CC BY
5
УДК 628.312.576.858.23+б7в.858.9:576.851.48]: 543.39
Н. К. Лепахина
ИЗУЧЕНИЕ УСЛОВИЙ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ВИРУСА ПОЛИОМИЕЛИТА И БАКТЕРИОФАГОВ Е. НА ИОНООБМЕННЫХ СМОЛАХ
Институт общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Сысина АМН СССР, Москва
Некоторые ионообменные смолы можно с успехом применять для выделения из воды вирусов (Е. Л. Ловцевич; Е. Л. Ловцевич и В. Ф. Локтева; Л. В. Григорьева; В. Ф. Локтева и соавт.).
Нами было предпринято сравнительное изучение ряда ионообменных смол отечественного производства (уже выпускаемых промышленностью, а также экспериментальных) с целью выяснения возможности их использования для выделения энтеровирусов и бактериофагов из воды открытых водоемов и питьевой воды. В ранее опубликованных исследованиях мы провели оценку концентрирующей способности в отношении вирусов 14 ионообменных смол— 11 анионитов и 3 катионитов (Г. А. Багдасарьян и соавт.).
Концентрирование на ионообменных смолах состоит из 2 основных процессов — сорбции и элюции, эффективность которых, как показали полученные результаты, зависит от целого ряда моментов. Для установления оптимальных условий обработки воды на искусственных ионооб-менниках было проведено детальное изучение влияния на степень концентрирования вирусов таких факторов, как подготовка смол, степень загрязнения, pH и объем исследуемой воды, присутствие в ней хлористых соединений, вид и исходное содержание микроорганизмов в воде, а также условия элюции.
Исследования проводили на 3 ранее отобранных анионитах — AB-17-8, АН-22Д, АН-31Г, а также на смоле АВ-17-ИК и новых партиях смолы АВ-17-8. Эти смолы обладают хорошими сорбционными свойствами, высокой скоростью фильтрации, не оказывают токсического действия на микроорганизмы и культуру ткани и позволяют проводить последующую десорбцию активного вируса со смолы.
Принимая во внимание данные о том, что некоторые аниониты в гид-роксильной форме оказывают вирулицидное действие, в то время как их хлор-форма не дает такого эффекта (Е. В. Штанников), аниониты в опытах применяли в хлор-форме. Первоначально перевод в хлор-форму высокоосновных анионитов проводили с помощью 10% раствора NaCl, а низкоосновных — с помощью 2% раствора HCl. Однако нами было установлено, что обработка и тех, и других анионитов смесью равных объемов растворов 2% HCl и 10% NaCl не снижает сорбционных свойств смолы и является равноценной. Поэтому для перевода в хлор-форму как низко-, так и высокоосновных анионитов можно рекомендовать следующий способ их обработки. Сухую ионообменную смолу замачивают в течение 2—3 ч в дистиллированной воде. Затем воду сливают и смолу троекратно обрабатывают смесью из равных объемов свежеприготовленных растворов 2% HCl и 10% NaCl. Общая продолжительность контакта составляет 24 ч. После этого смолу отмывают дистиллированной водой до тех пор, пока pH промывных вод не достигнет 5,5—6,0. Такой обработке следует подвергать также смолы, выпускаемые в хлор-форме, для удаления возможных примесей гидроксильной формы, ионов тяжелых металлов и пр. В случае необходимости смолу можно стерилизовать кипячением в течение 10 мин, так как данная процедура, согласно нашим экспериментам, не ухудшает ее концентрирующей способности.
Подготовленные таким образом смолы помещали в стеклянные колонки диаметром 1,2—1,5 см, высота столбика смолы составляла 10—12 см. Через
S«
колонку с соответствующей смолой пропускали искусственно зараженную дехлорированную водопроводную или речную воду в объеме 1—3 л со скоростью 10—12 мл/мин. Для элюции адсорбированных на анионите вирусов в колонку со смолой вносили 10 мл элюирующего раствора и оставляли на 1 ч при комнатной температуре. В качестве тест-микроорганизмов были использованы вирус полиомиелита I типа LS с 2ав и бактериофаги Е. coli Т1 (ДНК-содержащий) и MS2 (РНК-содержащий). Инфицирование воды осуществляли со множественностью 10°—102 БОЕ/мл каждого микроорганизма. На наличие вирусов исследовали пробы исходной воды, фильтратов и элюатов, предварительно обработанные хлороформом и антибиотиками для подавления сопутствующей микрофлоры. Количественное определение вируса полиомиелита проводили по методу Дульбекко и Фогта (в БОЕ/мл), а также титрованием на первичной культуре клеток почек зеленых мартышек и перевиваемой линии клеток МК (в lg ТЦД50). Бактериофаги учитывали методом агаровых слоев с использованием бактериальных культур Е. coli В и Е. coli HLP. Влияние каждого из названных выше факторов на эффективность концентрирования вирусов с помощью ионообменных смол было изучено в 10—15 сериях опытов, данные которых были обработаны статистически.
При обработке искусственно зараженной водопроводной и речной воды на колонках с анионитами было установлено, что с повышением степени загрязнения воды эффект концентрирования вирусов заметно снижается. Так, при исследовании дехлорированной водопроводной воды, искусственно обсемененной вирусом полиомиелита и фагами MS2 и Т1, при концентрациях 10°—107мл каждого микроорганизма на смоле АВ-17-8 наибольшая кратность концентрирования достигала 45, 42 и 20 раз соответственно. При обработке этим методом речной воды кратность концентрирования снижалась вдвое и для полиовируса составляла 26, фага MS2—20 и фага Т1 — 10 раз.
В серии опытов, поставленных с водопроводной и речной водой, искусственно зараженной фагом Т1, было показано, что загрязненную речную воду целесообразно пропускать через колонку со смолой в объеме 1 л, а чистую водопроводную — в объеме не менее 3 л. При исследовании водопроводной воды процент выделения фага повышался пропорционально увеличению объема пробы, т. е. в 2—3 раза (при исследовании 3 л). В случае обработки 3 л загрязненной речной воды фильтрация сильно замедлялась из-за забивки колонки. Повышение процента выделения вируса при этом не соответствовало увеличению объема пробы, очевидно, вследствие загрузки активных ионных группировок смолы органическими соединениями, присутствующими в речной воде, в результате чего происходило истощение ее обменной емкости.
В опытах по определению влияния pH исследуемой воды на степень сорбции микроорганизмов на анионитах были использованы бактериофаги MS2 и Т1. Перед инфицированием исследуемую воду предварительно подкисляли с помощью 0,5 NHC1, значение pH воды варьировало от 3 до 8. Наибольшая степень адсорбции всех изучавшихся микроорганизмов на апробированных смолах достигалась при pH воды 5,5—6,5. Так, на смоле АН-22Д степень сорбции фагов MS2 и Т1 при pH 5,5—6,5 составляла 85 и 67% соответственно. В натурных исследованиях речной воды с помощью смолы АВ-17-8 наибольшая сорбция энтеровирусов, в том числе и вируса полиомиелита, наблюдалась также при pH 5,5—6,5 и снижалась с повышением pH.
Было изучено влияние на степень концентрирования вирусов прибавления в исследуемую воду некоторых хлористых соединений. В исходные пробы вводили СаС12, MgCl2 и А1С13 до конечной концентрации 10, 10 и 0,5 мг/мл соответственно. Исследования, проведенные со смолами АВ-17-ИК и АН-31Г, показали, что наибольший эффект концентрирования фага
Т1 достигался при введении СаС12. Так, степень концентрирования его повышалась с 34 до 72 (при множественности заражения 10°—107мл. Добавка М^12 давала несколько меньший эффект. Фактор концентрирования при этом составлял 54. Прибавление А1С13 оказывало, по-видимому, вирулицидное действие, так как ни в фильтрате, ни в элюате вирус обнаружить не удалось. Следует указать, что добавление СаС12 в исследуемую воду в ряде экспериментов, не вызывая повышения степени адсорбции фага, тем не менее способствовало заметному увеличению кратности его концентрирования. Очевидно, это было обусловлено тем, что введение СаС12 вызывает дезагрегацию конгломератов вирусных частиц и вследствие этого повышение их содержания в фильтрате и элюате.
В значительной мере эффективность концентрирования вирусов с помощью ионообменных смол определяется исходным содержанием микроорганизмов в исследуемой воде. Как показали результаты наших исследований, при содержании вирусов в воде порядка 10°—107мл кратность концентрирования их является максимальной на всех апробированных ионообменных смолах. Наилучшей концентрирующей способностью в отношении изученных микроорганизмов обладает смола АН-31Г. По эффективности к ней близки аниониты АВ-17-ИК и АВ-17-8 (серия 1974 г.). Необходимо отметить, что результаты опытов со смолой АВ-17-8 в значительной мере варьировали при использовании разных партий этой смолы, что, вероятно, объясняется нерегулярностью дивинилбензоловых сшивок, а следовательно, и неравномерной пористостью смолы. Это подтверждается также тем, что изопористая смола АВ-17-ИК дает более стабильные результаты. Следует указать, что в большинстве случаев фаги концентрировались в меньшей степени, чем вирус полиомиелита. Причем процесс концентрирования РНК-вого фага МБ2 был более близок к процессу концентрирования вируса полиомиелита, чем ДНК-вого фага Т1. Таким образом, с помощью фагов можно получить лишь ориентировочные данные о концентрировании эитеровирусов на ионообменниках.
При изучении процесса элюции вирусов с ионообменных смол был апробирован целый ряд элюирующих растворов, эффективность которых определялась в опытах с пробами водопроводной воды, зараженной фагом Т1 в концентрации 107мл, на смоле АВ-17-ИК. Исходя из литературных данных о том, что десорбция вирусных частиц с ионообменников осуществляется легче и полнее при щелочной реакции среды, в экспериментах применяли элюирующие растворы с рН в интервале от 7,5 до 9,0. Перед исследованием щелочные элюаты нейтрализовали с помощью 0,25 М КН2Р04.
При сравнительной оценке алюирующих растворов удалось установить, что наиболее полное освобождение вируса со смолы производится раствором Эрла рН 8,2 (десятикратный концентрат). Кратность концентрирования при этом достигала 20. Хорошей элюирующей способностью обладают также 0,5 М фосфатный буфер рН 8,2, бычья сыворотка, бульон Хот-тингера рН 8,4 и бульон Хоттингера с 10% бычьей сыворотки рН 8,2. При добавлении в исследуемую воду СаС12 эффективность последних приближается к эффективности раствора Эрла. Элюаты целесообразно исследовать непосредственно после концентрирования, так как титр вирусов, и в первую очередь бактериофагов, заметно снижается при длительном хранении.
Интересно отметить, что при количественном учете вируса полиомиелита в пробах по цитопатическому действию (в ^ ТЦД50/мл) удавалось получить более стабильную и высокую кратность концентрирования, чем при определении его по методу БОЕ/мл. Наши наблюдения согласуются с данными Кой. Очевидно, метод ТЦД50 является более чувствительным и надежным при количественном определении вируса в санитарно-вирусо-логических исследованиях.
Выводы
1. Для выделения вирусов из воды ниаболее пригодны аниониты АВ-17-ИК, АВ-17-8, АН-22Д и АН-31Г, причем наиболее эффективны смолы АВ-17-ИК и АН-31Г.
2. Максимальная кратность концентрирования достигается при исследовании больших объемов (не менее 3 л) чистой, свободной от органических взвесей воды, содержащей микроорганизмы в малых количествах
БОЕ/мл). Бактериофаги концентрируются в меньшей степени, чем вирус полиомиелита.
3. Оптимальными условиями концентрирования вирусов на ионообменных смолах являются: предварительное подкисление исследуемой воды до рН 5,5—6,5 и прибавление к ней СаС12 до конечной концентрации 10 г/л; элюция вируса при помощи раствора Эрла рН 8,2, бульона Хот-тингера с 10% бычьей сыворотки рН 8,4 или 0,5 М фосфатного буфера рН 8,2; вирусологическое исследование проб воды непосредственно после концентрирования.
ЛИТЕРАТУРА. БагдасарьянГ. А., ЛовцевичЕ. Л., Ле-п а х н н а Н. К. — «Гиг. и сан.», 1975, № 4, с. 106—107. —Григорьева Л. В.— Там же, 1968, №7, с. 102—104. — Л о в ц е в и ч Е. Л. — В кн.: Материалы 6-й Всесоюзной конференции по вопросам санитарной микробиологии. М., 1966, с. 72— 73. — Л о в ц е в и ч Е. Л., Л о к т е в а В. Ф. — «Труды Ин-та полиомиелита и вирусных энцефалитов», 1970, т. 14, с. 138—141. — Локтева В. Ф., Ч у м а к о в М. П., Жеван дрова В. И. и др. — Там же, 1973, т. 21, вып. 2, с. 64—68. — Ш т а н -н и ко в Е. В.—«Гиг. и сан.», 1965, № 11, с. 29—33. — К о 11 J., NupenE. М., RossW. R. — «Water Res.», 1975, v. 9, p. 869—873.
Поступила 22/111 1976 r.
УДК 618.632.799.3.027.237-074
JJ. С. Семочкина, канд. хим. наук М. М. Голутвина ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ss?Np В МОЧЕ
Нептунию-237 обычно сопутствуют изотопы плутония и урана. Поэтому анализ проб мочи должен предусматривать отделение этих элементов. Описанные в литературе методы анализа биологических проб на нептуний основаны на принципах жидкостной экстракции (Miller и Biggerstaff; Perkins) или экстракционной хроматографии (Santori и соавт.; Delle Site). Для их осуществления требуются реактивы и материалы, которые не выпускаются отечественной промышленностью. Завершаются эти методы электролитическим выделением 237Np на подложку из нержавеющей стали и измерением а-активности препарата. Эффективность счета при этом невысока, а время, требуемое для изменения активности, составляет несколько часов.
Нами предложен способ определения 237Np в моче, который имеет определенные преимущества по сравнению с существующими. Для концентрирования и выделения изотопа вместо экстракционных процессов использованы процессы соосаждения. а-Активность нептуния предложено регистрировать в слое твердого сцинтиллятора эффективностью 95—100%, что значительно снижает затраты времени на измерение препарата. Метод не требует высокой квалификации исполнителя, сложной и дорогостоящей радиометрической аппаратуры и недоступных реактивов. В пробы мочи перед анализом мы вносили калиброванные растворы 237Np, 239Pu или U, обогащенные изотопами с массами 234 и 235. Для отделения нептуния от плутония и урана определяли возможность его соосаждения с фениларсо-натом и фосфатом циркония. Были найдены условия, при которых нептуний находится в валентном состоянии (4-f), а плутоний и уран — в состояниях (3+) и (6+) соответственно. Установлено, что для улучшения очистки от плутония необходимо проводить восстановительную процедуру до
