CC BY
52
ЭКСПЕРИМЕНТАЛ ЬН Ы Е ИССЛЕДОВАНИЯ
ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ В КЛЕТКАХ МЕТАСТАЗОВ АДЕНОКАРЦИНОМЫ ТОЛСТОЙ КИШКИ
В.В. Делекторская, А.Г. Перевощиков, Н.Е. Кушлинский
Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, г. Москва
Исследование проводили с целью оценить особенности экспрессии белковых маркеров пт 23 и c-erbB-2 при развитии метастазов рака толстой кишки в печени. Иммуногистохимическое изучение экспрессии пт 23 и c-erbB-2 проведено на 64 первичных опухолях, 19 метастазах в лимфатических узлах и 37 метастазах в печени. Было найдено, что более выраженная экспрессия пт 23 и c-erbB-2 в клетках первичной опухоли наблюдается в случаях рака толстой кишки с метастазами в печени. Экспрессия белка пт 23 определялась 6б %, а белка c-erbB-2 - в 59 % метастазов РТК в печени. Результаты исследования позволяют предположить, что экспрессия белков пт 23 и c-erbB-2 отражает биологическое поведение опухоли и может оказаться важным фактором в развитии метастазов колоректального рака.
STUDY OF EXPRESSION OF MOLECULAR-BIOLOGICAL MARKERS IN CELLS OF COLON ADENOCARCINOMA
METASTASES
W Delektorskaya, A.G. Perevoshikov, N.E. Kushlinsky
N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS, Moscow
The purpose of the study was to assess the expression of nm 23 and c-erbB-2 protein markers in the development of liver metastases from colon cancer (CC). Immunohistochemical study of nm 23 and c-erbB-2 expressions was conducted on 64 primary tumors, 19 metastases in lymph nodes and 37 liver metastases. More pronounced nm 23 and c-erbB-2 expressions in primary tumor cells were found to be observed in patients with CC liver metastases. Expressions of nm 23 and c-erbB-2 proteins were determined in 66 % and 59 % of CC liver metastases, respectively. The results of the study show that the expression of nm 23 and c-erbB-2 proteins reflects the biological tumor behavior and can be the main factor in the development of colorectal cancer metastases.
Изучение уровня экспрессии различных молекулярно-биологических маркеров в клетках злокачественных новообразований человека дает возможность оценить целый ряд факторов прогноза заболевания, в том числе способность опухолевых клеток к метастазированию. Рак толстой кишки является одной из наиболее часто встречающихся форм злокачественных опухолей, особенно в экономически развитых странах, поэтому разработка новых методов оценки прогноза с использованием молекулярно-биологических маркеров остается актуальной задачей Экспрессия различных белковых маркеров наблюдается во многих типах раковых опухолей человека и связана с прогрессированием процесса. Вместе с тем значение большинства этих маркеров при развитии метастазов рака толстой кишки окончательно
не выяснено. Для рака толстой кишки, как и для опухолей других типов, характерна нестабильность генетического аппарата клеток, к наиболее частым проявлениям которой в клетках опухолей относятся нарушения структуры хромосом. В частности, при раке толстой кишки большое значение имеют нарушения хромосомы 17, поскольку они ассоциированы с неблагоприятным прогнозом. Наиболее важными маркерами, вовлеченными в процессы клеточной пролиферации, дифференцировки и контроля метаста-зирования, являются белки пт 23 и с-егЪБ-2. Гены, кодирующие исследуемые белки, расположены на длинном плече 17-й хромосомы.
Ген пт 23-Н1 расположен на хромосоме 17q21 и кодирует белок с относительной молекулярной массой 17 кД. Первоначально ген пт 23 был описан как
супрессор метастазирования [1, 4, 7]. Однако в дальнейшем были отмечены более сложные взаимоотношения между появлением в раковых клетках продукта гена пт 23 и метастатической активностью опухоли [2, 5]. Г иперэкспрессия белка пт 23 определяется при ряде злокачественных опухолей, таких как рак легкого, толстой кишки, молочной железы, желчного пузыря, гортани, меланома.
Ген с-егЬВ-2 является одним из генов, имеющих значение как маркер прогрессии целого ряда злокачественных новообразований. Он расположен на хромосоме 17q21 и кодирует трансмембранный гликопротеин с относительной молекулярной массой 185 кД, который обладает тирозинкиназной активностью и структурно гомологичен рецептору эпидермального фактора роста. Установлено, что высокая экспрессия белка в основном связана с амплификацией гена и коррелирует с плохим прогнозом [8, 10]. Гиперэкспрессия белка с-егЬВ-2 определяется при раке молочной железы, легкого, толстой кишки, желудка, эндометрия.
Цель настоящего исследования - оценка взаимосвязи особенностей экспрессии двух белковых маркеров (пт 23 и с-егЬВ-2) с прогнозом и развитием метастазов рака толстой кишки.
Материал и методы
В исследование включены клинические наблюдения и материал биопсий от 64 больных (43 мужчины и 21 женщина, в возрасте от 25 до 67 лет), оперированных по поводу рака толстой кишки. Больные были разделены на две группы, в одной из которых в различные сроки после хирургического вмешательства у пациентов развились отдаленные метастазы, а в другой - по клиническим данным метастазы не определялись. В первой группе были изучены 32 первичные опухоли толстой кишки и их метастазы, включающие 19 метастазов в регионарных лимфатических узлах, 37 метастазов в печени, в том числе 5 повторных, а также 2 метастаза в легких и 1 в надпочечнике. В данной группе был также изучен прогноз заболевания после резекции печени по поводу метастазов рака толстой кишки: неблагоприятный прогноз (выживаемость менее 3 лет) - 20 больных и благоприятный прогноз (выживаемость более 3 лет) - 12 пациентов.
Во второй (контрольной) группе были исследованы 32 опухоли толстой кишки. Для определения гистологического типа опухоли, степени ее диффе-ренцировки и уровня инвазии, а также наличия реги-
онарных и отдаленных метастазов изучали парафиновые срезы, окрашенные гематоксилин-эозином и оценивали по Крейбергу (на слизь). Во всех исследованных случаях были диагностированы аденокарциномы толстой кишки (АТК) различной степени диф-ференцировки. Оценивали также морфологические особенности метастазов рака в печени (табл. 1).
Таблица 1 Морфологическая характеристика метастазов рака толстой кишки в печени
Характеристика опухолевого процесса Количество больных
Абс. %
Дифференцировка опухоли:
Высокодифференцированная 5 15,6
Умеренно-
дифференцированная 20 62,5
Низкодифференцированная 7 21
Характер роста:
Аппозиционный 9 28
Инфильтративный 17 53
Смешанный 6 18
Наличие фиброзной капсулы 6 18
Слизеобразование 7 21
Инвазия сосудов 14 43,7
Наличие зон некроза 9 28
Лимфоидная инфильтрация 23 71,8
Иммуногистохимическое окрашивание выполнено на серийных парафиновых срезах ткани первичных опухолей и метастазов с предварительной обработкой в СВЧ печи и использованием коммерческих моноклональных антител против белков пт 23-Н1 и с-егвВ-2 (“Бако”, Дания). Первичные антитела выявляли с помощью биотинилизированных вторичных антител и стрептавидина, меченного пероксидазой (Ь8АВ+КИ, “Бако”, Дания). Для визуализации продукта реакции применяли диаминобензидин в качестве красителя (“Бако”, Дания). Ядра клеток во всех случаях докрашивали гематоксилином.
Результаты реакций в клетках первичных опухолей, а также регионарных и отдаленных метастазов оценивали полуколичественным методом в зависимости от интенсивности окрашивания и процента антиген-позитивных клеток, которые в совокупности определяли уровень экспрессии (высокий, умеренный, низкий). Кроме того, исследовали тип реакции, зависящий от локализации маркера в клетке (ядерный, цитоплазматический, мембранный, смешанный). Статистическую обработку данных и определение достоверности проводили с использованием критерия Фишера (различия считались статистически значимыми при р<0,05).
Результаты и обсуждение
При иммуногистохимическом изучении первичных опухолей толстой кишки было показано, что накопление белка пт 23 наблюдали в 53 % (34/64) всех исследованных случаев. Экспрессия белка определялась в виде гомогенного окрашивания цитоплазмы опухолевых клеток. Интенсивность реакции и процент антиген-положительных клеток варьировали в различных опухолях и, иногда, в разных участках одной и той же опухоли. Высокий уровень экспрессии наблюдали в 54 % позитивных случаев.
В клетках метастазов рака в лимфатических узлах белок пт 23 был выявлен в 58 % исследованных случаев. При этом наблюдали совпадение (51 %), усиление (14 %) и уменьшение (14 %) уровня экспрессии маркера в клетках метастазов по сравнению с первичной опухолью. Кроме того, в 2 наблюдениях (21 %) отмечалась реакция умеренной интенсивности в клетках метастазов при отсутствии экспрессии в клетках первичной АТК.
При окраске метастазов АТК в печени белок пт 23 удалось выявить в 66 % (21/32) исследованных случаев, причем высокий уровень экспрессии с диффузным, равномерным окрашиванием цитоплазмы клеток наблюдали в 52 % позитивных случаев. Накопление небольшого количества белка пт 23 отмечалось также в цитоплазме гепатоцитов. Наблюдали совпадение (52 %), уменьшение (14 %) и увеличение (29 %) уровня экспрессии белка в клетках метастазов по сравнению с первичной опухолью, а также отсутствие реакции (5 %) в метастазах при выраженной экспрессии белка клетками первичной опухоли. В метастазах АТК в легких и надпочечнике наблюдали аналогичные особенности экспрессии белковых маркеров.
Накопление белка с-егЬВ-2 в клетках АТК отмечено в 45 % (29/64) всех изученных наблюдений. Тип реакции был преимущественно мембранным. Высокий уровень экспрессии был выявлен в 62 % позитивных случаев АТК. Накопление белка с-егЬВ-2 в клетках метастазов в лимфатических узлах наблюдали в 42 % случаев, при этом отмечалось совпадение степени выраженности экспрессии белка в клетках первичной опухоли и метастазов. Позитивная экспрессия белка с-егЬВ-2 в клетках метастазов АТК в печени выявлялась в 59 % (19/32) случаев. При этом только в 3 наблюдениях реакция была слабой, а в остальных случаях отмечена выраженная экспрессия маркера. Совпадение (74 %), уменьшение (11 %) и увеличение (16 %) уровня экспрессии белка в метастазах по сравнению с первичной опухолью было характерно и для
данного маркера. В клетках метастазов в легких и надпочечнике наблюдали накопление умеренного количества маркера.
Таким образом, оба белковых маркера определялись как в клетках первичной опухоли, так и метастазов АТК. При сравнении особенностей экспрессии белков пт 23 и с-егЬВ-2 в клетках первичной опухоли и метастазов наблюдали незначительные расхождения в частоте выявления маркеров, в то же время уровень их экспрессии в метастазах мог различаться как в сторону уменьшения, так и увеличения выраженности реакции. В повторно развившихся метастазах в печени не отмечено каких-либо особенностей экспрессии белков пт 23 и с-егЬВ-2. Типы реакций совпадали во всех изученных случаях. Клетки эпителия пограничной слизистой оболочки толстой кишки при окрашивании антителами против белков пт 23 и с-егЬВ-2 демонстрировали реакцию умеренной интенсивности.
Следует отметить, что частота выявления и выраженность экспрессии белковых маркеров в клетках первичной опухоли были различными в группе больных с развившимися метастазами в печени и в группе пациентов без клинически выявленных отдаленных метастазов (табл. 2).
Таблица 2 Сравнительная оценка экспрессии белковых маркеров в клетках первичных опухолей толстой кишки в зависимости от наличия или отсутствия метастазов в печени
Группа больных пт 23 | с-егЬВ-2
Количество больных
Абс. % Абс. %
Без
отдаленных 12/32 38 10/32 31
метастазов
С метастазами 20/32
в печени 63 21/32 59
р... 0,023 0,019
В группе больных без метастазов накопление белка пт 23 в цитоплазме раковых клеток первичной опухоли наблюдалось в 38 % случаев (12/32), а в группе больных с метастазами в печени - в 63 % случаев (20/ 32). Таким образом, частота выявления белка пт 23 в группе больных с метастазами в печени была достоверно выше (р=0,023). Выраженная интенсивность окрашивания цитоплазмы клеток первичной АТК в данной группе пациентов наблюдались также чаще (34 %), чем в группе без метастазов (22 %). Экспрессия с-егЬВ-2 в клетках первичной опухоли была обна-
ружена в 31 % случаев (10/32) у больных без признаков метастазирования. В группе больных с выявленными метастазами в печени позитивная реакция в клетках первичной АТК наблюдалась в 59 % случаев (21/32). В данной группе больных отмечалось не только увеличение частоты выявления белка, но и выраженности экспрессии (р=0,012).
Экспрессия белка пт 23 не зависела от присутствия или степени выраженности экспрессии белка с-егЬВ-2, однако наблюдалась тенденция к увеличению экспрессии обоих маркеров при появлении метастазов в печени. Экспрессия белков пт 23 и с-егЬВ-2 в клетках метастазов рака толстой кишки в печени зависела от прогноза заболевания после резекции печени по поводу метастазов. При благоприятном прогнозе (3- и 5-летняя выживаемость) в метастазах чаще отмечался высокий уровень экспрессии белков пт 23 и с-егЬВ-2 (10/12 и 11/12 случаев соответственно). В группе больных с неблагоприятным прогнозом преобладал низкий уровень или отсутствие экспрессии белков пт 23 и с-егЬВ-2 в клетках метастазов (12/20 и 15/20 случаев соответственно). Таким образом, несмотря на небольшое количество наблюдений, можно предположить, что высокий уровень экспрессии белковых маркеров в клетках метастазов является благоприятным прогностическим признаком.
При изучении взаимосвязи экспрессии белков пт 23 и с-егЬВ-2 с морфологическими особенностями метастатических опухолей статистически значимых различий обнаружено не было. Однако наиболее часто интенсивная позитивная реакция в клетках метастазов наблюдалась при наличии в опухоли лимфоидной инфильтрации, выраженной фиброзной капсулы и аппозиционного, или смешанного характера роста.
В настоящем исследовании была проведена оценка особенностей экспрессии двух белковых маркеров, играющих важную роль в развитии метастазов колоректального рака. Известно, что иммунофенотип метастазов может иметь отличия от иммунофенотипа первичной опухоли. Учитывая, что поражение таких органов, как печень и легкие, редко подлежит хирургическому лечению, изучение особенностей экспрессии маркеров в метастазах представляет большой интерес. В результате настоящего исследования показано, что происходит накопление белков пт 23 и с-егЬВ-2 в метастазах в лимфатических узлах, печени, легких и надпочечнике. При этом оба белка демонстрируют одинаковые закономерности экспрессии, которая может оставаться неизменной, увеличиваться, уменьшаться или отсутствовать при сравнении с первичной опухолью.
Роль белков пт 23 и с-егЬВ-2 при раке толстой кишки остается спорной [1, 7, 8]. В ряде исследований [6, 9, 10] показана обратная связь между экспрессией пт 23 и метастатической прогрессией. Отмечается, что выраженная экспрессия белка связана с менее агрессивным фенотипом первичной опухоли. Имеются также данные [5, 12], что белок пт23 нельзя считать прогностическим маркером. В ряде работ [4, 11] отмечено, что гиперэкспрессия белка в первичной опухоли, напротив, коррелирует с более высокой стадией заболевания и увеличением риска развития метастазов в печени. С.Я. Вегпеу е! а1. указывают [3], что пт 23 можно рассматривать как единственный, независимый маркер, на прогностическую значимость которого не влияет присутствие других позитивных маркеров, таких как р53, иРА и УБвК Результаты настоящего исследования согласуются с этими данными. Учитывая, что печень является наиболее частым местом метастазирования рака толстой кишки, подобная информация может помочь выделить группу больных с высоким риском возникновения метастазов в печени. Большое значение имеет также уточнение роли маркеров в определении прогноза заболевания после удаления метастазов в печени. Показано, что высокий уровень экспрессии белка является благоприятным прогностическим фактором. Однако исследование должно быть продолжено на большем количестве наблюдений. Значительное число пт 23 позитивных опухолей среди метастазов АТК не позволяет подтвердить гипотезу об ингибирующей роли белка в метастатическом процессе при данной форме злокачественных новообразований. Результаты исследования демонстрируют более высокий уровень экспрессии белка с-егЬВ-2 в клетках первичной АТК при прогрессировании заболевания и развитии метастазов, что согласуется с данными литературы [4, 11] и дает возможность подтвердить информацию о важной роли данного маркера в развитии метастазов колоректального рака.
Таким образом, экспрессия белков пт 23 и с-егЬВ-2 в клетках АТК достоверно выше в случаях с появившимися в разные сроки метастазами в печени. Отмечается тенденция к увеличению частоты выявления и уровня экспрессии обоих белковых маркеров как в клетках первичной опухоли при появлении метастазов, так и в клетках метастазов в печени. Исследование особенностей экспрессии белков пт 23 и с-егЬВ-2 в первичных опухолях и метастазах колоректального рака позволяет заключить, что эти два маркера играют важную роль при прогрессировании заболевания
и могут предсказывать биологическое поведение опухоли, однако их значение в развитии метастазов в печени требует дальнейшего изучения. Применение иммуногистохимических методов исследования экспрессии молекулярно-биологических маркеров при АТК позволяет надеяться на появление более точных критериев для оценки прогноза заболевания и риска развития метастазов в печени.
^HTEPATYPA
1. Bazan V, Migliavacca M., Zanna I. et al. DNA ploidy and S-phase fraction, but not p 53 or nm 23 expression, predict outcome in colorectal cancer patients // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2002. Vol. 128, № 12. P 650-658.
2. Bernes C.R., Fisher R.J., Yang J. et al. Protein markers in colorectal cancer: predictors of liver metastasis // Ann. Surg. 1999. Vol. 230, № 2. P 179-184.
3. Berney C.R., Yang J., Fisher R.J. et al. Correlates of urokinase-type plasminogen activator in colorectal cancer: relationship with nm 23 and c-erbB-2 protein expression // Oncol. Res. 1998. Vol. 10, № 1. P. 47-54.
4. Cheah P.Y., Cao X., Eu K.W. et al. NM 23-H1 immunostaining is inversely associated with tumour staging but
not overall survival or disease recurrence in colorectal carcinomas // Pr. J. Cancer. 1988. Vol. 77, № 7. P. 1164-1168.
5. Crowe P.J., Yang J.l., Berney C.R. Genetic markers of survival and liver recurrence after resection of liver metastases from colorectal cancer // Word J. Surg. 2001. Vol. 25, № 8. P. 996-1001.
6. Dursun A., Akyurek N., Gunel N., Yamac D. Prognostic implication of nm 23-H1 expression in colorectal carcinomas // Pathology. 2002. Vol. 34, № 5. P 427-432.
7. Forte A., D’Urso A., Gallinaro L.S. NM 23 expression as prognostic factor in colorectal cancer // J. Chir. 2002. Vol. 23, № 3. P. 61-63.
8. Hayer J., Engel M., Seifert M. et al. Overexpression of nm 23-H4 RNA in colorectal and renal tumors // Anticancer Res.
2001. Vol. 21, № 4A. P 2821-2825.
9. Indinnimeo M., Giarnieri E., Stazi A. et al. Early stage human colorectal cancer: prognostic value of nm 23-H1 protein overexpression // Cancer Lett. 1997. Vol. 1, № 1. P 1112-1115.
10.Lee J.C., Wang S.T., Chow N.H. et al. Investigation of the prognostic value of coexpressed erbB family // Eur. J. Cancer.
2002. Vol. 38, № 8. P 1065-1071.
11.Muller W., Schneiders A., Hommel G. et al. Expression of nm 23 in gastric carcinoma: association with tumor progression and poor prognosis // Cancer. 1998. Vol. 83, № 12. P. 24812487.
12.Sarris M., Lee C.S. NM 23 protein expression in colorectal carcinoma metastasis in regional lymph nodes and the liver // Eur. J. Surg. Oncol. 2001. Vol. 27, № 2. P. 170-174.
Поступила 31.01.04
