CC BY
6
(смертности, инвалидизации и др.), а также ряд других проблем для формирования эффективных программ профилактики.
По нашему мнению, информационная подсистема мониторинга условий труда и состояния здоровья работников производства авиационных двигателей, аналитическая подсистема и организаци-онно-исполнительская подсистема должны включать элементы, отраженные на схеме.
Таким образом, модифицированная нами модель мониторинга за условиями труда и состоянием здоровья работников Моторостроительного объединения им. П. И. Баранова позволяет ввести в практику социально-гигиенического мониторинга индикаторные показатели оценки производственной среды и здоровья работающего населения, которые могут отражать экономи-
ческую и социальную значимость потерь здоровья для общества.
Л ите ратура
1. Ерофеев Ю. В. Долматов В. В., Турчанинов Д. В. Организация и методика проведения социально-гигиенического мониторинга на территории Омской области: Метод, рекомендации МР 5.1/5.2.003-06. - Омск. - 2006.
2. Измеров Н. Ф. // Медицина труда и пром. экол. — 2007. — № 12. - С. 4-8.
3. Измеров Н. Ф. // Материалы 3-го Всероссийского съезда вра-чей-профпаталогов. — Новосибирск. — 2008. — С. 8—21.
4. Концепции долгосрочного социально-экономического развития Российской Федерации на период до 2020 г., одобренного Правительством РФ 17.11. 2008 г. № 1662-р. — М„ 2008.
5. Онищенко Г. Г. // Материалы 10-го Всероссийского съезда гигиенистов и санитарных врачей. — М., 2007. Кн. I. — С. 32-45.
Поступила 08.07.10
Методы гигиенических исследований
С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2011 УДК 614.777:578.811-078
Г. И. Корчак', Е. В. Сурмашева', И. Н. Скороход2, А. И. Михиенкова', А. К. Горесть', Н. А. Никонова'
ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КИШЕЧНЫХ БАКТЕРИОФАГОВ И ПОЛИАЛЮМИНИЕВЫХ КОАГУЛЯНТОВ
'ГУ Институт гигиены и медицинской экологии им. А. Н. Марзеева АМН Украины; 'Украинское общество гигиены и дезинфекции, Киев
Исследован процесс адсорбции-элюции кишечных бактериофагов Т2 и MS2 как модели энтеральных вирусов коагулянтами — оксихлоридом алюминия ( ОХА 7J и сульфатом алюминия (СА).
Установлено эффективное удаление фагов из воды с помощью OX A ls (98,7—100%) и низкая эффективность элюции колифагов из частиц продуктов гидролиза ОХА (0,1—3,7% от исходного количества бактериофагов), что может свидетельствовать о наличии антивирусной активности у ОХА. Менее выражены указанные явления у СА.
Ключевые с л о в а : адсорбция, элюция, колифаги, элюенты, механизм взаимодействия
G. 1. Korchak, Е. V. Surmasheva, /. N. Skorokhodov, А. 1. Mikhiyenkova, А. К. Gorval, N. A. Nikonova. — STUDY OF THE MECHANISMS OF INTERACTION BETWEEN INTESTINAL BACTERIOPHAGES AND POLYA-LUMINUM COAGULANTS
The authors have investigated the adsorption-elution of intestinal bacteriophages T2 and MS2 as a model of enteric viruses, by using the coagulants aluminum oxychloride (AOX7s) and aluminum sulfate (AS).
The investigation has ascertained the effective removal of the phages from water with AOX7s (98.7-100%) and the low efficiency of elution of coliphages from the particles of A OX hydrolysis products (0.1-3.7% of the baseline count of bacteriophages), which may suggest that A OX has antiviral activity. The above phenomena produced by AS are less evident.
Key words: adsorption, elution, coliphages, eluents, mechanism of interaction
Вирусологические исследования воды различного происхождения обычно связаны с необходимостью предварительного выделения вирусов из
Корчак Г. И. — д-р мед. наук, гл. науч. сотр. (korchak_galina@ukr.net); Сурмашева Е. В. — д-р мед. наук, зав. лаб. (esurmash@health.gov.ua); Скороход И. Н. — канд. биол. наук (insk@lysoform.net); Михиенкова А. И. — науч. сотр. (anna_mikhienkova@ukr.net); Торвапь А. К. — канд. биол. наук, ученый секретарь (ЬеаИЬ^оу@ЬеаИЬ. gov.ua); Никонова Н. А. — канд. биол. наук, вед. науч. сотр. (nik@health.gov.ua)
значительных ее объемов в меньшие, обычно составляющие ОЛ —10 см3 в зависимости от цели и использованных методов.
В настоящее время уже предложено более 30 методов концентрации вирусов. Это означает, что до сих пор не существует универсального метода и в зависимости от типа воды, исследуемого вируса и доступных средств тестирования перед вирусологами возникают определенные проблемы.
Наиболее широкое распространение получили методы адсорбции-элюции на различных субстратах [1—3, 8, 9]. Все методы концентрации вирусов
имеют свои преимущества и недостатки, поэтому поиск новых адсорбирующих веществ и элюентов, совершенствование существующих методов выделения вирусов из больших объемов воды остаются актуальными задачами санитарной вирусологии.
Цель работы — изучение адсорбирующих свойств полиалюминиевых коагулянтов, подбор элюентов и исследование механизмов адсорбции и десорбции вирусов при использовании в качестве модели колифагов Т2 и МБ,.
Материалы и методы
В последние годы в процессе водоподготовки вместо сернокислого алюминия с успехом применяют полиалюминиевые коагулянты, в основном это оксихлорид алюминия (ОХА78, ОХА(,8) и оксихлорид сульфата алюминия (ОХСА). На основании результатов проведенных нами исследований [5—7) преимущество отдано ОХА78. Он известен под разными названиями, в частности полиалюминия хлорид, хлоргидроксид алюминия, хлорид алюминия и др., и имеет общую формулу А1(ОН)тС13;, _ ,„. Во время обработки воды полиалюминиевыми коагулянтами образуются мономерные, полимерные и различные аморфные структуры. Перед традиционными алюминиевыми коагулянтами они имеют следующие преимущества: высокая эффективность удаления из воды органических соединений и уменьшения ее цветности, экономичность (2—6 мг/дм} по А1203), совместимость со всеми щелочными реагентами, хорошая растворимость при любой температуре (особенно при низкой), существенное повышение эффективности в случае применения одновременно с флокулянтами.
Указанным не исчерпываются все преимущества ОХА. Это уже достаточно известный коагулянт, который используют во время водоподготовки. Изучена его эффективность для удаления органических и неорганических соединений. К сожалению, не исследованы его свойства в качестве средства для очистки воды от вирусов (их удаления). Нами [5—7] впервые изучены некоторые стороны механизма сорбции вирусов хлопьями продуктов гидролиза ОХА, точнее говоря, условия, которые влияют на эффективность этого процесса. Установлено, что в исследованных объемах воды удаление вирусов может достигать 100%, т. е. ОХА является эффективным веществом для концентрации вирусов. Вместе с тем не изучен такой важный аспект, как элюция вирусов из частиц продуктов гидролиза коагулянта.
Учитывая изложенное, изучили адсорбцию-десорбцию с использованием модели колифаги Т2 и М52 — ОХАп.
По своему строению колифаг МБ2 очень близок к вирусу гепатита А и полиовирусу. Как и указанные представители энтеровирусов, он имеет размер около 27 нм, по форме напоминает двадцатигранник, нуклеиновая кислота представляет собой однонитчатую РНК, вирус не имеет оболочки. Колифаг Т2 имеет ббльшие размеры и более сложное строение, состоит из головки и хвоста
с шестью хвостовыми нитями, размер головки 125 х 81 нм, вирус имеет двунитчатую ДНК и оболочку.
Фаги определяли двухслойным агаровым методом, используя в качестве хозяев для фага MS2 Е. coli Kl2 Hfr, для Т2 Е. coli С.
Для выяснения некоторых особенностей процессов сорбции и элюции вирусов параллельно исследовали их в условиях применения традиционного коагулянта, применяемого на водоочистительных сооружениях в Украине, — сульфата алюминия (CA).
Исследования выполняли по следующей методике. В 2 флакона со стерильной водопроводной водой объемом по 100 см3 вносили кишечный бактериофаг Т2 или MS2 из расчета л • 102 и п • 103 БОЕ/см5. Содержимое флаконов интенсивно перемешивали с помощью встряхива-теля Vortex. Отбирали пробы для установления количества внесенного бактериофага. В один из флаконов добавляли исследуемый коагулянт ОХА78 из расчета 0,1 и 0,01%, во второй — CA — 0,2 и 0,1% по А1,03). Корректировали pH до значения 5,9—6,0.
Пробы перемешивали стеклянной палочкой со скоростью 1 об/с в течение 1 мин и оставляли на 10 мин для контакта коагулянтов с бактериофагами. После этого пробы центрифугировали со скоростью 2000 об/мин в течение 20 мин. Отбирали надосадочную жидкость для определения степени адсорбции фага коагулянтами в процентах, надосадочную жидкость выливали, к осадку добавляли 10 см3 элюента, встряхивали 10 мин, снова центрифугировали и определяли количество БОЕ в 1 см3 фага в элюенте, высчитывали эффективность элюции в процентах к исходному значению.
Для элюции бактериофагов использовали соево-трип-тиказный бульон двойной концентрации (бульон А-2х).
Результаты и обсуждение
В первой же серии исследований с ОХА78 обнаружили, что применение указанного элюента было нерезультативным. Удалось десорбировать лишь 0,09% фага относительно его исходного количества в опытной пробе воды, т. е. взаимодействие OXA7S с фагом Т2 было слишком сильным и неоднозначным.
Известно, что элюция вирусов, которые следует рассматривать как большие молекулы белков, растет с увеличением вязкости растворов элюентов и pH. Поэтому, кроме соево-триптиказного бульона, в дальнейшем использовали мясопептонный бульон (МПБ) с добавлением Na2HP04 в разных комбинациях (МПБ одинарной и двойной концентрации с 4, 8 и 10% Na2HP04 при pH от 8,6 до 9,2).
Для элюции фагов использовали также нетрадиционное соединение трилон Б (натриевая соль эти-лендиаминтетрауксусной кислоты), который в щелочной среде образует комплексные соединения с ионами металлов. Использовали трилон Б в разбав-
Таблица 1
Эффективность элюции колифага Т, (в %) при использовании разных элюентов
Концентрация ОХА, % Бульон А + 8« NaiHPO, Бульон А + трилон Б Бульон А + 10% Na:HPO, + трилон Б Трилон Б (1:3) Трилон Б + 10% Na,HP04 МПБ-2х +Трилон Б + 10% Na;HP04 МПБ-2х + 10% Na,HP04 М т
0,1 1,48 1,00 0,17 0,00 1,20 1,20 2,70 1.11 0,34
0,01 10,40 2,50 0,70 1,90 5,10 5,90 7,90 4,91 1,32
/ 2,79
Р < 0,05
о 120 ш 2 100
7 pH (контроль)
j В начале наблюдения
Через сутки
I Через 2 ч
Рис. 1. Влияние различных значений рН на жизнеспособность колифага Т2.
Контроль количества фага Т: — 106 БОЕ/см1.
лении 1:3 и 1:9, доводили pH до 9,2. Кроме того, растворяли в 4 и 10% Na2HP04 с бульоном А-lx и А-2х, а также вводили в МПБ с 10 % Na2HP04.
Всего применили 10 элюентов. В табл. 1 представлены результаты элюции теми из них, которые давали возможность получать хотя бы какие-то значимые результаты. Наибольший эффект получили при использовании МПБ-2х с добавлением 10% Na2HP04 при pH 9,2. Последующие исследования проводили именно с этим элюентом.
В случае применения трилона Б не получили ожидаемого результата. Трилон Б не вступал во взаимодействие с алюминием, не наблюдалось освобождения фага из образовавшегося комплекса (оксид алюминия + фаг).
Эффективность выбранного элюента МПБ-2х + 10% Na2HP04 при pH 9,2 изучали в сравнительных исследованиях по адсорбции-элюции колифагов Т2 и MS2 при условиях применения коагулянтов ОХА78 и CA. Исходная концентрация фагов в этой серии исследований составляла сотни и тысячи БОЕ/см3, коагулянтов ОХА — 0,1%, CA — 0,1 и 0,2%. Выявили 100% удаление фага MS2 из воды коагулянтом ОХА78. Элюция же составляла всего 0,1—0,8% от исходной величины, что соответствовало 70-345 БОЕ/см3, т. е. 99,2-99,9% бактериофага не удавалось извлечь из комплекса коагулянт + фаг.
Аналогичную картину получили во время исследования эффективности взаимодействия фага Т2 с OXA7S в процессе коагуляции и следующей за нею элюции, которая колебалась в пределах 0,57—3,7%. Оставалось 96,3—99,43% фага Т2 в осадке, который не удавалось отделить от хлопьев коагулянта.
Посевы осадка коагулянта с помощью двухслойного агарового метода дали негативный результат. Корпускулы фага, которые были между частицами продукта гидролиза коагулянта, утрачивали свою активность и не могли инфицировать клетки хозяина, в данном случае Е. coli С или Е. coli К12.
При сравнении результатов элюции фагов МБ2 и Т2 по критерию Стьюдента не обнаружили значимых различий (/= 1,49; р > 0,05). Иными были результаты изучения процессов адсорбции и элюции колифагов коагулянтом СА. Как уже отмечалось, более результативным было удаление из воды этим коагулянтом колифага МБ2 — 96—100%. Ко-лифаг Т2 удалялся СА из воды лишь на 38,8—61%. Взаимодействие СА с фагом Т2 было менее стойким, чем с М$2: удалось элюировать 47,37—57,42% фага Т2 от взятого для исследования количества. Различия эффектов элюции фагов Т2 и МБ, были статистически значимы (/ = 50,35; р < 0,001).
Известно, что начальная фаза коагуляции является наиболее активной в процессе устранения органических и неорганических частиц. Вирусы не являются исключением. Образуется комплекс между трехвалентным ионом алюминия и поверхностными белками вириона вируса. Сравнение результатов элюции фагов из частиц гидролиза СА и ОХА свидетельствует о более выраженной адсорбции ОХА.
Частичная или почти полная невозможность извлечь фаги из осадка ОХА и других коагулянтов трактуется авторами [10] как обеззараживание вирусов коагулянтами. С этим нельзя полностью согласиться, так как не выяснен механизм взаимодействия между составляющими процесса, а следовательно, недостаточна и достоверность конечного результата: происходит гибель вирусов или потеря ими способности инфицировать клетку хозяина. В последнем случае вирус сохраняет свою жизнеспособность и при определенных условиях не исключается возможность возобновления его инфекционное™.
Выраженное взаимодействие частиц продуктов гидролиза коагулянтов с фагами делает невозможным инфицирование вирусами клеток хозяина (мы так считаем на данном этапе работ), что имеет существенное значение в медицине вообще и особенно в гигиене. Поэтому одной из задач было иссле-
] В начале наблюдения
Через сутки
|Через 2 ч
Рис. 2. Влияние различных значений рН на жизнеспособность колифага М52.
Контроль количества фага МЭ, — 34 БОЕ/см'.
2
0
ÜT 40
2 35
« 30
и 25
1 20
s
§ 15
(контроль)
Таблица 2
Динамика рН в процессе гидролиза коагулянтов*
Время воз- ОХА СА
действия 0,1Ж" 156 0,2%* 2%
Начало 1 сут
3 сут
4 сут
5,8 6,5 7.0 7,2
4.3 4,5 4,5 4,5
6,3 7,2
7.7
7.8
4.0
4.1
4.1
4.2
Примечание. — наличие осадка.
— до введения коагулянта рН воды 8,2;
дование некоторых составляющих процесса ад-сорбции-элюции колифагов в коагуляционной системе.
На функционирование коагуляционной системы, в состав которой входят вода, коагулянт, бактериофаг, влияют много факторов. В первую очередь к ним относятся физико-химические характеристики частиц продуктов гидролиза коагулянта данного типа, примеси водной среды, свойства оболочки вирусов, а также сопутствующие условия, в которых происходит взаимодействие составляющих системы (рН, температура, ионная сила, щелочность, количество коагулянта и вируса, длительность контакта и др.). От механизма взаимодействия коагулянта и вируса зависит конечный результат (вирулицидное действие коагулянта или потеря инфекционности вирусом) и эффективность элюции.
Учитывая возможный механизм взаимодействия, можно выделить три составляющих:
— гидролиз коагулянта, сопровождающийся захватом вирусов частицами продуктов гидролиза;
— электростатическое взаимодействие катиона алюминия и поверхности вируса;
— химическое взаимодействие алюминия с пептидами вириона.
Во всех случаях происходит образование комплексов и агломерация образованных асоциантов.
Адсорбция может быть специфической и неспецифической. Известно, что для полиалюминия (в данном случае ОХА) наиболее характерна неспецифическая адсорбция, поскольку ему присуща повышенная активность по отношению к разным микрочастицам растворов, и вирусы скорее всего не являются исключением. Если происходит обычный захват вирусов, то возможно их извлечение после растворения полиалюминия. Если преобладающим является химическое взаимодействие аноми-ния с пептидами вируса, то белок при этом необратимо денатурирует, отделить вирус от алюминия невозможно. Он теряет свою жизнеспособность.
Исходя из этих рассуждений, изучили влияние рН на жизнеспособность фагов и фазы процесса гидролиза коагулянтов, которую считают более значимой как для адсорбции, так и для элюции.
Прежде всего исследовали влияние на жизнеспособность фагов Т2 и МБ; водной среды со значениями рН 5,0, 5,2, 5,4, 5,8, 6,0 и 6,2, при которых активно происходит адсорбция.
На рис. 1 показано колебание количества фагов Т2 за период наблюдения. Можно утверждать, что динамика отсутствует. Количество фагов при всех значениях рН и с течением времени было практически неизменным.
На рис. 2 представлены результаты определения фага МБ2 в тех же условиях эксперимента. В первую очередь необходимо отметить, что уже в начале наблюдения количество фага уменьшалось по сравнению с контролем в 2—4 раза в зависимости от значений рН. Наиболее негативным было влияние рН в диапазоне значений 5,8—6,0. Возможно, это связано с изоэлектрической точкой ко-лифага М52 и при указанных рН происходит частичная денатурация протеинов оболочки. О меньшей жизнеспособности колифага М52 по сравнению с Т2 свидетельствуют статистические данные (/ = 11,83—14,85). Полученные результаты еще раз подтверждают, что колифаг Т2 является более привлекательной вирусной моделью.
Затем изучали влияние фазы процесса гидролиза коагулянтов на рН водной среды. В стеклянные флаконы, наполненные стерильной водопроводной водой, вносили ОХА и СА в концентрации 0,1 и 0,2; 1 и 2% по А1,Оз соответственно. Определяли значение рН сразу, через 1, 3 и 4 сут. Полученные результаты представлены в табл. 2.
Как видно из табл. 2, при низких концентрациях обоих коагулянтов (0,1 и 0,2%) значение рН воды постепенно повышалось и на 4-е сутки достигало щелочных значений (7,2 и 7,8). При высоких концентрациях (1 и 2%) значение рН оставалось почти неизменным.
На следующем этапе исследовали влияние фазы образования продуктов гидролиза на эффективность удаления вирусов и их элюцию из осадка, т. е. пытались выяснить влияние процесса гидролиза на силу взаимодействия между частицами его продуктов и вирусами с учетом того, что первая фаза гидролиза (процесс, происходящий сразу после внесения коагулянта) считается наиболее эффективной.
В предыдущих опытах в воду вносили тот или другой фаг, а затем коагулянт, т. е. первая фаза гидролиза проходила при наличии фагов и взаимодействие было мгновенным (фаг в надосадочной жид-
Эффективностъ элюции колифагов М82* в случае их внесения в осадок коагулянтов
Таблица 3
Этап исследования ОХА, 0,1«, БОЕ/см3 Количество БОЕ в 5 см5 элюента Элюция, % СА 0,2«, БОЕ/см1 Количество БОЕ в 5 см1 элюента Элюция, %
I (надосадочная жидкость) 0,0
II (элюция) 10,0 50,0 1,01
Примечание. * — контроль количества фага М5г — 4950 БОЕ/НЮ см3.
4,0 840,0
4200,0
84,80
кости не определялся уже через 10 мин). На этом этапе исследований фаг Т2 и МБ2 вносили во флаконы с 0,1% ОХА и с 0,2% СА через 4 сут после добавления коагулянта, когда уже закончился процесс гидролиза и значение рН было на уровне 7,2—7,8. Содержимое флаконов перемешивали, потом центрифугировали и проводили элюцию как в предыдущих опытах. Результаты представлены в табл. 3.
Как видно из табл. 3, несмотря на то, что осадок образовался за 4 сут до момента внесения фага, его адсорбция частицами гидролиза ОХА и СА была такой же эффективной, как и на первой стадии гидролиза. Не изменился также результат элюции из хлопьев ОХА: он был на уровне 1,01%. В отличие от ОХА, элюция из хлопьев СА была значительной и достигала 84,8%.
Аналогичные исследования провели с фагом Т2. Получили такие же результаты. Это указывает на то, что внесение фага после окончания первой фазы гидролиза имело значение только для СА. Взаимодействие фага с ОХА было одинаково выраженным независимо от фазы гидролиза, что подтверждает высокую активность полиалюминиевого коагулянта ОХА в отношении вирусов и его бесспорное преимущество.
Относительно механизма взаимодействия коли-фагов и коагулянтов можно допустить следующее. Гидролиз ОХА после его внесения в коагуляцион-ную систему не влияет на прочность связывания бактериофагов, поскольку ОХА — полимер, который прошел предварительный гидролиз, в то время как СА гидролизует связи А1—504 до А1—ОН не сразу, а постепенно, что отражается на его активности относительно удаления вирусов и прочности агломератов, которые образуются. Важное значение во взаимодействии ОХА с фагами имеют также стеричные эффекты, связанные с тем, что ОХА — полимер, в растворах имеет вторичную и третичную структуру и ведет себя как катионный полиэлектролит. При этом возможно, что реакционные центры данного полимера максимально совмещены в пространстве с аналогичными центрами вирусов, т. е. на данном этапе изучения обнаруженного явления можно отдать преимущество неспецифической адсорбции фагов на агломерате гидро-лизованного полиалюмината. Вместе с тем нельзя дать обоснованную оценку жизнеспособности ко-
лифагов после их связывания конгломератами частиц продуктов гидролиза коагулянтов. На наш взгляд, на данном этапе можно говорить лишь о наличии антивирусной активности у ОХА и менее выраженной такой же активности у СА, которая сопровождается потерей фагами способности инфицировать клетки хозяина.
Таким образом, во время поиска эффективных сорбентов с целью их применения для концентрирования вирусов в случае исследований больших объемов питьевой воды, а именно при использовании такого высокоактивного коагулянта, как ОХА, обнаружена обратная сторона этого процесса — невозможность отделить вирусы от хлопьев коагулянта. Полученные результаты дают возможность допустить мысль о наличии антивирусной активности у полиалюминиевих коагулянтов. Обнаруженное явление имеет важное практическое значение для очистки воды от вирусов и не менее важное теоретическое, состоящее в необходимости синтеза других полимерных коагулянтов для очистки от вирусов воды и других жидкостей, применяющихся в разных отраслях медицины и биологии.
Литература
1. Амвросьева Т В., Дьяконова О. В., Шарко Р. М. и др. // Мед. новости. - 1998. — № 7. - С. 43-44.
2. Багдасарьян Г. А., Веселинова-Стоянова Ц. Б., Мышляева Л. А., Семкина Т. И. // Научное обоснование гигиенических мероприятий по оздоровлению объектов окружающей среды: Сборник трудов. — М., 1983. — С. 99—103.
3. Григорьева Л В., Корчак Г. И. // Гиг. и сан. — 1977. — № 6. - С. 62-64.
4. Дроздов С. Г., Казанцева В. А. // Вестн. АМН СССР. -1981.-№3.-С. 85-93.
5. Корчак Г. И., Скороход И. Н. // Химия и технол. воды. — 2003. - Т. 25, № 6. - С. 585-593.
6. Корчак Г. И., Скороход И. Н., Сурмашева Е. В. // Гиг. и сан. - 2006. - № 1. - С. 37-39.
7. Скороход 1.М. // Ппена населених мюць: 36. наук. пр. — Киш, 2003. - Вип. 42. - С. 95-100.
8. Широбоков В. П. Применение бентонита для концентрирования и очистки ЭВ // Вопр. вирусол. — 1974. — № 2. — С. 228-233.
9. Lukasik J., Scott Т. М., Andryshak D„ Farrah S. R. // Appl. Environ. Microbiol. - 2000. - Vol. 66, N 7. - P. 2914-2920.
10. Matsui Y., Matsushita Т., Sakuma S. et al. // Environ. Sci. Tech-nol. - 2003. - Vol. 37, N 22. - P. 5175-5180.
Поступил» 22.03.10
