Прогностическая значимость содержания белка nm23 в опухолях больных колоректальным раком

Головков Д.А.; Мошуров И.П.; Делекторская В.В.; Суховерков Д.В.; Быковцев М.Б.; Мошуров Р.И.; Петров Л.О.

Ключевые слова:

белок nm23, метастазы, прогноз,

рак толстой кишки

Keywords:

protein nm23, metastasis, prognosis, colorectal cancer

DOI: 10.17709/2409-2231-2016-3-2-4

Для корреспонденции:

Головков Дмитрий Анатольевич -

д.м.н., заведующий колопроктологическим

отделением БУЗ ВО «Воронежский областной

клинический онкологический диспансер»

Адрес: 394036, Россия,

Воронеж, ул. Вайцеховского, 4

E-mail: dagolov@mail.ru

Статья поступила 28.01.2016,

принята к печати 20.06.2016

For correspondence:

Dmitriy A. Golovkov -

MD, head of coloproctological department

of BOH «Voronezh regional clinical

oncological dispensary»

Address: 4, ul. Vaitsekhovskogo,

Voronezh, 394036, Russia

E-mail: dagolov@mail.ru

The article was received 28.01.2016,

accepted for publication 20.06.2016

ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА nm23 В ОПУХОЛЯХ БОЛЬНЫХ КОЛОРЕКТАЛЬНЫМ РАКОМ

Головков Д.А.1, Мошуров И.ПЛ2, Делекторская В.В.3, Суховерков Д.В.1, Быковцев М.Б.1, Мошуров Р.И.1, Петров Л.О.4

1 БУЗ ВО «Воронежский областной клинический онкологический диспансер» (Воронеж, Россия) 394036, Россия, Воронеж, ул. Вайцеховского, 4

2 ИПДО «Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко» (Воронеж, Россия) 394036, Россия, Воронеж ул. Студенческая, 10

3 ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России (Москва, Россия) 115478, Россия, Москва, Каширское шоссе, 23

4 МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России (Москва, Россия) 125284, Россия, Москва, 2-й Боткинский проезд, 3

Резюме

Цель. Изучение экспрессии белка nm 23 в первичных и вторичных очагах РТК с учетом клинико-морфологических особенностей заболевания и возможности прогнозирования риска отдаленного метастазирования. Материал и методы. В исследование включен послеоперационный материал 264 больных РТК 1-^стадий опухолевого процесса. Иммуногистохимическое окрашивание выполнено биотин-стрептавидиновым иммунопероксидазным методом на парафиновых срезах ткани первичных опухолей толстой кишки и их метастазов в лимфатических узлах и печени с использованием антител к белку nm23 (H-1 и H-2) ("Dako", Дания). Результаты оценивались полуколичественным способом с учетом интенсивности окрашивания и количества антиген-позитивных клеток и локализации иммунореактивности в раковых клетках.

Результаты. При иммуногистохимическом исследовании первичных опухолей толстой кишки повышенное накопление белка nm23 наблюдалось в 53,4% (141/264) исследованных случаев. В метастазах РТК сохранялись основные закономерности экспрессии маркера, свойственные соответствующим первичным опухолям. Кривые выживаемости, вычисленные по методу Kaplan-Meyer, показывают, что пациенты с тг|23-позитивным окрашиванием опухолей демонстрируют более низкий показатель 5-летней общей выживаемости, чем больные с негативной иммунореактивностью в опухоли. Показатели БРВ у больных РТК также ухудшались при тг|23-негативном статусе опухолей по сравнению с тг|23-позитивным статусом.

Заключение. Гиперэкспрессия белка nm 23 часто выявлялась в первичных метастазирующих опухолях ТК и их метастазах в печени и была связана с высоким риском развития отдаленных метастазов, а также с неблагоприятным исходом заболевания и с ухудшением послеоперационной общей и безрецидивной выживаемости больных РТК. Высокий уровень экспрессии данного маркера являлся признаком неблагоприятного прогноза для больных РТК.

PROGNOSTIC SIGNIFICANCE OF nm23 PROTEIN IN THE TUMORS OF PATIENTS WITH COLORECTAL CANCER

Golovkov D.A.1, Moshurov I.P.1,2, Delektorskaya V.V.3, Sukhoverkov D.V.1, Bykovtsev M.B.i, Moshurov R.I.i, Petrov L.O.4

1 BOH «Voronezh regional clinical oncological dispensary» (Voronezh, Russia) 4, ul. Vaitsekhovskogo, Voronezh, 394036, Russia

2 Voronezh State Medical University named after N.N. Burdenko (Voronezh, Russia) 10, ul. Studencheskaya, Voronezh, 394036, Russia

3 FSBO "N.N. Blokhin ROSC" of Ministry of Health, Russian Federation (Moscow, Russia) 23, Kashirskoe shosse, Moscow, 115478, Russia

4 P. Hertsen MORI (Moscow, Russia)

3, 2nd Botkinskiy proezd, Moscow, 125284, Russia

Abstract

Purpose. Study of expression of protein nm 23 in primary and secondary foci of colorectal cancer (CRC) taking in consideration the clinical and morphological features of the disease and the possibility of predicting the risk of distant metastases.

Material and methods. The study included postoperative material of 264 CRC patients with I—IV stages of cancer. Immunohistochemical staining performed by biotin-strepta-vidin immunoperoxidase method on the paraffin tissue sections of primary colon tumors and their metastases in lymph nodes and liver using antibodies against nm23 protein (H-1 and H-2) ("Dako", Denmark). The results were evaluated by semiquantitative method based on the staining intensity and the number of antigen-positive cells and localization of immunoreactivity in cancer cells.

Results. During the immunohistochemical study of primary tumors of the colon the increase of the accumulation of nm23 protein was observed in 53.4% (141/264) studied

cases. In nmtastasis of CRC the main patterns of expression of a marker characteristic of the corresponding primary tumors was preserved. Survival curves, computed according to the method of Kaplan-Meyer showed that patients with nm23-positive staining of tumors show a lower 5-year overall survival than patients with negative immunoreactivity in the tumor. Indicators of disease-free survival in patients with CRC also deteriorated in nm23-negative status of tumors compared to nm23-positive status.

Conclusion. The overexpression of nm 23 protein were freqently detected in metastasizing primary tumors of colon and their liver metastases and was associated with a high risk of developing distant metastases, and poor outcome of the disease and the deterioration of the postoperative overall and disease-free survival of CRC patients. A high expression level of this marker is a sign of unfavorable prognosis for CRC patients.

Механизмы прогрессии злокачественных новообразованиях человека связаны с нарушениями молекуляр-но-биологических характеристик опухолевых клеток, в том числе с изменениями экспрессии белка nm 23, который является потенциально важным маркером ме-тастазирования и вовлечен также в процессы клеточной пролиферации и дифференцировки [1-5].

Белок nm23 (nonmetastatic cells protein) представлен двумя формами nm23 Н-1 и nm23 Н-2 (молекулярная масса 17,143 и 17,294 кДа, соответственно), которые идентичны субъединицам А и B нуклеозиддифосфатки-назы (NDPK) и имеют 88% гомологии в аминокислотной последовательности [6]. В опухолевых клетках белки локализованы в эндоплазматическом ретикулуме, иногда, в ядрах, и могут влиять на клеточный цикл, связываясь с нуклеиновыми кислотами и функционируя как транскрипционные факторы [6].

метастазы в лимфоузлах

метастазы в печени

местные рецидивы

иммунореактивность:

■ негативная

■ слабая

■ умеренная

■ сильная

Рисунок 1. Частота выявления экспрессии белка nm 23 в клетках первичных и вторичных очагов опухолевого поражения у больных РТК.

Figure 1. The incidence of nm 23 protein expression in the cells of the primary and secondary foci of neoplastic lesions in CRC patients.

Клинические исследования, посвященные изучению прогностической значимости белка пт23 в опухоли, в том числе его роли в инвазивном поведении клеток РТК, имеют крайне противоречивый характер [7-10].

Цель исследования - изучение экспрессии белка пт 23 в первичных и вторичных очагах РТК с учетом клини-ко-морфологических особенностей заболевания и возможности прогнозирования риска отдаленного метаста-зирования.

Материал и методы

В исследование включен послеоперационный материал 264 больных РТК I—IV стадий опухолевого процесса. В 135 случаях у пациентов развились отдаленные метастазы, включая синхронные или метахронные метастазы в печени, метастазы в легком, надпочечнике и яичнике. У 34 больных выявлены местные рецидивы. В 110 наблюдениях метастазы были удалены оперативно (метастатическая группа). В 129 случаях отдаленные метастазы и местные рецидивы в течение 3-летнего периода наблюдения выявлены не были (контрольная группа).

При гистологическом исследовании материала у всех больных были диагностированы аденокарциномы различной степени дифференцировки.

Иммуногистохимическое окрашивание выполнено биотин-стрептавидиновым иммунопероксидазным методом на парафиновых срезах ткани первичных опухолей толстой кишки и их метастазов в лимфатических узлах и печени с использованием антител к белку пт23 (Н-1 и Н-2) ('^ако", Дания). Результаты оценивались полуколичественным способом с учетом интенсивности окрашивания и количества антиген-позитивных клеток (специфическая реакция отсутствует/слабая —/+; умеренная/сильная ++/+++) и локализации иммунореактив-ности в раковых клетках (цитоплазматическая, ядерная).

Статистическую обработку данных и определение достоверности проводили с использованием критерия X2 (различия считались статистически значимыми при р

Таблица 1. Экспрессия белка nm 23 в первичных опухолях и метастазах РТК с учетом клинико-морфологических параметров заболевания

Table 1. The expression of nm 23 protein in primary tumors and metastases of CRC, taking into account clinical and morphological parameters of the disease

Признак nm23 в первичных опухолях, n = 264 nm23 в метастазах в печени, n = 110

Высокая n = 141 Низкая n = 123 р Высокая n = 73 Низкая n = 37 р

Возраст (лет) >60 88 81 0,651 38 19 0,895

<60 53 42 35 18

Пол м 68 59 0,935 39 25 0,224

ж 73 64 34 12

Стадия T1, T2 41 25 0,135 - -

T3, T4 100 98 73 37

Степень дифференцировки выс/ум 123 107 0,900 61 26 0,170

низкая 18 16 12 11

Метастазы в лимфоузлах (N) + 90 88 0,229 67 29 0,091

- 51 35 6 8

Метастазы в печени (M) + 89 46 0,000* 73

- 52 77 - -

Стадия по Dukes' A/B 35 42 0,127 - -

C/D 106 81 73 37

Лимфоидная инфильтрация + 37 41 0,261 32 16 0,885

- 104 82 41 21

Инвазия сосудов + 41 50 0,065 45 17 0,172

- 100 73 28 20

- 72 125 0,065 23

Примечание: Статистически значимые различия р < 0,05. Note: *Statistically significant differences p<0.05

Таблица 2. Выживаемость больных РТК с учетом содержания белка nm 23 в опухолевых клетках Table 2. The survival rate of CRC patients with regard to the content of nm 23 protein in tumor cells

Экспрессия nm 23 Позитивная Негативная

Общая выживаемость:

1-летняя 82,88± 3,32% 95,30 ± 2,05%%

3-летняя 48,43 ± 4,83%% 83,30 ± 4,55%%

5-летняя 30,64 ±5,37%% 63,50 ± 6,35%%

Безрецидивная выживаемость

1-летняя 85,21 ± 4,21%% 87,3 ± 5,53%%

3-летняя 24,73 ± 6,72%% 35,23 ± 5,31%%

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

5-летняя 25,07± 11,23%% 29,81 ± 10,41%%

< 0,05). Анализ прогностической значимости содержания маркера и построение кривых выживаемости проводили методом Kaplan-Meyer. Из 264 больных РТК, прослеженных после хирургического лечения, анализ общей выживаемости проводили у 244 пациентов, анализ безрецидивной выживаемости - у 105 больных. Продолжительность наблюдения за пациентами (от даты операции до даты последней явки или смерти) составила от 6 до 126 месяцев. Оценивали достоверность различий в выживаемости с помощью "log-rank" теста и относительный риск развития метастазов в печени (Hazard Rate).

Результаты исследования

При иммуногистохимическом исследовании первичных опухолей толстой кишки повышенное накопление (++/+++) белка nm23 наблюдалось в 53,4% (141/264) исследованных случаев. Из них сильная иммунореактив-ность (+++) отмечался в 42,6% (60/141) позитивных наблюдений и умеренная (++) - в 57.4% (81/141) случаев. Слабое специфическое окрашивание (+) и негативная экспрессия (-) маркера фиксировались в 46,6% (123/264) наблюдений. Экспрессия маркера в опухолях определялась в виде гомогенного окрашивания цитоплазмы, иногда более интенсивного в апикальной части клеток, формирующих железистые структуры. В части случаев (42/264; 15.9%) в опухолях больных РТК на фоне цито-плазматической реакции разной интенсивности наблюдалась окраска ядер раковых клеток.

В метастазах РТК сохранялись основные закономерности экспрессии маркера, свойственные соответствующим первичным опухолям.

В клетках метастазов РТК в лимфатических узлах белок nm 23 был выявлен в 57.5% (73/127) исследованных случаев. При окраске метастазов РТК в печени выявлялись как антиген-негативные, так и антиген-позитивные опухоли. В клетках метастазов реакция отсутствовала или была очень слабой в 33,6% (37/110) случаев, высокий уровень экспрессии белка nm23 удалось выявить в 66,4% (73/110) наблюдений, при этом интенсивность

окрашивания была умеренной в 47,9% (35/73) и сильной - в 52,1% (38/73) позитивных случаев. В клетках отдаленных метастазов наблюдалось диффузное, часто гетерогенное окрашивание цитоплазмы раковых клеток и ядерная экспрессия белка (21/110; 19.1%), которая фиксировалась несколько чаще, чем в исходных опухолях. В метастазах АТК в надпочечнике наблюдалась специфическая реакция умеренной интенсивности.

Метастазы АТК в легком были тг|23-негативны или демонстрировали низкий уровень экспрессии маркера. В метастазах в яичнике определялось интенсивное окрашивание большинства раковых клеток. Белок nm23 накапливался в клетках повторных метастазов в печени в 33.3% (4/12) случаев и в клетках местных рецидивов в 55.9% (19/34) наблюдений, при этом отмечался цито-плазматический характер экспрессии маркера.

Проведено сравнительное исследование особенностей накопления белка nm23 в клетках первичных и вторичных очагов опухолевого поражения (рис. 1). Наблюдалось совпадение (57/110; 51,8%), уменьшение (17/110; 15,4%) и увеличение (29/110; 26,4%) уровня экспрессии маркера в клетках метастазов в печени по сравнению с первичной опухолью, а также отсутствие реакции (7/110; 6,4%) в метастазах при выраженной экспрессии белка клетками исходной опухоли.

Не было выявлено статистически значимых различий между изменениями экспрессии белка nm 23 в клетках РТК и их метастазах и основными клинико-морфологи-ческими параметрами заболевания (табл. 1). Иммуно-реактивность в опухолевых клетках усиливалась при увеличении размера опухоли (показателя Т системы TNM; р = 0,135), глубины инвазии (стадия по Dukes'; р = 0,127), а также при наличии регионарных метастазов (показателя N системы TNM; р = 0,229), однако различия не достигали статистической значимости. Вместе с тем, наблюдалась связь повышенной экспрессии белка в первичных опухолях с развитием отдаленных метастазов РТК. Как видно из данных таблицы 1, в основной группе больных РТК с развившимися метастазами в печени частота вы-

Рисунок 2. Общая (а) и безрецидивная (б) выживаемость больных РТК в зависимости от содержания белка nm23 в опухолевых клетках: сравнение nm 23-позитивной и nm 23-негативной групп.

Figure 2. General (a) and relapse-free (b) survival of CRC patients depending on the protein nm23 in tumor cells: comparison of nm 23-positive and nm 23-negative groups

явления высокого уровня экспрессии белка nm 23 в цитоплазме раковых клеток первичной опухоли была достоверно выше, чем в контрольной группе пациентов без клинически выявленных отдаленных метастазов (89/135, 65,9% и 52/129, 40,3%, соответственно, р < 0,0001).

Nm23-иммунореактивность влияла не только на метастатический потенциал РТК, но и на клиническое течение заболевания. Неблагоприятный исход заболевания наблюдался у пациентов с антиген-позитивными опухолями чаще, чем у больных с антиген-негативными новообразованиями (71/89; 79,8% и 9/15; 60,0%, соответственно; р = 0,027).

Содержание белка nm 23 в клетках опухолей было связано с показателями выживаемости больных РТК (табл. 2).

Кривые выживаемости, вычисленные по методу Kaplan-Meyer, показывают, что пациенты с тг|23-пози-тивным окрашиванием опухолей демонстрируют более низкий показатель 5-летней общей выживаемости, чем больные с негативной иммунореактивностью в опухоли (30,64 ± 5,37% и 63,5 ± 6,35%; log-rank р = 0,00001) (рис. 2 а). Показатели БРВ у больных РТК также ухудшались при тг|23-негативном статусе опухолей по сравнению с тт|23-позитивным статусом (24,73 ± 6,72% и 35,23 ± 5,31%, log-rank р = 0,005) (рис. 2 б).

Относительный риск развития метастазов в печени (Hazard Rate) не позднее 3 лет после операции был в 3.3 раза выше при неблагоприятном высоком уровне экспрессии маркера в опухолях больных РТК по сравнению с пациентами с nm23-негативным статусом опухоли.

Заключение

Таким образом, гиперэкспрессия белка пт 23 часто выявлялась в первичных метастазирующих опухолях ТК и их метастазах в печени и была связана с высоким риском развития отдаленных метастазов, а также с неблагоприятным исходом заболевания и с ухудшением послеоперационной общей и безрецидивной выживаемости больных РТК. Высокий уровень экспрессии данного маркера являлся признаком неблагоприятного прогноза для больных РТК.

Изучение изменений экспрессии белка на поздних стадиях развития РТК свидетельствовалов пользу предположения, что белок по-разному функционирует на ранних этапах канцерогенеза и в период рецидивиро-вания и метастазирования опухоли.

Следует отметить, что экспрессия белка пт23 увеличивалась при развитии метастазов в печени вне зависимости от таких важных прогностических морфологических критериев как степень гистологической дифференцировки и размер опухоли, глубина инвазии опухоли в кишечную стенку и вовлечение регионарных лимфатических узлов.

Таким образом, в результате иммуногистохимиче-ского исследования в опухолях больных РТК выявлены изменения экспрессии белка пт 23, которые являются показателями возможного метастазирования и могут использоваться для индивидуального прогнозирования течения заболевания.

Список литературы

1. Пожарисский К. М., Леенман Е. Е. Прогностическое и предсказательное значение иммуногистохимических маркеров. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. Ред. Петров С. В. и Райхлин Н. Т. Казань, 2004.

2. Brenner A. S., Thebo J. S., Senagore A. J., Duepree H. J., Gram-lich T., Ormsby A., et al. Analysis of both NM23-H1 and NM23-H2 expression identifies "at-risk" patients with colorectal cancer. Am Surg. 2003; 69 (3): 203-208.

3. Gao Q. L., Ma D., Meng L., Wang S. X., Wang C. Y., Lu Y. P., et al. Association between Nm23-H1 gene expression and metastasis of ovarian carcinoma. Ai Zheng. 2004; 23 (6): 650-654.

4. Garinis G. A., Manolis E. N., Spanakis N. E. Patrinos G. P., Peros G., Menounos P. G. High frequency of concomitant nm23-H1 and E-cadherin transcriptional inactivation in primary non-inheriting colorectal carcinomas. J Mol Med. 2003; 81 (4): 256-263.

5. Nanashima A., Yamaguchi H., Sawai T., Yamaguchi E., Kidoga-wa H., Matsuo S., et al. Prognostic factors in hepatic metasta-

References

ses of colorectal carcinoma: immunohistochemical analysis of tumour biological factors. Dig Dis Sci. 2001; 46 (8): 1623-1628.

6. Bosnar M. H., De Gunzburg J., Bago R, Brecevic L., Weber I., Pavelic J. Subcellular localization of A and B Nm23/NDPK sub-units. Exp Cell Res. 2004; 298 (1): 275-284.

7. Dursun A., Akyurek N., Gunel N., Yamaç D. Prognostic implication of nm23H1 expression in colorectal carcinomas. Pathology. 2002; 34 (5): 427-432.

8. Forte A., D'Urso A., Gallinaro L. S. NM23 expression as prognostic factor in colorectal carcinoma. G Chir. 2002; 23 (3): 61-63.

9. Hayer J., Engel M., Seifert M., Seitz G, Welter C. Overexpression of nm23-H4 RNA in colorectal and renal tumours. Anticancer Res. 2001; 21 (4A): 2821-2825.

10. Terada R., Yasutake T., Nakamura S., Hisamatsu T., Sawai T., Yamaguchi H., et al. Clinical significance of nm 23 expression and chromosome 17 numerical aberrations in primary gastric cancer. Med Oncol. 2002; 19 (4): 239-248.

1. Pozharisskii K. M., Leenman E. E. Prognosticheskoe i predska-zatel'noe znachenie immunogistokhimicheskikh markerov. Ru-kovodstvo po immunogistokhimicheskoi diagnostike opukholei cheloveka. Ed by Petrov S. V. i Raikhlin N. T. Kazan', 2004. (Russian).