CC BY
81
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ АНТИАНГИОГЕННЫЕ СВОЙСТВА... 45
УДК 615.015.44:611.018.74:611.16
А.А. Кладиев1, Е.В. Степанова2, Э.Ш. Соломко2, В.А. Кельцев3, Б.Ф. Немцов4, А.Ю. Барышников2
АНТИАНГИОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ПРОСПИДИНА IN VITRO
^Биотехнологическая компания ТНК», Москва
2РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
3Самарский Государственный медицинский университет
4Кировская Государственная медицинская академия
Контактная информация:
Кладиев Андрей Атикович, генеральный директор ООО «Биотехнологическая компания ТНК». «Биотехнологическая компания ТНК», Москва
адрес: 107045, Москва, Костянский переулок 9/10, подъезд 1, кв. 3; тел. +7(495)789-91-98 e-mail: prospidin@vandex.ru
Статья поступила: 13.01.2009 г., принята к печати: 23.09.2009 г.
Резюме
Ингибирование ангиогенеза, развития новых кровеносных сосудов из уже существующей кровеносной сети, является перспективным подходом к лечению злокачественных опухолей. Особый интерес представляет возможность использования уже известных и хорошо изученных лекарственных препаратов в качестве ингибиторов неоангиогенеза. В проведенных экспериментах in vitro проспидин, отечественный противоопухолевый препарат, ингибировал основные этапы опухолевого ангиогенеза in vitro: пролиферацию, миграцию и формирование капилляро-подобных структур в концентрациях до 0,1 мг/мл. Таким образом, одним из возможных механизмов противоопухолевого действия проспидина является ингибирование ангиогенеза.
Ключевые слова: проспидин, ангиогенез, эндотелиальные клетки.
A.A. Kladiev1, E.V. Stepanova2, E.Sh. Solomko2, V.A. Keltsev3, B.F. Nemtsov4, A.Yu. Baryshnikov2 THE ANTIANGIOGENIC PROPERTIES OF PROSPIDIN IN VITRO '«Biotehcompany TNK», Moscow
2N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
3Samara State Medical University
4Kirov State Medical Academy
Abstract
Inhibition of neo-angiogenesis is an attractive therapeutic target because all solid tumors depend on it to grow. The aim of this study was to identify the new angiogenesis inhibitors among the drugs in clinic’ use. Here we show that Prospidin, the Russian anticancer drug, inhibited cell proliferation and migration in vitro. Prospidin at the concentration 0,1 mg/ml also inhibited the capillary-like structures. Based on the data obtained, we conclude that one of the explanation of Prospidin’ anticancer effect might be its antiangiogenic activity.
Key words: prospidin, angiogenesis, endothelial cells.
Введение
Современная стратегия химиотерапии опухолей подразумевает активное использование соединений с выраженным действием на отдельные звенья роста и прогрессии злокачественных новообразований. Сегодня ни у кого не вызывает сомнения, что важным механизмом развития и мета-стазирования опухоли является ангиогенез.
Ангиогенез - процесс формирования новых микрососудов из уже существующих. Дефицит питательных веществ и кислорода, необходимых для роста опухоли, приводит к появлению клонов опухолевых клеток, выделяющих ангиогенные факторы. Высокоангиогенные опухоли имеют больше возможностей индуцировать рост новых сосудов при метастазировании, по сравнению с низкоангио-генными, метастазирующие клоны которых находятся в «дремлющем» состоянии [16; 18].
Экспериментальные исследования in vivo, иммуногистохимические и биохимические исследования различных опухолей человека неоднократно демонстрировали зависимость роста опухоли и метастазирования от ангиогенной активности пер-
вичного очага [16; 18]. Исследования последних лет доказали, что оценка ангиогенеза опухоли является независимым прогностическим маркером безрецидивной и общей выживаемости больных различными злокачественными заболеваниями [22].
Присутствие в крови ингибиторов неоангио-генеза способно затормозить рост метастазов, но не первичной опухоли. Например, перевиваемая карцинома легкого Льюис при подкожном росте дает метастазы в легкие, однако эти метастазы остаются в покоящемся состоянии в виде небольших узелков опухолевых клеток, в которых отсутствуют сосуды (микрометастазы). Причиной этого является высокий уровень ингибиторов в крови (ангиостатина и эндостатина), выделяемых первичной опухолью.
Удаление первичной опухоли приводит к снижению уровня ингибиторов ангиогенеза в крови, что приводит к запуску процессов ангиогенеза в микрометастазах в легких и, соответственно, их быстрому росту [18].
Изучение механизмов регуляции ангиогенеза позволило создать новую стратегию лечения злокачественных новообразований: антиангиогенную
терапию [14; 16; 20].
Одной из особенностей антиангиогенной терапии является ее цитостатический эффект. В большинстве исследований показано, что использование такой терапии приводит к задержке роста опухоли, а не к ее регрессии. На сегодняшний день известно более чем 700 соединений, имеющих ан-тиангиогенную активность, более 30 антиангиоген-ных препаратов проходят различные фазы клинических испытаний. Все они относятся к двум основным классам: прямые и непрямые ингибиторы ангиогенеза [20].
Прямые ингибиторы ангиогенеза (Авастин, Софатиниб) действуют непосредственно на эндотелиальные клетки, блокируя пролиферацию, миграцию и индуцируя апоптоз в активированных эндотелиальных клетках [12; 23]. Показано, что к прямым ингибиторам ангиогенеза не возникает лекарственной резистентности [14; 20].
Непрямые ингибиторы (интерфероны, Гер-цептин, Талидомид, Целекоксиб и др.) блокируют синтез ангиогенных стимуляторов опухолевыми клетками [15; 19]. Так, они могут предотвращать активность онкогенов, стимулирующих ангиогенез, или блокировать рецепторы на эндотелиальных клетках. Для многих онкогенов доказана возможность активирования синтеза стимуляторов ангиогенеза (особенно VEGF) и блокирования синтеза ингибиторов (например, тромбоспонбин 1) [16; 18].
Появляется все больше экспериментальных данных, что ингибирование ангиогенеза является одним из компонентов противоопухолевой активности многих традиционных цитотоксических препаратов (например, блеомицина, циклофосфамина, доксорубицина, нитрозомочевины и т.д.) [21]. Противоопухолевые препараты воздействуют на делящиеся эндотелиальные клетки так же, как и на опухолевые. Однако эндотелиальные клетки способны восстановиться в течение традиционного перерыва (2-3 нед), который обычно используется в химиотерапии для восстановления функции костного мозга. Так, исследования, проведенные in vivo, убедительно показывают, что использование «антиан-гиогенного режима» введения циклофосфамида -частые инъекции небольшими дозами - имеет преимущество перед традиционным [17]. Кроме того, в этих экспериментах не наблюдалось появления резистентности к препарату, в отличие от традиционного подхода [13].
Однако в клинической практике такой путь пока используется редко. Имеется лишь небольшое количество публикаций о высокой эффективности «антиангиогенных режимов» химиопрепаратов [17].
Особый интерес представляет возможность использования в качестве ингибиторов неоангиоге-неза уже известных и хорошо изученных лекарственных препаратов. С этой целью нами было проведено изучение антиангиогенных свойств отечественного цитостатического препарата широкого действия проспидина.
Материалы и методы
В работе использованы культуры эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10, трансформированные вирусом SV40.
В качестве противоопухолевого препарата использовались ампулы проспидина лиофилизиро-ванного (0,1 г для инъекций).
Препарат разводился ex tempore в стерильной дистиллированной воде непосредственно перед каждым опытом.
Цитотоксическое действие на культуру эндотелиальных клеток мыши 8УЕС-4-10
Клетки 8УБС-4-10 (6*104 клеток/мл) вносили в лунки 96-луночного планшета в среде ДМБМ, содержащей 10% эмбриональной сыворотки, 2мМ глутамина. Спустя 24 ч наносили препарат в различных концентрациях (1-0,0001 мг/мл). Инкубацию с препаратом проводили 24 ч, затем добавляли МТТ в конечной концентрации 0,5 мг/мл. Клетки инкубировали 4 ч, затем среду отбирали и клетки растворяли в ДМСО. Оптическую плотность оценивали на анализаторе иммуноферментных реакций «Униплан» при X 540 нм, используя БМ80 как нулевой контроль. Данный метод позволяет оценить цитотоксическое действие препарата на эндотелиальные клетки.
Ингибирование ЬЕОЕ-стимулированной пролиферации культуры эндотелиальных клеток мыши 8УЕС-4-10
Клетки 8УБС-4-10 вносили в низкой плотности (15*103 клеток/мл) в лунки 96-луночного планшета в среде ДМБМ, содержащей 10% эмбриональной сыворотки, 2мМ глутамина и 20 нг/мл ЬБвР. Спустя 24 ч наносили препарат в различных концентрациях (1-0,0001 мг/мл). Инкубацию с препаратом проводим 3 дня, затем добавляли МТТ в конечной концентрации 0,5 мг/мл. Клетки инкубировали 4 часа, затем среду отбирали и клетки растворяли в ДМСО. Оптическую плотность оценивали на анализаторе иммуноферментных реакций «Униплан» при 540 нм, используя БМ80 как нулевой контроль. Данный метод позволяет оценить влияние препарата на пролиферативную активность активированных эндотелиальных клеток.
Ингибирование миграции культуры эндотелиальных клеток мыши 8УЕС-4-10 (метод «раневой поверхности»)
Клетки 8УБС-4-10 (3*105 клеток/мл) вносили в лунки 24-луночного планшета в среде ДМБМ содержащей 10% эмбриональной сыворотки, 2мМ глутамина, и инкубировали до образования монослоя. Затем монослой нарушали путем соскабливания части клеток. В течение 24 ч клетки инкубировали в среде ДМЕМ, содержащей 10% БС8, 2мМ глутамина и нецитотоксические дозы препарата (1-0,0001 мг/мл). В качестве положительного контроля использовали клетки в бессыворотной среде ДМЕМ. Результаты оценивали как процент мигрирующих клеток в опыте по отношению к контролю (клетки в среде ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной сыворотки, 2мМ глутамина). Метод позволяет оценить влияние препарата на миграцию эндотелиальных клеток внутри опухоли.
Ингибирование образования трубочко-подоб-ных структур эндотелиальными клетками 8УЕС-4-10
24-луночную плашку покрывали Матригелем (250 мкл/лунка) и инкубировали 20-30 мин при 37 °С до его полной полимеризации. Клетки 8УБС-4-10 (5*105 клеток/мл) инкубировали в среде ДМЕМ с добавлением нецитотоксических доз препарата (1-0,0001 мг/мл) в течение 30 мин при 37 °С. Затем клетки наносили в лунки и инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 4-5 ч. В качестве положительного контроля использовали клетки, инкубировавшиеся в той же среде без препарата. Оценивали длину трубочек и количество контактов между ними. Данный метод позволяет оценить влияние препарата на формирование первичной капиллярной сети внутри опухоли.
Результаты
Было исследовано влияние препарата проспи-дин на гибель, пролиферацию, миграцию эндотелиальных клеток SVEC-4-10 и формирование трубочкоподобных структур в концентрациях 1-0,0001 мг/мл. Экспериментальные данные по каждой концентрации были получены в триплетах в трех независимых экспериментах.
Проспидин не оказывал цитотоксического действия на культуру эндотелиальных клеток SVEC-4-10 в изученных (1-0,0001 мг/мл) концентрациях, в которых выживаемость клеток, после инкубации с препаратом, составляла 90-100 % от числа клеток, которые инкубировались в чистой среде ДМЕМ. Однако проспидин блокировал пролиферацию bFGF-активированных эндотелиальных клеток в концентрациях 10,05 мг/мл (ИК50=0,5 0,12 мг/мл; рис. 1).
Рис. 1. Цитотоксическое и антипролиферативное действие проспидина на культуру эндотелиальных клеток SVEC-4-10
При тестировании клеток с помощью метода «раневой поверхности» показано, что проспидин блокирует миграцию эндотелиальных клеток в концентрации 1 мг/мл на 70 % (рис. 2; стр. 48). При концентрации 0,1 мг/мл и ниже ширина миграционной поверхности была сравнима с контрольным образцом. Данные о влиянии препарата на миграцию в данном тесте представлены в таблице.
Таблица
Влияние проспидина на миграцию
культуры эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10
Доза препарата Ширина миграционной поверхности, % от контроля
1 мг/мл 32±10
0,5 мг/мл 76±15
0,1 мг/ил 95±12
0,05 мг/мл 110±21
Оценено влияние нецитотоксических доз препарата на формирование трубочко-подобных структур. Показано, что проспидин частично блокирует образование трубочкоподобных структур в концен-
трациях 0,5 и 0,1 мг/мл (рис. 3). Наблюдаемые трубочки являются короткими и прерывистыми («незакрытыми»), т.е. не ограничены контактами с другими трубочками. При концентрациях препарата
0,05 мг/мл и 0,01 мг/мл не обнаружено существенных отличий от контрольных опытов. Образовавшиеся трубочки не имеют существенных отличий от контрольных образцов: трубочкоподобные
структуры высоко структурированы, ярко выражены, контактируют с другими трубочкоподобными структурами.
Обсуждение
Проспидин - оригинальный отечественный препарат, синтезированный во ВНИХФИ, имеет следующую структуру:
Уникальность химической структуры проспидина (3,12-бис(3-хлор-2-гидроксипропил)-3,
12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5,2,5,2]гексадекана дихлорид) связана с наличием нескольких активных центров. Доказано, что проспидин относится к полифункциональным молекулам. При этом различные структурные элементы молекулы этого соединения реализуют различные механизмы противоопухолевого эффекта препарата. В частности, две -хлор- -оксипропильных группы обладают алки-лирующим действием, а диспиротрипиперазиние-вая система, имеющая два четвертичных атома азота, реализует мембранотропные свойства препарата. Кроме того, наличие двух четвертичных атомов азота в диспиротрипиперазиниевой системе является важным условием и для противоопухолевой активности проспидина [5; 7].
В отличие от большинства противоопухолевых средств, обладающих выраженным цитотокси-ческим действием, действие проспидина на клетку оценивается как цитостатическое (антипролифера-тивное). Доказано, что проспидин, обладая низкой токсичностью в широком диапазоне концентраций (от 10-9 до 10-2 г/мл), ингибирует спонтанную пролиферацию всех изученных типов клеток (наиболее чувствительными оказались тимоциты). Кроме того, он подавляет индуцированную пролиферацию лимфоидных клеток, стимулированную цитокинами либо митогенными лектинами (ИЛ-1 в человека, ИЛ-2, КонА, ЛПС E. coli), либо их сочетанием [3].
Полученные ранее результаты [1] свидетельствуют, что эффект проспидина зависит от времени введения по отношению к митогену. Наибольшее угнетение реакции бластной трансформации лейкоцитов наблюдалось при введении одновременно с ФГА или после него, что позволило авторам сделать предположение о преимущественном действии проспидина на стадии распознавания чужеродного антигена лимфоидными клетками.
Антипролиферативные эффекты проспидина зависят от времени введения препарата по отношению к времени максимальной митотической активности клетки.
48 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ АНТИАНГИОГЕННЫЕ СВОЙСТВА...
А
Б
Рис. 2. Микрофотографии результатов теста на влияние на миграцию культуры эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10 (метод «раневой поверхности»):
А - контрольный образец (клетки без препарата);
Б - клетки, инкубировавшиеся с проспидином в концентрации 0,1 мг/мл.
Рис. 3. Микрофотографии трубочкоподобных структур, сформированных эндотелиальными клетками: А - контрольные клетки (без препарата);
Б - клетки, инкубировавшиеся с проспидином в концентрации 0,5 мг/мл;
В - клетки, инкубировавшиеся с проспидином в концентрации 0,1 мг/мл;
Г - клетки, инкубировавшиеся с проспидином в концентрации 0,05мг/мл.
Введение проспидина через В ч после начала основной волны пролиферации не влияет на последующую митотическую активность. Анализ восходящей части кривой меченых митозов, отражающей характер перехода меченых клеток из периода G2 в митоз, показывает, что клетки в периоде G2 нечувствительны к проспидину и способны завершить клеточный цикл. Таким образом, введение проспи-дина после начала митотического цикла практически не влияет на прохождение клеток по циклу [4]. Учитывая, что проспидин не влияет на интактную клетку, можно высказать предположение, что основным объектом антипролиферативного действия препарата является клетка, вступающая в клеточный цикл.
Анализ клинических результатов доказывает, что наиболее эффективен проспидин при саркоме Капоши - злокачественной опухоли с многоочаговым характером роста, происходящей из кровеносных и лимфатических сосудов. Многолетний опыт применения проспидина в режиме монотерапии школой профессора М. Л. Гершановича (НИИ онкологии им. Петрова, Санкт-Петербург) свидетельствует, что эффективность препарата при этой патологии составляет более 85 % [2; б]. Аналогичные результаты получены и в результате других многолетних исследований [В].
Особый интерес для обоснования использования проспидина в качестве лекарственного препарата, вызывающего подавление неоангиогенеза, имеют результаты многолетнего клинического изучения, проведенные в клинике офтальмологии профессором А. Д. Чупровым (Кировская медицинская академия). Серьезной проблемой при трансплантации роговицы является неоваскуляризация роговичного трансплантата после сквозной кератопластики. Причиной неоваскуляризации в этих случаях считают как иммунологический конфликт тканей донора и реципиента, так и выраженную воспалительную реакцию неиммунной природы в ответ на травматичность вмешательства в сочетании с гипоксией тканей переднего сегмента. Субконъ-юнктивальные инъекции препарата проспидин позволяли не только купировать воспалительную реакцию, но и полностью избежать неоваскуляриза-ции пересаженной роговицы. В случае врастания сосудов на глазах с послеожоговыми и ишемическими изменениями визуально наблюдали запусте-вание и полную регрессию сосудов [9-11].
Вышеперечисленные результаты свидетельствуют не только о наличии у проспидина антипро-лиферативного действия, но и об избирательной способности подавлять неоангиогенез. Это в свою очередь вызвало необходимость изучения молекулярных механизмов его антиангиогенных свойств.
Полученные нами результаты полностью коррелируют с данными, полученными в других исследованиях. Прежде всего, продемонстрировано отсутствие цитотоксичности препарата проспидин в широком диапазоне концентраций: от 0,0001 до 1 мг/мл, то есть фактически при увеличении дозы на четыре порядка мы не отмечали токсического действия на культуру эндотелиальных клеток SVEC-4-10.
Ингибирование пролиферации bFGF-активированных эндотелиальных клеток было получено в концентрациях от 1,0 до 0,05 мг/мл, то есть препарат обладает шириной терапевтического действия, равной более одного порядка. Подавление пролиферации эндотелиальных и опухолевых клеток проспидином в концентрациях вне токсического диапазона является важной особенностью препара-
та. Как показано в работе лаборатории профессора А.С. Симбирцева [3], проспидин проявляет свое ингибирующее действие вне зависимости от вида изученного митогена и вида клеток. Причину этой антипролиферативной универсальности проспиди-на следует искать в особенностях его молекулы.
Прежде всего, это трехциклическая структура, обладающая минимальной токсичностью и максимальной противоопухолевой активностью. Далее, это наличие двух пар активных центров, каждый из которых обладает высокой связывающей способностью. И, наконец, активность проспидина в большой степени определяется оптимальным расстоянием между его реакционноспособными центрами. Профессор В. А. Чернов высказал предположение, что это расстояние совпадает с расстоянием активных центров, экспрессированных на мембране активно пролиферирующей клетки [7].
При изучении влияния препарата проспидин на миграционную способность эндотелиальных клеток показано, что блокирование миграции эндотелиальных клеток на 70 % отмечено при концентрации 1 мг/мл. При более низких концентрациях ингибирующее воздействие было сопоставимо с данными контроля.
Показано, что проспидин частично блокирует образование трубочкоподобных структур в концентрациях не ниже 0,1 мг/мл.
Таким образом, действие проспидина непосредственно на процесс формирования микрососудов проявляется при более высоких дозировках, чем в случае блокирования пролиферации.
Однако в целом организме все эти процессы протекают одновременно и взаимосвязано. Поэтому результаты клинического использования проспидина демонстрируют высокую эффективность прежде всего при патологических процессах, сопровождающихся не только высокой пролиферативной активностью, но в первую очередь пролиферацией эндотелиальных клеток, а значит и высоким уровнем неоангиогенеза [2].
В научном исследовании, посвященном, в том числе, изучению влияния проспидина на состояние цитокиновой системы, высказано предположение, что проспидин оказывает ингибирующее действие на продукцию эндогенных цитокинов [3]. Вероятно, что одним из возможных механизмов антиангиогенной активности проспидина является его способность подавлять синтез и/или освобождение стимуляторов ангиогенеза (VEGF, bFGF, ти-мидин фосфорилаза, ангиогенин). Это предположение нуждается в дальнейшем исследовании и диктует необходимость проведения следующей серии уточняющих экспериментов.
Заключение
Накопленный клинический опыт, свидетельствующий о наличии у проспидина выраженного анти-неоангиогенного действия, стимулировал начало исследований, выясняющих интимные механизмы, лежащие в основе способности подавлять не только развитие сосудистых опухолей, но и развитие метастазов. Настоящее исследование позволило установить, что в экспериментах in vitro проспидин ингибирует основные этапы опухолевого ангиогенеза: пролиферацию, миграцию и формирование капилляроподобных структур в концентрациях до 0,1 мг/мл.
Таким образом, одним из механизмов действия отечественного препарата проспидин является ингибирование ангиогенеза.
Литература
1. Богомолова Н.С., Сускова В.С., Муховатова Л.М. Влияние проспидина и спиробромина на бласттранс-формацию лимфоцитов // Противоопухолевые препараты. - Сб. научн. трудов ВНИХФИ. - М.,1984. -С. 138-41.
2. Гершанович М.Л., Разнатовский И.М., Ястребов В.В. Обоснование клинического изучения проспидина при саркоме Капоши и кожных лимфомах, ассоциированных со СПИДом // Материалы З-й Международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы». - 1995. - С. 58.
3. Петров А.В., Пигарева Н.В., Емельянов С.А., Симбирцев А.С. Влияние проспидина на синтез цитокинов и функциональную активность лимфоцитов в культуре//Цитокины и воспаление. - 2007. - Т. б, № 1. - С. 54-9.
4. Соколова А. С., Фактор В.М., Урываева И.В. Сравнение механизмов антитмитотического действия про-спидина, спиробромина, фопурина и фотрина на модели регенирирующей печени мыши // Противоопухолевые препараты. - Сб. научн. трудов ВНИХФИ. - М., 1984. - С. 132-5.
5. Соколова И.С., Рябоконь Н.А. и др. Влияние проспидина на синтез ДНК в клетках меланомы В1б, костного мозга и эпителия тонкого кишечника мышей // Экспериментальная онкология. - 1980. - № 5. - С. б0-3.
6. Стуков А.Н., Гершанович М.Л., Бланк М.А. и др. Лекарственная терапия опухолей. Под ред. М.Л. Гершановича и В. А. Филова. - СПб: NIKA, 200б. - С. 528.
7. Чернов В.А., Геодакян С.В. О роли плазматической мембраны в механизме противоопухолевого действия проспидина. // Химико-фармацевтический журнал. - 197б. - № 12. - C. 7-13.
8. Чистякова И. А., Самсонов В.А. Тридцать лет применения проспидина в дерматологии // Вестник дерматологии и венерологии. - 1999. - № 3. - С. 41-2.
9. Чупров А. Д. Подавление ангиогенеза как одно из проявлений иммунодепрессивного действия проспидина // Научно-практическая ревматология. - 2000. - № 3. - С.133.
10. Чупров А.Д., Плотникова Ю.А. Результаты применения проспидина после сквозной кератопластики у больных с васкуляризированными посттравматическими рубцами роговицы // Офтальмология на рубеже веков. - Юбилейная научная конференция посвященная 80-летию проф. Волкова В.В. - СПб, 2001. -С.391-2.
11. Чупров А.Д., Плотникова Ю.А. Опыт лечения и профилактики болезни трансплантата после сквозной кератопластики // Тези доповідєй X з’ізд офтальмологів Украши. - Одесса. - 2002. - С. б0-1.
12. Bevacizumab. Anti-VEGF monoclonal antibody, avastin, rhumab-VEGF // Drugs R D. - 2002. - Vol. 3(1). -P. 28-30.
13. Browder T., Butterfield C.E., Kraling B.M. et al. Antiangiogenic scheduling of chemotherapy improves efficacy against experimental drug-resistant cancer // Cancer Res. - 2000. - Vol. б0. - P. 1878-8б.
14. Chistofalli M., Charnsangavej C., Hortobagyi G.N. Angiogenesis modulation in cancer research: novel clinical approaches // Nature Reviews. - 2002. - Vol. 1. - P. 415-2б.
15. Ciardiello F. et al. Inhibition of growth factor production and angiogenesis in human cancer cells by ZD1839 (Iressa), a selective epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor // Clin. Cancer Res. - 2001. -Vol. 7. - P. 1459-б5.
16. Ellis L.M. Tumor Angiogenesis // Horizons in Cancer Res. - 2002. - Vol. 3(1). - P. 4-22.
17. Emmenegger U., Man S., Shaked Y. et al. A comparative analysis of low-dose metronomic cyclophosphamide reveals absent or low-grade toxicity on tissues highly sensitive to the toxic effects of maximum tolerated dose regimens // Cancer Res. - 2004. - Vol. б4. - P. 3994-4000.
18. Hanahan Dю, Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis // Cell. - 199б. - Vol. 8б. - P. 353-б4.
19. Izumi Y., Xu L., di Tomaso E. et al. Tumor biology: Herceptin acts as an anti-angiogenic cocktail // Nature. -2002. - Vol. 41б. - P. 279-80.
20. KerbelR., Folkman J. Clinical translation of angiogenesis inhibitors.//Nature Reviews. - 2002. - Vol. 2. - P. 727-39.
21. Laquente B., Vinalis F., Germa J.R. Metronomic chemotherapy: an antiangiogenic scheduling // Clin. Transl. Oncol. - 2007. - Vol. 9(2). - P. 93-8.
22. Uzzan B., Nicolas P., Cucherat M., Perret G-Y. Microvessel density as a prognostic factor in women with breast cancer: a systematic review of the literature and meta-analysis // Cancer Res. - 2004. - Vol. б4. - P. 2941-55.
23. Yang J.C., Haworth L., Steinberg S.M. et al. A randomized double-blind placebo controlled trial of bevacizu-mab anti-VEGF antibody demonstrating a prolongation time to progression in patients with metastatic renal cancer // Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. - 2002. - Vol. 21. - P. 15.
