Научная статья на тему 'Антиангиогенные свойства препарата Абисилин® in vitro и in vivo'

Антиангиогенные свойства препарата Абисилин® in vitro и in vivo Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
281
57
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
АБИСИЛИН® / АНТИАНГИОГЕННЫЕ СВОЙСТВА / ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ / ABISILIN® / ANTIANGIOGENIC CAPACITY / ENDOTHELIAL CELLS

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Лацерус Людмила Анатольевна, Пинигина Н. М., Барышников А. Ю., Степанова Е. В.

Абисилин® отечественный пероральный препарат, содержащий в своем составе природный комплекс терпеноидов, синтезируемый хвойными деревьями. Проведены исследования по оценке антиангиогенных свойств препарата с использованием цитотоксического, пролиферационного и миграционного тестов, а также метода ингибирования формирования сосудистоподобных структур. В опытах in vitro показано, что Абисилин® вызывает гибель (LD 50=0,21 мг/мл) и блокирует пролиферацию (ИК 50=0,09 мг/мл) эндотелиальных клеток SVEC-4-10. Препарат концентрации 0,25 мг/мл блокирует на 89 % миграцию эндотелиальных клеток в и тормозит в концентрации 0,125 мг/мл образование трубочкоподобных структур. Установлено, что препарат Абисилин® при введении мышам C 57BL/ 6 перорально в течение 7 дней в дозах 2; 1 и 0,2 мг/мл блокирует рост новых сосудов в имплантанте Матригеля с введенным стимулятором ангиогенеза bFGF. Полученные данные свидетельствуют о способности препарата Абисилин® блокировать основные этапы опухолевого ангиогенеза.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Лацерус Людмила Анатольевна, Пинигина Н. М., Барышников А. Ю., Степанова Е. В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

ANTIANGIOGENIC ACTIVITY OF ABISILIN® IN VITRO AND IN VIVO

In this study we have examined the cytotoxic, antiproliferative and migrative activity of Russian anticancer drug Abisilin® which is known to be the complex of terpenoids. Here we show that Abisilin® induced the cell death (LD50=0,21 mg/ml) and inhibited endothelial SVEC 4-10 cells proliferation (IK=0,09 mg/ml). The migration of cells was inhibited for about 89 % at the concentration 0,25 mg/ml. In this study we have also studied the effect of Abisilin® on capillary-like structures formation by SVEC 4-10 cells. Abisilin® blocked the formation of such structures. In vivo experiments demonstrated that Abisilin® at doses 2; 1 et 0,2 mg/kg body weigh reduced the microvascular density of vessels when administrated per os.

Текст научной работы на тему «Антиангиогенные свойства препарата Абисилин® in vitro и in vivo»



АБИСИЛИН АНТИАНГИОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ПРЕПАРАТА □ 13

УДК 615.322.015.44:611.018.74

Л.А. Лацерус1, Н.М. Пинигина1, А.Ю. Барышников2, Е.В. Степанова2

АНТИАНГИОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ПРЕПАРАТА АБИСИЛИН® IN VITRO И IN VIVO

1ООО «Инитиум-Фарм», Москва 2РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Контактная информация

Лацерус Людмила Анатольевна, кандидат медицинских наук, генеральный директор ООО «Инитиум-Фарм» адрес: 142000, Московская область, г. Домодедово, Каширское ш., д. 7, тел.: +7(499)-722-2357 e-mail: initium-pharm@yandex.m

Статья поступила: 24.11.2009, принята к печати 25.03.2010.

Резюме

Абисилин® - отечественный пероральный препарат, содержащий в своем составе природный комплекс терпеноидов, синтезируемый хвойными деревьями. Проведены исследования по оценке антиангиогенных свойств препарата с использованием цитотоксического, пролиферационного и миграционного тестов, а также метода ингибирования формирования сосудистоподобных структур. В опытах in vitro показано, что Абисилин® вызывает гибель (LD50=0,21 мг/мл) и блокирует пролиферацию (ИК50=0,09 мг/мл) эндотелиальных клеток SVEC-4-10. Препарат концентрации 0,25 мг/мл блокирует на 89 % миграцию эндотелиальных клеток в и тормозит в концентрации 0,125 мг/мл образование трубочкоподобных структур. Установлено, что препарат Абиси-лин® при введении мышам C57BL/6 перорально в течение 7 дней в дозах 2; 1 и 0,2 мг/мл блокирует рост новых сосудов в имплантанте Матригеля с введенным стимулятором ангиогенеза bFGF. Полученные данные свидетельствуют о способности препарата Абисилин® блокировать основные этапы опухолевого ангиогенеза.

Ключевые слова: Абисилин®, антиангиогенные свойства, эндотелиальные клетки.

L.A. Latserus1, N.M. Pinigina1, A.Yu. Baryshnikov2, E.V. Stepanova2 ANTIANGIOGENIC ACTIVITY OF ABISILIN® IN VITRO AND IN VIVO 'Initium-Parm, LTD, Moscow

2N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow Abstract

In this study we have examined the cytotoxic, antiproliferative and migrative activity of Russian anticancer drug - Abisilin® - which is known to be the complex of terpenoids. Here we show that Abisilin® induced the cell death (LD50=0,21 mg/ml) and inhibited endothelial SVEC 4-10 cells proliferation (IK=0,09 mg/ml). The migration of cells was inhibited for about 89 % at the concentration 0,25 mg/ml. In this study we have also studied the effect of Abisilin® on capillary-like structures formation by SVEC 4-10 cells. Abisilin® blocked the formation of such structures. In vivo experiments demonstrated that Abisilin® at doses 2; 1 et 0,2 mg/kg body weigh reduced the microvascu-lar density of vessels when administrated per os.

Key words: Abisilin®, antiangiogenic capacity, endothelial cells.

Введение

Лекарственный препарат Абисилин® (Абисил 20%-ный раствор в масле для перорального применения) содержит в своем составе природный комплекс терпеноидов (изопреноидов), синтезируемый хвойными деревьями.

Субстанция препарата (Абисил - пихты сибирской терпены) и его лекарственная форма для местного и наружного применения, включенные в Государственный реестр лекарственных средств, проявляют антимикробные, противовоспалительные, ранозаживляющие, иммуномодулирующие и другие фармакологически значимые эффекты [1-3].

Широкий спектр фармакологической активности препарата, по-видимому, связан с многокомпонентным набором терпеноидов, входящих в его состав. Известно, что среди природных соединений этого класса найдены вещества с выраженными противоопухолевыми свойствами.

Например: таксаны, каротиноиды, токоферолы и другие [4].

Цель работы - изучение антиангиогенной активности препарата Абисилин® in vitro и in vivo.

Материалы и методы

В работе использованы культуры эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10, трансформированные вирусом SV40.

Для исследования использовали препарат Аби-силин® для перорального применения. Раствор препарата готовился в стоковой концентрации 10 мг/мл (10% ДМСО/PBS) в лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН в день постановки экспериментов. Препарат

- взвесь белого цвета - разводили в 1% PBS. Все эксперименты были повторены не менее 4 раз [5].

Анализ цитотоксического действия на культуру эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10

Клетки (6х104 в мл) сажали на 96-луночный планшет в среде ,3MEM, содержащей 10 % эмбриональной сыворотки, 2мМ глутамина. Спустя 24 ч добавляли препарат в различных концентрациях. Инкубацию с препаратом проводили 1 день, затем добавляли МТТ в конечной концентрации 0,5 мг/мл. Клетки инкубировали 4 ч, затем среду отбирали и клетки растворяли в ДМСО.

Оптическую плотность оценивали на анализаторе иммуноферментных реакций «Униплан» при 540 нм, используя DMSO как нулевой контроль.

Ингибирование миграции культуры эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10 (метод «раневой поверхности »

Клетки (3*105 в мл) сажают на 24-луночный планшет в среде ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной сыворотки, 2мМ глутамина, и инкубируют до образования монослоя. Затем монослой нарушают путем соскабливания части клеток. В течение 24 ч клетки инкубируют в среде ДМЕМ, содержащей 10% FCS, 2мМ глутамина и нецитотоксиче-ские дозы препарата.

В качестве положительного контроля используют клетки, инкубировавшиеся в ДМЕМ без добавления сыворотки.

Результаты оценивают как процент мигрирующих клеток в опыте по отношению к контролю (клетки в среде ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной сыворотки, 2мМ глутамина).

Ингибирование образования трубочкоподобных структур эндотелиальными клетками SVEC-4-10

24-луночную плашку покрывают раствором Матригеля (250 мкл/лунка) и инкубируют 20 мин при 37 °С до его полимеризации. Клетки (4*105 в мл) инкубируют в среде ДМЕМ с добавлением не-цитотоксических доз препарата в течение 30 мин при 37 °С.

Затем клетки (500 мкл) наносят в лунки, покрытые Матригелем, и инкубируют в СО ^инкубаторе в течение 4-5 ч. В качестве положительного контроля используют клетки, инкубировавшиеся в среде ДМЕМ без добавления препарата. Оценивают длину трубочек и количество контактов между трубочками.

Модель имплантанта Матригеля in vivo

В экспериментах использовали мышей-самок С57В1/6 возрастом 6-8 нед. Матригель (BD Bioscience, Discovery Labware) при 4 °С смешивали только со 100 нг/мл bFGF (Becton Dickinson Lab-ware). Смесь Матригеля затем вводили подкожно мышам в подмышечную впадину, где он полимери-зовался с формированием имплантанта.

Имплантант удалялся на 7-й день, фиксировался в 10 %-ном нейтральном формалине в течение 24-36 ч и заключался в парафин. Срезы толщиной 4-5 мкм докрашивались гематоксилин-эозином. Препарат Абисилин® вводился мышам перорально ежедневно в течение 7 дней в дозе 2; 1 и 0,2 мг/мл.

Результаты

Цитотоксическое действие Абисилина□

Был проведен анализ цитотоксического действия Абисилина® на эндотелиальные клетки при инкубации в течение 24 ч с клетками линии SVEC4-10, высаженными в высокой плотности.

По нашим данным Абисилин® вызывает гибель эндотелиальных клеток в диапазоне концентраций от 1 мг/мл до 0,125 мг/мл (рис. 1). ЛД50 составила 0,21 мг/мл.

Был проведен анализ влияния Абисилина® на пролиферативную активность активированных bFGF эндотелиальных клеток SVEC4-10, высаженных в низкой плотности.

Показано, что Абисилин® блокирует пролиферацию эндотелиальных клеток SVEC4-10 в диапазоне концентраций от 1 мг/мл до 0,125 мг/мл (ИК50=0,09 мг/мл).

В двух нецитотоксических концентрациях (0,0625 мг/мл и 0,031 мг/мл) наблюдалось блокирование пролиферации эндотелиальных клеток на 20 % (рис. 2).

Антимиграционное действие Абисилина □

Способность Абисилина® блокировать миграцию эндотелиальных клеток «в рану» была оценена на диапазоне доз препарата от 0,25 мг/мл до

0,031 мг/мл (рис. 3-4).

Наблюдается блокирование миграции эндотелиальных клеток на S9 % при концентрации Аби-силина® 0,25 мг/мл.

Абисилин® не блокирует миграцию эндотелиальных клеток «в рану» в нецитотоксических концентрациях (0,0625 мг/ мл и 0,031 мг/мл).

Действие Абисилина□ на трубочкоподобные структуры

Способность Абисилина® блокировать образование трубочкоподобных структур была оценена в диапазоне доз препарата от 0,125 мг/мл до 0,015 мг/мл.

Исследование показало, что Абисилин® частично блокирует образование трубочкоподобных структур в концентрации 0,125 мг/мл.

Наблюдаемые трубочки являются короткими, незамкнутыми и не ограничены контактами с другими трубочками. При концентрации Абисили-на® 0,0625; 0,031 и 0,015 мг/мл блокирования образования трубочкоподобных структур не наблюдалось (рис. 5).

Действие Абисилина □ на ангиогенез в имплантанте Матригеля

Исследование антиангиогенного действия Абисилина® in vivo проводилось по способности ингибировать ангиогенез в имплантанте Матригеля со стимулятором ангиогенеза bFGF. Абисилин® вводился перорально каждый день в течение 7 дней в концентрациях 0,2; 1 и 2 мг/мл.

Исследование показало, что Абисилин® в изученных концентрациях дозозависимо блокирует образование сосудов в Матригеле (рис. 6).

Максимальное блокирование наблюдалось при концентрациях Абисилина® 1 и 2 мг/мл, при концентрации 0,2 мг/мл - частичное блокирование образования новых сосудов в имплантанте Матри-геля. На гистологических срезах имплантанта Мат-ригеля, окрашенных гематоксилином и эозином, отмечено дозозависимое снижение количества эндотелиальных клеток и стромальных элементов при кормлении мышей Абисилином®.

Заключение

Проведенное исследование показало, что лекарственный препарат Абисилин® обладает анти-ангиогенными свойствами в экспериментах in vitro и in vivo.

Полученные данные позволяют рекомендовать его для клинических испытаний в качестве препарата, способного блокировать ангиогенез злокачественных опухолей.

Иллюстрации 4-б см. на стр. I-II

АБИСИЛИН АНТИАНГИОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ПРЕПАРАТА□ 15

Рис. 1. Цитотоксическое действие Абисилина® на культуру эндотелиальных клеток (8УБС-4-10).

Рис. 2. Антипролиферативное действие Абисилина® на культуру эндотелиальных клеток 8УБС-4-10.

16 АБИСИЛИН АНТИАНГИОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ПРЕПАРАТА□

Рис. 3. Влияние Абисилина® на миграцию эндотелиальных клеток SVEC-4-10 в тесте «заживление раны».

Литература

1. Государственный реестр лекарственных средств. - М., 2004. - Т. 1. - С. 93.

2. Лацерус Л.А., Носков А.П., Пинигина Н.М. Биологическая активность и клиническая эффективность нового фитопрепарата «Абисил-1» // Современные проблемы педиатрии и детской хирургии: Материалы Сибирско-Американской научно-практической конференции. Иркутск, 7-8 октября 1998 г.

- Иркутск: Изд-во Иркут. ун-та, 1998. - С. 233-8.

3. Пинигина Н.М., Лацерус Л.А., Брайн Э.В. и др. Средство «Абисил-1», обладающее противовоспалительной, антибактериальной и ранозаживляющей активностью. Патент РФ №2054945 от 27.02.1996.

4. Трещалина Е.М. Противоопухолевая активность веществ природного происхождения. - М.: Практическая медицина, 2005. - 272 с.

5. PCT/RU2008/000147. Pub.No.: W0/2009/113902, 17.09.2009. Pinigina N.M., Latserus L.A., Baryshnikov F.U. et. al. Antitumoral terpenoid pharmaceutical composition “Abisilin” exhibiring angiogenesis-inhibitig action.

Рисунки к статье Л.А. Лацерус и соавт.

«АНТИАНГИОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ПРЕПАРАТА АБИСИЛИН® IN VITRO И IN VIVO»

Рис. 4. Микрофотографии миграционной активности эндотелиальных клеток 8УЕС-4-10, полученных при инкубации с различными дозами препарата Абисилин®:

А - отрицательный контроль; Б - положительный контроль;

В - Абисилин® 0,25 мг/мл; Г - Абисилин® 0,0625 мг/мл.

Рис. 5. Микрофотографии трубочкоподобных

структур, образованных эндотелиальными клетками SVEC-4-10; получены при инкубации с различными дозами препарата Абисилин®:

А - контрольный образец;

Б - Абисилин® 0,125 мг/мл;

В - Абисилин® 0,0625 мг/мл.

Положительный контроль

0,2 мг/мл І мг/мл 2 мг/мл

Рис. 6. Микрофотографии имплантантов Матригеля, выделенных из подкожной клетчатки мышей, и гистологических срезов, окрашенных гематоксилином и эозином; получены in vivo введении Абисилина® per os.

Рисунки к статье Д.В. Соколовой и соавт.

«ОСНОВНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КСЕНОГРАФТОВ ЛИМФОМЫ ЧЕЛОВЕКА ЛБР-2 КАК МИШЕНИ ДЛЯ ТАРГЕТНОЙ ТЕРАПИИ»

Рис. 1. Динамика роста 1-го пассажа п/к ксенографта ЛБР-2 у мышей- Рис. 2. Мышь линии Balb/c nude с п/к самок Balb/c nude после имплантации адаптированной культуры клеток. ксенографтом ЛБР-2 (1-й пассаж, 24-е

сутки после трансплантации).

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.