has been studied.
The concentration of soluble molecules was measured using immuno-enzyme assay. The expression of membrane-bound molecules was examined by flow cytometry. We have observed that the concentration of soluble sCD38, sCD50, sHLA-1 after twice UV-irradiation increased in 48 h. The concentration of sCD95 after UV-irradiation decreased simultaneously with the increasing of membrane-bound CD95. Our findings indicate that the increasing of soluble molecules concentration which possess immunoregulatory activity alters the ligand-adhesive interaction of circulating cells and stroma, improves the microcirculation and results in positive clinical effect. We have also observed that after extracorporal UV-irradiation the equilibrium of above mentioned homologous molecules changes.
Key words: lymphocytes, multiple myeloma, Waldenstream macroglobulinemia, extracorporal UV-irradiation, peripheral blood lymphocytes.
А. К. Голенков1, Г. А. Дудина1, А. В. Килъдюшевский1, А. Ю. Барышников2, В. В. Новиков3
ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ОБЛУЧЕНИЯ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ НА ЭКСПРЕССИЮ МЕМБРАННЫХ И КОНЦЕНТРАЦИЮ РАСТВОРИМЫХ МОЛЕКУЛ ПРИ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЕ И МАКРОГЛОБУЛИНЕМИИ ВАЛЬДЕНСТРЕМА
1 МОНИКИ им. М. Ф. Владимирского, Москва
2 ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
3 Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. И. Н. Блохиной
РЕЗЮМЕ
Изучали концентрацию растворимых в сыворотке крови и экспрессию мембранных молекул CD38, CD50, HLA-1, CD95 у больных множественной миеломой и макроглобулинемией Вальденстрема, течение заболевания которых осложнялось полинейропатией.
Применяли иммуноферментный метод с использованием моноклональных антител для определения концентрации растворимых молекул и проточную цитофлуориметрию для исследования экспрессии мембранных молекул до и после проведения экстракорпорального ультрафиолетового облучения лимфоцитов периферической крови (ЭУФОЛПК). Установлено, что концентрация растворимых молекул (sCD38, sCD50, sHLA-1) повышалась через 2 сут после проведения 2 сеансов ЭУФОЛПК. Концентрация sCD95 снижалась после проведения ЭУФОЛПК с одновременным увеличением мембранной экспрессии CD95. Наши исследования показали, что повышение концентрации растворимых молекул, обладающих иммунорегуляторным действием, приводит к изменению процессов адгезивно-лигандного взаимодействия циркулирующих клеток и стромы, улучшению микроциркуляции
и положительному клиническому эффекту. Анализ экспрессии мембранных и концентрации растворимых С095 показал, что после проведения ЭУФОЛПК изменяется паритет указанных гомологичных молекул.
Ключевые слова: моноциты, множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема, экстракорпоральное ультрафиолетовое облучение лимфоцитов периферической крови.
ВВЕДЕНИЕ
Ультрафиолетовое облучение (УФО) крови в настоящее время широко используется в клинической практике. При этом достигаемый клинический эффект базируется в основном на иммуномодулирующем действии энергии ультрафиолетового спектра света.
Использование экстракорпоральной фотохимиотерапии (фотофереза), при которой УФ-свет воздействует на лимфоциты крови с предварительным введением фотосенсибилизатора 8-метоксопсорален (8-МОП) при аутоиммунных заболеваниях сопровождается отчетливым клиническим эффектом [5]. Применение фотофереза при хроническом лимфолейкозе (ХЛЛ) позволяет снижать количество лимфоцитов за счет активации в них процессов апоптоза [5, 7]. Достаточно эффективна экстракорпоральная фотохимиотерапия при лечении Т-клеточных лимфом кожи [6, 12, 13, 17, 18].
В последнее время в связи с широким внедрением в гематологическую практику метода аллогенной трансплантации костного мозга возникла проблема вторичной болезни, которая представляет серьезную угрозу для жизни больных. Фотоферез рассматривается как один из перспективных методов лечения этого осложнения [12].
Оценивая клиническую эффективность метода УФО клеток крови, отраженную в многочисленных публикациях, можно убедиться в достоверности этих сведений. Однако биологическая основа воздействия энергии УФ-света на клетки крови еще недостаточно уточнена.
Точка зрения большинства авторов сводится к тому, что под влиянием УФО возникает фотомодификация клеточных мембран, изменяющая их агрегацион-ные свойства, лиганд-связывающую активность, что улучшает реологические свойства крови и ассоциируется с клиническим эффектом [4, 15].
Результаты исследования [1, 3, 16] предполагают, что дисбаланс мембранных и растворимых НЬА-1, 1Ь-
6, СЭ95 был ассоциирован с различным клиническим течением лимфопролиферативных заболеваний. Так, при ХЛЛ установлено взаимодействие циркулирующих опухолевых клеток с эндотелием сосудов, при этом изменяется трансэндотелиальная миграция лимфоцитов периферической крови [8, 14].
В связи с этим целью настоящей работы было изучение концентрации в сыворотке крови растворимых молекул (бС038, бС050, бС095, бНЬА-1), гомологи которых представлены на мембране лимфоцитов, до и после проведения УФО крови у больных множественной миеломой (ММ) и макроглобулинемией Валь-
денстрема (МГВ), течение заболевания которых осложнялось полинейропатией (ПНП) и амилоидозом. При этом использовался предложенный нами вариант УФО — метод экстракорпорального УФО лимфоцитов периферической крови (ЭУФОЛПК) [10], когда энергия света направлена на выделенные лимфоциты периферической крови [12].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследование включен 21 больной, из них у 10 диагностирована ММ и у 11 — МГВ. ПНП выявлена у 7 больных ММ и 8 больных МГВ. Амилоидоз кожи был отмечен у 1 больного МГВ, амилоидоз слизистой оболочки полости рта — у 2 больных ММ. ПНП у большинства больных характеризовалась периферическим типом с преимущественно сенсорными симметричными клиническими проявлениями.
ЭУФОЛПК проводили путем эксфузии 500 мл крови в полимерный контейнер «Гемакон 500/300/300». Лейкотромбоцитарную массу (ЛТМ) получали согласно инструкции «Фракционирование консервированной крови на клеточные элементы и плазму» № 0614/24, утвержденной М3 СССР 11 июня 1987 г. За один сеанс облучению подвергали 2,4+3,6Ч109 мононукле-арных клеток, что составляло 75-80 % общего количества облучаемых форменных элементов крови. Выделенную ЛТМ ресуспендировали в 200 мл физиологического раствора, тщательно перемешивали и подвергали УФО в течение 20 мин с последующей реинфузией. Для УФО использовали аппарат «Приз-2», разработанный в соответствии с решением Государственной комиссии М3 России по утвержденным медико-техническим требованиям № 27/1-913-92 от 19.11.1992 г. Спектральный диапазон излучения находился в пределах 280-320 нм, мощность УФ излучения — 16 Вт, энергетическая экспозиция облучения составляла 2 Дж/см2. 3а курс лечения проводили 2 процедуры через 2 дня. Концентрацию растворимых молекул в сыворотке крови определяли иммунофер-ментным методом с применением отечественных моноклональных антител серии ИКО. Экспрессию мембранных молекул исследовали при помощи проточной цитофлуориметрии (цитофлуориметр FACSCalibur (Becton Dickinson). Исследования проводили до лечения и через 1-2 дня после 2-го курса ЭУФОЛПК.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Концентрация sCD38, sCD50, sCD95, sHLA-1 в сыворотке крови была изучена у 18 больных, среди которых у 10 диагностирована ММ, а у 8 — МГВ (табл. 1).
Таблица 1
Концентрация зСБ38, вСБбО, «СБ95, эНЬЛ-1 в сыворотке крови у 18 больных ММ и МГВ до и после ЭУФОЛПК
Таблица 2
Фармакокинетика вСД38, вСД50, вНЬЛ-1, зСБ95 у больных с ММ и МГВ после ЭУФОЛПК
Этап лечения бС038, МЕ/мл 8СЭ50, МЕ/мл вНЬА-І, МЕ/мл 5СЭ95, МЕ/мл
До ЭУФОЛПК (п= 18) 160±8'" 269+161" 1067±61(|) 337±26‘"
После ЭУФОЛПК (л=18) 220±30,2> 346±31(2’ 1178±10612’ 275±13,2>
Контроль (л=20) 200,4±17151 353±651” 1010±36|3) 374±23(3)
=0,05 <0,05 >0,05 <0,05
р"11 <0,05 >0.05 >0,05 >0,05
Примечание: р* 1-2 — коэффициент достоверности между данными до и после ЭУФОЛПК; р** 1-3 — коэффициент достоверности между контролем и данными до ЭУФОЛПК.
Как видно из данных табл. 1, средняя исходная концентрация бС038 у исследуемых больных была достоверно ниже контрольных значений. После 2 сеансов ЭУФОЛПК отмечалось достоверное повышение концентрации с 160+8 до 220+30 МЕ/мл (р<0,05). При изучении концентрации растворимых молекул адгезии бС050 (1САМ-3) не было выявлено достоверных различий между исходной концентрацией у больных и контрольным значением. Тем не менее после проведения ЭУФОЛПК отмечалось достоверное нарастание сывороточной концентрации бС050 с 269+16 до 346+31 МЕ/мл (р<0,05).
Результаты, приведенные в табл. 1, свидетельствуют о некотором нарастании концентрации бНЬА-1 после ЭУФОЛПК при недостаточной достоверности различий (р>0,05) и о значительном снижении концентрации бС095 с 337+26 до 275+13 МЕ/мл (р<0,05).
Изменение концентрации бС038, бС050, бНЬА-1, бС095 в зависимости от времени исследования сыворотки после 2-й процедуры ЭУФОЛПК представлено в табл. 2.
Как видно из данных табл. 2, кратность изменения концентраций бС038 (1,4+0,2) свидетельствовала о ее нарастании после ЭУФОЛПК, причем наибольшие значения концентраций, превышающих исходные данные в 1,7+0,2 раза, были зафиксированы в период исследований, проводимых до 60 ч после 2-й процедуры. Снижение концентраций до исходного уровня происходило в период после 60 ч от момента проведения 2-й процедуры.
После ЭУФОЛПК концентрация бС050 в среднем увеличивалась в 1,2+0,1 раза. Наибольшее увеличение концентрации (1,38+0,1) было отмечено спустя 60 ч после проведения 2-й процедуры. Концентрация бНЬА-1 в данном интервале времени изучения практически не изменялась. Концентрация бС095 достоверно снижалась после проведения ЭУФОЛПК. Кратность изменения концентрации бС095 в зависимости от вре-
Этап лечения Кратность изменения концентраций растворимых молекул в сыворотке крови
5С038 вСйбО 5НЬА-1 5С095
< 60 ч1 1,7±0,2 1,0±0,04 1,2±0,1 0,9±0,16
>60ч‘! 1,1 ±0,1 1,38±0,1 1,1 ±0,1 0,7±0,15
После ЭУФОЛПК (общее среднее) 1,4±0,2 1,2±0,1 1,1 ±0,1 0,8±0,15
Количество больных 18 18 21 17
р <0,05 <0,05 >0,05 >0,05
Коэффициент достоверности между результатами в разные периоды времени (> и < 60 ч с момента завершения процедуры).
1 42 ч (21-45).
2 84 ч (69-117).
мени исследования составляла 0,9+0,16 и 0,7+0,15 соответственно, причем выявленная закономерность этих изменений сводилась к тому, что эффект снижения концентрации имел нарастающую тенденцию к уменьшению в зависимости от времени наблюдения.
В связи с тем, что и ММ и МГВ относятся к лимфопролиферативным протеинсинтезирующим процессам, был проведен суммарный анализ клеточных иммунологических маркеров на лимфоцитах крови в 2 группах больных до и после проведения ЭУФОЛПК (табл. 3).
Как следует из данных, представленных в табл. 3, после ЭУФОЛПК происходит значительное увеличение экспрессии СЭ95 — с 4,4+0,6 до 10,0+1,2 % (р<0,05). Со стороны экспрессии других маркеров существенных изменений отмечено не было.
Выявление повышения экспрессии мембранных СЭ95 с 4,4 до 10,0 % (рис. 1) позволяет говорить о воздействии кванта света ультрафиолетового спектра на геном лимфоцита, повышающего готовность клетки к апоптозу.
10 У
8 У
6- /
4 у
г /
у
СО 95
ДоЭУФОЛПК 4.4
Ш После ЭУФОЛПК 10
Рис. 1. Экспрессия мембранных СЭ95 на лимфоцитах крови у 23 больных ММ и МГВ до и после ЭУФОЛПК
Таблица 3
Иммунофенотип лимфоцитов периферической крови у 21 больного ММ и МГВ до и после проведения ЭУФОЛПК, %
Этап лечения Л х 109/л Лф CD3 CD4 CD8 CD19 CD20 CD38 HLA-Dr CD95
До ЭУФОЛПК (я=23) 6,1 ±0,9 36,3±8,1 58,4±12,0 27,5±8,2 26,8±5,1 4,3±0,7 7,6±0,9 19,5±8,8 16±4,2 4,4±0,6
После ЭУФОЛПК (л=23) 6,9±1,8 31,2±8,2 60,1 ±12,3 32,6±9,2 28,0±3,2 4,0±0,4 6,7±1,3 21,9±7,2 18,0±5,8 10,0± 1,2
Норма (и=20) 4.0-8.0 16-35 60-80 35-45 25-35 6-12 6-12 15-25 9-12 5-10
Р >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 <0,05
* Коэффициент достоверности между данными до и после ЭУФОЛПК.
Таким образом, проведенное исследование, направленное на изучение концентрации в сыворотке крови при ММ и МГВ бС038, бС050, бНЬА-1, бС095 и иммунологического фенотипа лимфоцитов крови, позволило оценить влияние ЭУФОЛПК на их фармакокинетику и мембранную экспрессию. Хорошо известно, что мембранные гомологи этих молекул экспрессированы на поверхности опухолевых В-лимфоцитов и плазматических клеток при ММ, МГВ, лимфомах [1, 2].
Указанные поверхностные антигены имеют различные функциональные характеристики. Так, мембранный СЭ38 отражает лимфоплазмоцитарную диф-ференцировку клетки и принадлежность ее к активированным В-лимфоцитам. Он является лигандом СЭ31 (РЕСАМ-1) — тромбоцитарно-эндотелиальной адгезивной молекулы, представленной на тромбоцитах и сосудистом эндотелии. Из этого следует, что при состояниях или заболеваниях с высокой экспрессией на В-лимфоцитах СЭ38 создаются предпосылки для адгезивно-лигандного взаимодействия СЭ38-лимфо-цитов и С031-эндотелиальных клеток. За счет взаимодействия С038-С031 клетка замедляет движение по сосуду, адгезируется к эндотелию и осуществляет процесс трансэндотелиального и периваскулярного перемещения. Этот механизм служит основой для формирования так называемого трансэндотелиального вектора опухолевых клеток [1]. На наш взгляд, подобный механизм лежит в основе органной опухолевой инфильтрации при лейкозах.
Оценивая полученные результаты, следует отметить, что исходная концентрация бС038 в сыворотке крови 18 больных ММ и МГВ была достоверно ниже контрольных значений. Это свидетельствует о том, что активируются процессы межклеточного взаимодействия и периваскулярного перемещения СЭ38-лимфо-цитов через СЭ31-эндотелиальный лиганд. После 2 сеансов ЭУФОЛПК концентрация бС038 достоверно повысилась. Это может указывать на снижение пери-васкулярной направленности движения СЭ38-лимфо-цитов за счет блокирования бС038 лигандов СЭ31, поэтому клетки остаются в циркуляции. Полученный эффект длится в течение 60 ч, т. к. в этот период времени концентрация бС038 в 1,7 раза превышает исходные значения.
Адгезивная молекула CD50 (ICAM-3) относится к суперсемейству иммуноглобулинов, экспрессируется на лимфоидных клетках, строме костного мозга и лимфоидных органов при ЛПЗ, так же как CD54 (ICAM-1). Лигандом этой молекулы являются в2-инте-грины (LFA-1, CD18, CDl^) [3, 8].
В настоящее время не установлено лигандов для CD50 и CD54 на строме внутренних органов и сосудистом эндотелии. Однако в2-интегрины (CD18, CD11), являющиеся лигандами CD50 и CD54, представлены на опухолевых В-лимфоцитах. Поэтому процесс фиксирования на строме внутренних органов опухолевых В-лимфоцитов будет осуществляться за счет адгезивно-лигандного взаимодействия клеточных CD 18, CD11 и стромальных CD50, CD54. Роль растворимых CD50 в этом процессе будет носить регуляторный характер за счет усиления или уменьшения взаимодействия sCD50 с мембранными CD 18 и CD11, что, в свою очередь, будет влиять на активность контакта опухолевых лимфоцитов и стромы.
В проведенных исследованиях установлено достоверное повышение концентрации sCD50 после 2 процедур ЭУФОЛПК, что будет уменьшать активность взаимодействия опухолевых клеток и стромы, перивас-кулярный вектор их движения и инфильтрацию тканей.
Антигены HLA-I широко представлены на различных типах клеток. Они являются лигандами для Т-кле-точных рецепторов, взаимодействие с которыми обеспечивает цитотоксический эффект Т-лимфоцитов. Некоторое увеличение sHLA-I в сыворотке крови у больных ММ и МГВ после ЭУФОЛПК, установленное в наших исследованиях, свидетельствует о том, что избыточные sHLA-I блокируют лиганды на клетках-мишенях и уменьшают цитотоксические возможности Т-лимфо-цитов. Этот механизм может лежать в основе положительного клинического эффекта ЭУФОЛПК при РТПХ.
Антиген апоптоза CD95 (FAS/APO) отражает процессы программной клеточной гибели, а его растворимый гомолог может защитить клетки от внешних сигналов, индуцирующих апоптоз за счет блокирования соответствующих лигандов. Общебиологическое значение этого факта многообразно, однако применительно к опухолевому росту блокирование апоптоза в опухолевых клетках следует рассматривать как один из
факторов прогрессии заболевания. Полученные результаты показали, что после ЭУФОЛПК концентрация бС095 достоверно уменьшилась. В то же время мембранный СЭ95 повышался.
ВЫВОДЫ
Результаты проведенных исследований позволили выявить 2 типа изменений концентраций растворимых молекул после проведения ЭУФОЛПК. Концентрация бС038, бС050и $ИЬЛ-1 повышалась после проведенного лечения, а бС095 — снижалась. Это свидетельствует о том, что повышение концентрации в сыворотке крови растворимых молекул происходит в результате потери клеткой мембранных молекул. Вероятен и другой механизм, который заключается в активации альтернативного сплайсинга, в результате чего мембранная молекула синтезируется без цитоплазматического домена.
Снижение концентрации бС095 после ЭУФОЛПК и одновременное повышение количества мембранных СЭ95 более определенно указывают на изменение функции генома лимфоцита. При этом происходит переключение синтеза бС095 на мембранный СЭ95, что приводит к изменению паритета растворимых и мембранных гомологов.
В обобщенном виде влияние ЭУФОЛПК на процессы межклеточного взаимодействия лимфоцитов за счет изменения паритетности мембранных и растворимых гомологичных молекул и вектора движения клеток отражено на рис. 2.
Рис. 2. Изменение трансэндотелиального вектора СЭ38+-лимфоцитов периферической крови при ММ и МГВ после ЭУФОЛПК
ЛИТЕРАТУРА
1. Голенков А. К., Барышников А. Ю., Бакиров А. Б. Клиническое значение линейно-адгезивного фенотипа лимфопролиферативных заболеваний. — Уфа, 2004. — 178 с.
2. Голенков А. К., Шабалин В. ^Множественная миелома. — СПб., 1995. — 140 с.
3. Голенков А. К., 'Митина Т. А., Новиков В. В. и др. Клиническое значение растворимых молекул адгезии (бСД50 — 1САМ-3), апоптоза (бСД95) и бНЬА класса I
при лимфопролиферативных заболеваниях // Рос. био-тер. журн. — 2002. — Т. 1, № 1. — С. 47-60.
4. Дуткевич И. Г. Головин Г. В., Марченко А. В. и др. Влияние аутотрансфузии УФ-облученной крови на некоторые показатели гомеостаза хирургических больных // Вестн. хир. — 1987. — № 1. — С. 59-65.
5. Килъдюшевский А. В. Экстракорпоральная гемокоррекция при лимфопролиферативных и аутоиммунных заболеваниях: Автореф. дис... д-ра мед. наук. — М., 1997. — 35 с.
6. Килъдюшевский А. В., Молочков В. А., Гостева И. В. Экстракорпоральная фотохимиотерапия в лечении Т-клеточных злокачественных лимфом кожи // Рос. биотер. журн. — 2002. — Т. 1, № 1. — С. 25-34.
7. Килъдюшевский А. В., Голенков А. К. Экстракорпоральная фотохимиотерапия в комплексном лечении хронического лимфолейкоза // 3-й Всероссийский съезд гематологов и трансфузиологов. — СПб., 1996. — С. 24.
8. Митина Т. А. Клиническое значение линейного и адгезивного фенотипов опухолевых клеток при хроническом лимфолейкозе: Автореф. дис... канд. мед. наук. — М., 2003. — 20 с.
10. Неретин В. Я., Килъдюшевский А. В., Озерова И. В. и др. Способ лечения аутоиммунных заболеваний: Патент на изобретение № 2159635. Зарегистрирован в Гос. Реестре изобретений РФ, г. Москва, 27 ноября 2000 г.
11. Chen C. J. et al. Transendothelial migration lymphocytes in chronic lymphocytic leucaemia is impaired and involves down-regulation of both L-selection and CD23 // Br. J. Haematol. — 1999. — Vol. 105, No. 1. — P. 181-189.
12. Dall Amico R., Zulian R. F. et al. Applications of extracorporeal photochemotherapy in «non oncological» diseases // Int. J. Artif. Organs. — 1993. — Dec. 16, Suppl. 5. — P. 168-172.
13. Edelson R. L. Photopheresis: a new therapeutic concept // Yale. J. Biol. Med. — 1989. — Vol. 62(6). — P. 565-577.
14. Golenkov A., Kildyshevsky A. Extracorporeal selective ultraviolet irradiation of blood lymphocytes at treatment of hemoblastosis patients // The 2nd International Conference on Tumor Microenvironment: Progression, Therapy and Prevention. — Baden, Austria, June 25-29 2002. — P. 164. — Poster № 50.
15. Knobler R., Trautinger F., Graninger W. et al. Parenteral administration of 8-methoxypsoralen in photopheresis // J. Am. Acad. Dermatol. — 1993. — Apr. 28(4).
— P. 580-584.
16. Perer-Andres J., Almeida M. et al. Prognostic impact of expression of HLA-1 and IL-6 chains on clonal PC and the serum of multiple patients // Haematologica.
— 2005. — Vol. 90(52). — P. 96.
17. Rook A. H., Cohen J. H., Lessin S. R et al. Terapeutic applications of photopheresis // Dermatol. Clin.
— 1993. — Vol. 11, No. 2. — P. 339-347.
18. Rook A. H., Wolfe J.T. Role of extracorporeal photopheresis in the treatment of cutaneous T-cell lymphoma, autoimmune disease, and allograft rejection // J. Clin. Apheresis. — 1994. — Vol. 9(1). — P. 28-30.
