CC BY
60
АБИСИЛИН ИЗУЧЕНИЕ ОБЩЕТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯМ 35
УДК 615.277.3.032:615.9
Л.А. Лацерус1, И.В. Березовская2, В.И. Рымарцев2, Н.М. Пинигина1
ИЗУЧЕНИЕ ОБЩЕТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТА АБИСИЛИНП
1ДЛЯ ПЕРОРАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ
OOO «Инитиум-Фарм», Москва
2OАO «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ», Купавна Контактная информация
Лацерус Людмила Анатольевна, кандидат медицинских наук, генеральный директор ООО «Инитиум-Фарм» адрес: 142000, Московская область, г. Домодедово, Каширское ш., д. 7, тел.: +7(499)-722-2357 e-mail: initium-pharmffiyandex.ru
Статья поступила: 15.12.2009, принята к печати 25.03.2010.
Резюме
Проведено доклиническое изучение безопасности препарата Абисилин®, содержащего в своем составе природный комплекс терпенов хвойных деревьев семейства Pinaceae. По результатам определения острой токсичности Абисилин® отнесен к IV классу опасности в соответствии с TOCT-ом 12.1.007-76. Пероральное введение кроликам и крысам Абисилина® в течение 6 мес. не вызывало достоверных функциональных и структурных изменений в органах и тканях. У отдельных подопытных животных препарат оказывал слабое местное раздражающее действие на слизистую желудочно-кишечного тракта. Воздействие Абисилина® в дозах, десятикратно превышающих терапевтическую, сопровождалось у части животных незначительными функциональными и гистологическими изменениями, которые восстанавливались через 1 мес после отмены препарата. Результаты проведенного исследования в достаточной мере обосновывают безопасность перорального применения препарата Абисилин®.
Ключевые слова: Абисилин®, токсичность, побочные эффекты, безопасность.
L.A. Latseruz1, I.V. Berezovskaya2, V.I. Rymartsev2, N.M. Pmigma1 THE PRECLINICAL TRIAL OF ABISILIN®
WHEN ADMINISTRATED PER OS 'Initium-pharm LTD, Moscow
2Russian Biological Active Drugs’ Safety Research Center, Kupavna Abstract
The preclinical trial of Abisilinn safety demonstrates that the drug belongs to Class IV safety drugs. When rabbits or rats were given Abisilinn per os for 6 months, no significant functional or structural changes were observed in any tissue or organs. The weak irritation of mucous coat of stomach was obvious in few animals. If the dose of Abisilinn was increased 10-fold, some functional or histological changes were seen. These changes restored in a month after drug withdrawal. Based on data obtained, we conclude that this drug is safety for per os administration.
Key words: Abisilinn, toxicity, side-effect, safety.
Введение
Лекарственный препарат Абисилин® (Аби-сил 20 %-ный раствор в масле для перорального применения), содержит в своем составе природный комплекс терпенов (изопреноидов), синтезируемый хвойными деревьями семейства Pinaceae. Субстанция препарата (Абисил - пихты сибирской терпены) и его лекарственная форма для местного и наружного применения, включенные в Государственный реестр лекарственных средств, обладают антимикробными, противовоспалительными, ранозаживляющими, иммуномодулирующими и другими фармакологически значимыми эффектами [3; 6; 7].
При экспериментальном исследовании противоопухолевой активности установлено, что терпенсодержащий препарат Абисилин® обладает противоопухолевой активностью в отношении перевиваемых опухолей мышей - меланомы В-16, аденокарциномы молочной железы Са-755, LLC, рака шейки матки (РШМ-5) и саркомы М-1 крыс [9].
В соответствии с существующими требованиями ЛФ зарегистрированного лекарственного препарата с новым путем введения подлежит обязательному токсикологическому исследованию.
Цель настоящего исследования - доклиническое токсикологическое изучение терпенсодержащего перорального препарата Абисилин®.
Материалы и методы
Для проведения токсикологических исследований использовали препарат Абисилин® серии № 010908, представленный ООО «Инитиум-Фарм» и соответствующий проекту нормативной документации.
Общетоксическое действие препарата изучали в соответствии с методическими рекомендациями [1].
Хронический эксперимент проводили на кроликах породы шиншилла (б Ще>. 2,70±0,06 кг и
9 шСр 2,59±0,06 кг) и на нелинейных белых крысах (б ер. 38±5 г и 9 ер. 06±4 г).
Все подопытные кролики были разделены на
5 групп по 8 особей в каждой. Группы формировались методом случайных чисел с использованием массы тела в качестве ведущего признака.
Исследуемый препарат вводили кроликам перорально ежедневно однократно в течение 6 мес в дозах 70,0 мг/кг (терапевтическая) и 700,0 мг/кг, десятикратно превышающих разовую терапевтическую дозу для кроликов.
Межвидовой расчет доз проводили по методу И.П. Улановой [1] путем экстраполяции с терапевтической дозы для крыс (200 мг/кг).
Расчет:
(200мг / кг х 6,5)
------------------= 70мг кг
18,5
Подопытные крысы были разделены на 7 групп по 15 особей в каждой. Исследуемый препарат вводили внутрижелудочно в виде 20 %-ного масляного раствора ежедневно однократно в течение 6 мес. в дозах 200,0 (терапевтическая); 1000,0 и 2000,0 мг/кг в объеме 0,1; 0,5 и 1,0 мл на 100 г массы тела соответственно. Контрольным животным вводили подсолнечное масло в объеме 0,5 мл на 100 г массы тела. Терапевтическая доза для крыс обоснована фармакологическими исследованиями противоопухолевого действия Абисилина®.
Общее состояние подопытных животных оценивали по внешнему виду, поведенческим реакциям и динамике массы тела.
Состояние сердечно-сосудистой системы изучали с помощью ЭКГ во втором отведении без наркоза с использованием компьютерной приставки в виде комплекса «Поли-Спектр-8/В» при скорости регистрации 200 мм/сек и соответствии 1 мв - 20 мм.
О состоянии периферической крови судили по количеству эритроцитов и лейкоцитов (подсчет в камере Горяева), тромбоцитов (подсчет в мазках крови) и ретикулоцитов - подсчет в мазках крови, окрашенных бриллиантовым крезиловым синим, лейкограмме - подсчет в мазках крови, окрашенных по Романовскому-Гимза, гемоглобина (измерение на гемоглобинометре ГФ3) [4], параметрам свертывания крови (коагулограф Н-334).
Программа изучения общетоксического действия Абисилина® включала набор тестов для оценки функции печени. Белоксинтезирующую функцию печени изучали по содержанию общего белка с помощью биуретовой реакции, липидную
- по содержанию общих липидов колориметрическим методом с реактивом, состоящим из ванилина и фосфорной кислоты, содержанию общего холестерина по методу Илька.
Функциональное состояние поджелудочной железы и косвенно углеводную функцию печени определяли по содержанию глюкозы в сыворотке крови глюкозооксидазным методом [5].
Функцию выделительной системы исследовали по следующей программе: спонтанный диурез за 18 ч, удельная масса мочи весовым методом, рН мочи, мочевина в сыворотке крови и моче диаце-тилмонооксимным методом с последующим расчетом СКОМ; содержание креатинина в сыворотке крови и моче по реакции Яффе и определение клиренса креатинина как показателя клубочковой фильтрации; содержание ионов калия и натрия в сыворотке крови и их выведение с мочой методом пламенной фотометрии на ПФМ-1 [2].
По завершению эксперимента подопытных животных умерщвляли (наркоз и электрошок для кроликов, наркоз и дислокация для крыс), вскрывали, определяли относительную массу органов. Для патоморфологических исследований были взяты от подопытных животных всех групп следующие органы: сердце, лимфатические узлы, селезенка, щитовидная и паращитовидная железы, тимус, надпочечники, желудок, тонкий и толстый кишечник, поджелудочная железа, печень, легкие, почки, семенники, яичники.
Гистологический материал фиксировали в
10 %-ном формалине, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и заключали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином.
Материалы экспериментов подвергали статистической обработке общепринятым методом по Стьюденту (программа на СБЬБЯОМ-366) [8].
Результаты и обсуждение
Определение острой токсичности проводили на нелинейных белых мышах массой 18-20 г при однократном внутрижелудочном введении Абиси-лина® в дозе 10000 мг/кг (100-кратно превышающей терапевтическую дозу) в объеме 1,0 мл на 20 г массы тела. Интоксикация проявлялась беспокойством, учащенным дыханием, увеличением двигательной активности, группированием. Гибель животных не наблюдали в течение 14 дней, т.е. всего периода наблюдения.
По результатам изучения острой токсичности препарат Абисилин® может быть отнесен к IV классу опасности в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76. В экспериментах по определению хронической токсичности Абисилина® не выявлено существенных различий в его влиянии на подопытных кроликов и крыс.
Интегральные показатели
Прирост массы тела при воздействии изучаемого препарата не имел статистически значимых различий с контролем. Поведенческие реакции подопытных животных не отличались существенно от контрольных животных.
Состояние периферической крови
При воздействии Абисилина® в течение 3 мес у подопытных кроликов отмечены увеличение палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, лимфопения и эозинопения под влиянием большой дозы (700,0 мг/кг). Остальные показатели клеточного состава периферической крови и концентрация гемоглобина не отличались от контроля. В конце эксперимента увеличение палочкоядерных нейтро-филов наблюдалось только у кроликов-самок.
При воздействии Абисилина® в течение месяца в периферической крови крыс всех подопытных групп не было существенных отличий от контроля (эритроциты, лейкоциты, гемоглобин, рети-кулоциты, лейкоцитарная формула). Через 3 мес введения препарата у крыс-самок под влиянием терапевтической дозы отмечена незначительная нейтропения и снижение гемоглобина под воздействием большой дозы. По завершению эксперимента состояние периферической крови не отличается от контроля. Снижение цветового показателя у крыс-самок в пределах сезонной нормы. Абиси-лин® в течение 90 дней эксперимента не влиял на состояние свертывания крови подопытных животных всех групп. После 6 мес введения препарата в большой дозе отмечалось увеличение времени начала свертывания крови.
Функциональное состояние печени
и поджелудочной железы
Воздействие Абисилина® в течение 3 мес не оказывало влияния на содержание общего белка и глюкозы в сыворотке крови у всех подопытных кроликов и крыс. Абисилин® в дозе 700 мг/кг вызывал увеличение общих липидов у кроликов-самок после 6 мес введения (табл.1).
Таблица 1
Воздействие Абисилина® на содержание общих липидов в сыворотке крови кроликов (М±m; п=8)__________
№ Пол Доза, мг/кг Общие липиды сыворотки крови (г/л) под воздействием Абисилина®
До начала Через 1 мес Через 3 мес Через 6 мес
1 в 70,0 2,46 0,04 О С* «о, о, сі ©" 00 00 20 6 0 О, 30
2 в 700,0 2,46 0,04 2,49 0,07 3 9 «о, о, сі ©' 9 9 сп ^ сі ©'
3 в контроль 2,53 0,05 2,59 0,05 2,56 0,06 2,87 0,12
4 ? 700,0 2,57 0,04 7 5 «О, о, СІ о" 9 7 «о, О, сі ©' 3,37* 0,08
5 ? контроль 2,54 0,04 2,63 0,06 4 7 «о, О, сі ©' 2,56 0,15
*Р<0,001
Таблица 2
Воздействие Абисилина® на концентрацию глюкозы в сыворотке крови крыс (М±m; п=10)_______________
№ Пол Доза, мг/кг Г люкоза сыворотки крови (мМ/л)
До начала Через 1мес Через 3 мес Через 6 мес Восстановление (п=5)
1 в 200,0 6,62 6,32 6,32 6,31** 5,66
0,08 0,11 0,07 0,27 0,09
2 в 1000,0 6,64 0,09 7,05 0,23 6,93 0,15 7,03 0,14 5,63 0,10
3 в 2000,0 6,68 6,88 6,87 7,03 5,67
0,08 0,08 0,07 0,07 0,09
4 в контроль 6,65 0,11 6,67 0,14 6,69 0,11 6,86 0,08 5,71 0,08
5 ? 200,0 6,65 6,67 6,69 6,86 5,71
0,11 0,14 0,11 0,08 0,08
6 ? 2000,0 6,54 7,35* 7 32*** 7 34**** 5,96
0,07 0,31 0,18 0,17 0,04
7 ? контроль 6,57 0,07 6,59 0,08 6,56 0,09 6,52 0,069 5,92 0,09
*Р<0,05; **Р<0,02; ***Р<0,002; ****Р<0,001.
Таблица 3
Воздействие Абисилина® на концентрацию общего холестерина в сыворотке крови крыс (М±m; п=10)____
№ Пол Доза, мг/кг Общий холестерин, мМ/л, на фоне воздействия Абисилина®
До начала Через 1 мес Через 3 мес Через 6 мес Восстановление (п=5)
1 в 200,0 2,29 2,34 2,35*** 2,41 1,95
0,03 0,05 0,05 0,05 0,04
2 в 1000,0 2,36 2,42 2,40** 2,51 1,91
0,02 0,04 0,05 0,04 0,04
3 в 2000,0 2,41 2,88*** 2,74 2,84* 1,93
0,05 0,17 0,11 0,12 0,06
4 в контроль 2,35 0,02 2,34 0,02 2,58 0,05 2,55 0,05 1,97 0,05
5 ? 200,0 2,03 0,20 2 61**** 0,06 2 61**** 0,06 2,66**** 0,06 1,83 0,03
6 ? 2000,0 2,19 2 47**** 2 46**** 2 58**** 1,82
0,04 0,08 0,07 0,06 0,04
7 ? контроль 2,09 0,04 2,07 0,04 2,07 0,03 2,06 0,04 1,96 0,06
*Р<0,05; **Р<0,02; ***Р<0,01; ****Р<0,001.
У крыс после 6 мес введения препарата в терапевтической дозе констатировали гипогликемию. В большой дозе у крыс самок наблюдалась гипергликемия. После восстановительного периода содержание глюкозы в сыворотке крови крыс нормализовалось (табл. 2). Абисилин® вызывал увеличение концентрации общих липидов у крыс-самцов при введении в дозе 1000 и 2000 мг/кг, а у крыс-самок - 200 и 2000 мг/кг. Через мес восстановительного периода установлена нормализация концентрации общих липидов в сыворотке крови у всех подопытных животных. Под влиянием терапевтических доз Абисилина® отмечено снижение концентрации общего холестерина в сыворотке крови крыс (табл. 3). Гиперхолестеринемия установлена через 1 и 6 мес введения Абисилина® в дозе 2000 мг/кг крысам-самцам. У крыс-самок гипер-холестеринемия наблюдалась в течение всего эксперимента в дозах 200 и 2000 мг/кг Абисилина®. Нормализация концентрации общего холестерина отмечена через мес восстановительного периода.
Функциональное состояние почек Под воздействием Абисилина® через 1; 3, и 6 мес у всех подопытных кроликов и крыс функциональные показатели выделительной системы не отличались от контроля. Абисилин® не влиял в течение
6 мес на секреторную функцию почек, на минеральный обмен и клубочковую фильтрацию почек. Некоторые изменения азотистого обмена отмечены под влиянием большой дозы после 6 мес введения препарата. Так, у кроликов-самцов наблюдали увеличение креатинина в сыворотке крови и моче, у самок - только в моче без существенных изменений клиренса креатинина.
Функциональное состояние сердечно-сосудистой системы На протяжении всего периода воздействия Аби-силина® со стороны изучавшихся показателей электрокардиограммы всех подопытных групп не отмечено существенных отличий от контроля. Изменения параметров ЭКГ не имели дозозависимого характера и укладывались в сезонные нормы показателей. Слабый кардиотропный эффект наблюдался только у крыс-самок. После отмены препарата в течение мес параметры ЭКГ самок не отличались от контроля.
Местное раздражающее действие После 6 мес внутрижелудочного введения Абисилина® макроскопически не обнаружено местного раздражающего действия. По результатам гистологических исследований установлено дозозависимое местное раздражающее действие, наиболее выраженное при введении крысам в дозе 2000 мг/кг.
Патоморфологические исследования
За время проведения эксперимента через
3 мес погиб только один кролик (с признаками пневмонии), гибели крыс не зарегистрировано. После умерщвления осмотр животных показал, что все они нормально упитаны, имеют правильное телосложение, опрятны, волосяной покров и естественные отверстия чистые. При макроскопическом исследовании внутренних органов групп контроля и подопытных групп во время вскрытия каких-либо особенностей не выявлено.
Определение относительной массы органов подопытных кроликов не выявило существенных отличий от контроля при воздействии препарата в изученных дозах. Отмечалось увеличение массы печени у крыс-самцов после введения Абисилина® в дозах 200; 1000 и 2000 мг/кг и у крыс-самок после введения большой дозы.
При максимальной дозе испытуемого препарата (700 мг/кг для кроликов и 2000 мг/кг для крыс) у подопытных животных обнаружены слабо выраженные явления интоксикации в виде умеренного венозного полнокровия паренхиматозных органов, гидропической дистрофии кардиомиоцитов, гепато-цитов, небольшой реакции иммунных органов у отдельных животных.
У животных всех испытуемых групп выявлены изменения в месте введения препарата в слизистой оболочке желудка, тонкой и толстой кишки. Пищевод без патологических изменений. В желудке обнаружена небольшая гиперсекреция слизи и мелкоочаговая десквамация эпителия. В тонкой кишке
- гиперсекреция слизи, очаговая десквамация эпителия, макрофагальная реакция, очаговая атрофия желез, очаговый фиброз собственной пластинки слизистой оболочки, а также микроэрозии и микроизъязвления слизистой оболочки.
В толстой кишке - умеренная гиперсекреция слизи, очаговая десквамация эпителия, микроэрозии у отдельных животных. Вышеописанные изменения в желудочно-кишечном тракте в основном выявлялись у подопытных животных при введении максимальных доз Абисилина®. При терапевтической дозе подобные изменения были найдены у отдельных животных и проявлялись большей частью слабо. У отдельных животных группы контроля, получавших 0,5 мл/100 г подсолнечного масла, отмечена слабо выраженная гиперсекреция слизи и мелкоочаговая десква-мация в тонкой и толстой кишке. Гистологические исследования органов и тканей подопытных животных всех групп спустя мес после отмены Абисилина® подтвердили восстановление ранее установленных структурных изменений.
Литература
1. Арзамасцев Е.В., Гуськова Т.А., Березовская И.В. и др. Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ. - Под ред. Хабриева Р.У. - М.: Медицина, 2005. - С. 4i-54.
2. Берхин Е.Б., Иванов Ю.И. Методы экспериментального исследования почек и водно-солевого обмена. - Барнаул: Алтайское книжн. издательство, i972. - i99 с.
3. Государственный реестр лекарственных средств. Официальное издание. - Москва, 2008. - С. 85.
4. КудрявцевА.А., КудрявцеваЛ.А. Клиническая гематология животных. - М.: Колос, i974. - 285 с.
5. Лабораторные методы исследования в клинике / Под ред. В.В. Меньшикова. - М.: Медицина, i987. - 363 с.
6. Лацерус Л.А., Носков А.П., Пинигина Н.М. Биологическая активность и клиническая эффективность нового фитопрепа-
рата «Абисил-i» // Современные проблемы педиатрии и детской хирургии: Материалы Сибирско-Американской научно-практической конференции. 7-8 октября i998 г. - Иркутск: Изд-во Иркут. ун-та, i998. - С. 233-8.
7. Пинигина Н.М., Лацерус Л.А., Брайн Э.В. и др. Средство «Абисил-i», обладающее противовоспалительной, антибакте-
риальной и ранозаживляющей активностью. Патент РФ №2054945 от 27.02.i996.
8. УрбахВ.Ю. Биометрические методы. - М.: Наука, i964. - С. 99-i33, i47-54.
9. PCT/RU2008/000i47. Pub.No.: WO/2GG9/ii39G2, i7.09.2009. Pinigina N.M., Latserus L.A., Baryshnikov F.U. et al. Antican-
cer terpenoid pharmaceutical composition "Abisilin" with angiogenesisinhibition action.
