К МЕТОДИКЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ВИРУСОВ В ВОДЕ Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

хроматография в неорганическом анализе. М., 1974. — Маркина Н. А. — «Гиг. и сан.», 1973, № 7, с. 82—84. — Ackermann G., Löwe W., Kaden W. — »Acta chim. Acad. Sei. hung.», 1975, v. 85, p. 1—12. — ZechesM., Ledouble G. — «Sei. Techn. Pharm.», 1974, № 10, p. 617—628.

Поступила 21/1X 1976 г.

УДК 914.777-078:576.85/

Доктор мед. наук Л. В. Григорьева, канд. мед. наук Г. И. Корчак

К МЕТОДИКЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ВИРУСОВ В ВОДЕ

Киевский научно-исследовательский институт общей и коммунальной гигиены им

А. Н. Марзеева

С целью выработки унифицированных методов концентрации вирусов в воде нами изучены некоторые методические приемы. В опытах использованы отечественный анионит АВ-17 (Г. А. Багдасарьян и соавт.) и поли-акриламид производства ГДР (Walter). Полученные результаты сравнивали с результатами применения предложенных ранее нами методов концентрации на анионите ЭДЭ-ЮП (Л. В. Григорьева).

В качестве тест-вирусов браЛи вакцинный штамм полиовируса I типа и бактериофаг М^. Последний использован в качестве модельного вируса для первичной апробации. Концентрацию вирусов в воде на ионите АВ-17 проводили согласно методике Г. А. Багдасарьян и Е. JI. Ловцевич с некоторыми уточнениями. Смолу испытывали только в хлоридной форме, что позволяло получать более высокие результаты. После замачивання в дистиллированной воде смолу переводили в хлоридную форму путем обработки ее в течение 3—4 дней 0,1 или 0,5 н. HCl из расчета 0,5 л кислоты на 1С0 мл набухшей смолы. Затем ее промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции. Обработанную смолу заливали в бюретку на 100 мл, на дне которой помещали кусочек ваты. Высота столбика смолы 10 см. После использования смолу кипятили и регенерировали, как описано выше.

Для исследования стерильную водопроводную воду обсеменяли фагом в различных концентрациях — от единичных до сотен бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл воды. Инфицирующие дозы были различны для выявления возможного изменения чувствительности метода, зависящей от инициального количества вируса. Исходную пробу фильтровали через колонку с ионитом с различной скоростью: 100мл воды за V2, 1, 21/2 ч, меняя при этом концентрации фага. Установлено, что независимо от исходной концентрации фага его полная адсорбция наступала только при скорости фильтрации 100 мл не менее чем за 21/2 ч.

Элюировали адсорбированный фаг 0,25 М фосфатным буфером, а также 0,5 М NaCl в фосфатном буфере (pH обоих растворов 8,0). Элюирование проводили как в статических, так и в динамических условиях. Перед этим бюретку со смолой продували грушей для удаления остатков воды, заливали 10 мл одного из указанных растворов и фильтровали с той же скоростью, что и при фильтрации исходной пробы воды. При элюировании в статических условиях буфер в колонке со смолой оставляли на 1 ч при комнатной температуре, затем одномоментно отбирали элюат. Опыты с каждой концентрацией проводили в 3 повторностях. Бактериофаг определяли методом Грацита. Установлено, что элюция фага происходила непостоянно, иногда она отсутствовала. Некоторое увеличение БОЕ-фага в элюате отмечено в 4 из 12 серий, в остальных случаях происходила потеря концентрации фага в элюате по сравнению с исходной.

Проведенные по данному методу исследования позволяют заключить, что полная адсорбция вируса наблюдается при скорости фильтрации не менее 0,6 мл/мин. Существенного различия при элюции фага 0,25 М

фосфатным буфером или 0,5 М NaCl в фосфатном буфере не установлено* Результат элюиии не зависит от ее проведения в статике или динамике. Эффект десорбции бактериофага на ионите непостоянен и сопровождается потерей фага или незначительным увеличением его концентрации.

Концентрацию вакцинного штамма вируса полиомиелита на ионите АВ-17 производили также, как при работе с бактериофагом. Для обсеменения стерильной водопроводной воды использовали вирус с титром 5,0 lg ТЦД so/мл- В качестве элюантов, кроме упомянутых, использовали фосфатный мясо-пептонный бульон рН 8,6. Для удаления сопутствующей микрофлоры к пробам добавляли 2 мл эфира, тщательно встряхивали 10 мин и оставляли под ватной пробкой до следующего дня при 4°С для испарения эфира. Пробы титровали методом десятикратных разведений с использованием перевиваемых культур клеток.

При скорости фильтрации 100 мл воды в течение 2V2 ч вирус адсорбировался полностью. Элюация вируса происходила постоянно при использовании всех указанных элюантов. Концентрация вируса достигнута во всех случаях, за исключением 2 серий, в которых увеличение титра вирусов было на 0,24—0,26 lg, что находится в пределах стандартной ошибки титра вируса, определяемой по формуле Пицци. Среднее увеличение титра вируса при элюции 0,25 М фосфатным буфером было на 0,82±0,12 lg, 0,5 М NaCl в фосфатном буфере'—на 1,13±0,21 lg, фосфатным мясо-пептонным бульоном—на 1,0±0,1 lg.

Концентрацию вирусов в воде с помощью полиакриламида производили согласно предложенной методике (Walter). Обсеменяли вирусом 1 л стерильной водопроводной воды, тщательно перемешивали и добавляли 2 мг/л полиакриламида и 200 мг/л A12(S04)3. Реактивы равномерно распределяли в пробе и устанавливали рН в пределах 5,4—5,6. Затем пробу оставляли при комнатной температуре на 3—4 ч для седиментации образовавшихся хлопьев А1 (ОН)3. Надосадочную жидкость сливали, а осадок центрифугировали при 3500 об/мин в течение 30 мин. Из 1 л воды получали около 3 мл осадка, который отмывали физиологическим раствором рН 7,2 и снова центрифугировали. К осадку добавляли 0,15 или 0,5 М фосфатно-буферный раствор 8,2 до общего объема 10 мл и 1 мл эфира (при работе с вирусом полиомиелита). Осадок тщательно встряхивали в течение 10 мин и оставляли до следующего дня под ватной пробкой при 4°С для испарения эфира. Затем определяли вирусы в исходной надоса-дочной жидкости и осадке по описанным выше методам.

Адсорбция вирусов полиакриламидом была полной. В надосадочной жидкости вирусы не определяли. В осадке происходило лишь некоторое увеличение БОЕ-фага. Более высокие показатели получены по концентрации вируса полиомиелита (см. таблицу). В осадке вируса было на 1,51± ±0,15 lg больше, чем в исходной жидкости. Более эффективной была обработка осадка 0,5 М фосфатным буфером.

По той же методике проведены исследования со 100 мл воды, как и при оценке анионита АВ-17. Различие в объемах исследованной воды не сказалось на результатах исследований.

Концентрация вируса полиомиелита I типа полиакриламидом

Тнтр вируса, ТЦД

50/мл

в исходной пробе

2,24 2,24 1.24 1,74 1.74

в надосадочной жидкости

0 0 0 0 0

в осадке

£

Si «оно.

— МО

оМ

3,5 3.5 2,5

5 Ё е-

3.5 3,74

увеличение в осадке

«

S3

ю *

- 5 &

. в «

о-в-«

1,26 1,26 1,26

S =

из н а . « V

о-е-&

1,76 2,6

Сравнительная оценка 2 методов позволила выявить, что концентрация вируса полиомиелита с помощью полиакриламида более эффективна, чем с анионитом АВ-17 при использовании в качестве элюанта 0,25 М фосфатного буфера рН 8,0 (<=3,83, P-CO.Ol). Применение для элюции вируса со смолы 0,5 М NaCl в фосфатном буфере рН 8,0 позволило повысить выделяемость вируса и приблизить ее к эффективности концентрации вируса на полиакриламиде (/=1,3, Я>0,05). Необходимо также отметить, что с полиакриламидом достигнуты более стабильные показатели. В то же время концентрация с помощью ионита АВ-17 более проста и удобна в методическом отношении.

Учитывая полученные результаты, а также опыт наших предыдущих экспериментальных и натурных исследований, можно рекомендовать для практических условий следующую модификацию метода для повышения концентрации вирусов в воде. Целесообразно использовать двухэтапную концентрацию на марлевых тампонах по Мору, а затем на ионите АВ-17, ЭДЭ-10П или полиакриламиде. Такой прием позволяет повысить дополнительно концентрацию вирусов, хотя и не дает возможность определить их количество в единице объема воды. Метод тампонов широко апробирован и позволяет определять наличие не только постоянно пребывающих, но и транзиторных вирусов в водоемах и сточной воде. При использовании двухэтапного метода в натурных условиях в сточных водах мы достигли увеличения выделяемости энтеровирусов почти в 2 раза по сравнению с одноэтапной концентрацией на анионите (В. И. Бондаренко и Л. В. Григорьева). Метод марлевых тампонов сказался также эффективным при вирусологическом контроле морской воды (Л. В. Григорьева), когда применение ионитов затруднено в силу высокой минерализации.

ЛИТЕРАТУРА. Багдасарьян Г. А., Ловцевич Е. Л. Индикав ция и инактивация кишечных вирусов в объектах внешней среды. М., 1972. — Багдасарьян Г. А., Ловцевич Е. Л., Лепахина Н. К. — «Гиг. и сан.», 1976, № 4, с. 106—107. — Б о н д а р е н к о В. И., Г р и г о р ь е в а Л. В. — В кн.: Кишечные инфекции. Вып. 5. Киев, 1972, с. 187—189. — Григорьева Л. В. Энтеро-вирусы во внешней среде. М., 1968. —Она же. Санитарная бактериология и вирусология водоемов. М., 1975. — Walter R. — tZ. ges. Hyg.», 1974, Bd 20, S. 691—699.

Поступила 28/IX 1976 r.

УДК 613.632:678.4.02«

Н. Ю. Грушевская, Н. Ф. Казаринова

РАЗДЕЛЬНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОКОЛИЧЕСТВ ЦИМАТА, ЭТИЛЦИМАТА И ВУЛКАЦИТА П-ЭКСТРА-Н ПРИ САНИТАРНО-ХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ РЕЗИН

Всесоюзный научно-исследовательский институт гигиены и токсикологии пестицидов, полимерных и пластических масс, Киев

Производные дитиокарбаминовой кислоты •— диметилдитиокарбаминат цинка (цимат), диэтилдитиокарбаминат цинка (этилцимат) и этилфенил-дитиокарбаминат цинка (вулкацит П-экстра-Н), широко применяемые в качестве ускорителей вулканизации \ могут мигрировать из резин в контактирующие среды, в частности в пищевые продукты,что может при определенных условиях оказать неблагоприятное воздействие на состояние здоровья человека.

При изучении возможности использования резин в контакте с пищевыми продуктами возникает необходимость идентификации и раздельного определения микроколичеств^указанных веществ в модельных растворах, ими-

1 Цимат является также основным продуктом превращения в процессе вулканизации широко применяемого ускорителя вулканизации — тиурама (тетраметилтиурамдисульфида) Г. А. Блох).