CC BY
305
клинические исследования
УДК: 616.33-006.6-091.8:57.088
экспрессия ^1^-2 (HER2/neu) при рАКЕ желуДКА: клинико-морфологические особенности
А.С. Эенюков1, т.ф. Боровская2, и.С. Стилиди1, м.п. никулин1, э.х. Курпас3, т.в. Эенюкова1, С.в. беков3, С.б. Сагайдак3
НИИ клинической онкологии Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН, г. Москва1 Хабаровский филиал Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН2 ГУЗ «Краевой клинический центр онкологии», г. Хабаровск3 115448, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, e-mail: misterzu@rambler.ru1
Проведен анализ экспрессии c-erbB-2 при раке желудка. Образцы опухолей желудка получены от 91 пациента, прооперированных по поводу рака. Экспрессию c-erbB-2 определяли иммуногистохимическим методом. Гиперэкспрессия c-erbB-2 была выявлена в 34,1 % случаев рака желудка. Экспрессия c-erbB-2 коррелировала со стадией (р<0,001), глубиной инвазии (р=0,009) и лимфогенными метастазами (р<0,001). Гиперэкспрессия c-erbB-2 ассоциировалась с уменьшением показателей безрецидивной и общей выживаемости при местнораспространенных формах РЖ (р=0,249, р=0,594).
Ключевые слова: рак желудка, экспрессия c-erbB-2.
EXPRESSION OF c-erbB-2 (HER2/neu): CLINICAL AND MORPHOLOGICAL FEATURES A.S. Zenyukov1, T.F. Borovskaya2, I.S. Stilidi1, M.P. Nikulin1, E.K. Kurpas3, T.V. Zenyukova1, S.V Bekov3, S.B. Sagaydak3 Clinical Oncology Research Institute, N.N.Blokhin RCRC RAMS, Moscow1 Khabarovsk branch of N.N.Blokhin RCRC RAMS, Khabarovsk2 Regional clinical oncology center, Khabarovsk3 24, Kashirskoe shosse, 115448-Moscow, e-mail: misterzu@rambler.ru1
We investigated expression of c-erbB-2 in gastric cancer. Gastric carcinoma tissues were obtained from 91 patients with gastric cancer who underwent curative resection. Expression of c-erbB-2 was assessed by immunohistochemical staining. Hyperexpression of c-erbB-2 was demonstrated in 34,1 % of cases with gastric carcinoma. C-erbB-2 expression correlated with advanced stage (р<0,001), depth of invasion (p=0,009) and lymph node metastasis (p<0,001). Hyperexpression of c-erbB-2 was associated with poor disease free and overall survivals from patients with advanced stages (р=0,249, р=0,594).
Key words: gastric cancer, expression of c-erbB-2.
Злокачественный фенотип опухоли определяется сочетанием множества молекулярных изменений, накопление которых в процессе опухолевой прогрессии обусловлено нарушением активности и функционирования целого ряда генов и продуктов их экспрессии. С-егЬВ-2 (НЕЯ2/ пей) - представитель семейства гомологичных трансмембранных рецепторов эпидермального фактора роста, обладающих тирозинкиназной активностью. Белок с-егЬВ-2, не имея собственного лиганда, взаимодействует с другими рецепторами и усиливает функционирование всей системы [3].
Накапливаются исследования, посвященные изучению взаимосвязи клинического течения рака желудка (РЖ) с избыточной экспрессией белка с-егЬВ-2 в первичной опухоли [1, 2, 4-9]. Единого мнения о прогностической ценности гиперэкспрессии белка с-егЬВ-2 при РЖ пока нет [1, 2, 4-6]. Большинство исследований указывает на то, что избыточная мембранная экспрессия с-егЬВ-2 ассоциирована с плохим прогнозом заболевания и может являться необходимым дополнительным показателем для выявления групп больных с более агрессивным течением заболевания.
Материал и методы
Нами проведено проспективное исследование у 91 больного РЖ после оперативного лечения в клинике ГУЗ «Краевой клинический центр онкологии» г. Хабаровска за период с 1 июля 2007 г. по 30 июня 2009 г. Прослеженность составила 85,7 % больных. У данной группы пациентов оценено влияние уровня экспрессии c-erbB-2 (HER2/neu) на выживаемость.
Распространенность опухоли оценивали согласно принятой 6-й редакции TNM-классификации (UICC, 2002). В исследование включено 3 пациента с 0 (Tis) стадией заболевания, с I - 17, со II - 19, с III - 25, с IV стадией -26 больных. Один пациент оперирован с рецидивной опухолью. Для оценки влияния уровня экспрессии c-erbB-2 мы объединили пациентов в группы с локализованными формами рака (0, I, II стадия заболевания) - 39 больных и с местнораспространенными и диссеминированными формами опухоли (III, IV стадии) - 51 пациент. Высокую степень гистологической дифферен-цировки опухоли выявили у 5 пациентов, умеренную - у 22, низкую - у 64.
Иммуногистохимическое исследование выполнено на серийных парафиновых срезах ткани первичной опухоли желудка с помощью биотин-стрептавидинового иммуноперок-сидазного метода с антителами к онкобелку c-erbB-2 (Rabbit, pAb фирма «Dako», Дания) в разведении 1:250. Срезы толщиной 3-5 мкм депарафинизировали и регидратировали по стандартной схеме. Для демаскировки антигенов проводили предварительную обработку парафиновых срезов в микроволновом режиме при мощности 650W 2 раза по 5 мин с использованием восстанавливающего раствора pH 6,0 (фирма «Dako», Дания) с перерывом 2 мин между процедурами для охлаждения. Срезы инкубировали с первичными антителами на протяжении 18 ч при +4°С.
В качестве вторичных антител и перокси-дазного комплекса использовали стандартный набор реагентов LSAB+ Kit или систему Ultra Vision One HRR Polymer (Rabbit, Mouse) (фирма «LabVision», США). Для визуализации реакции применяли раствор диаминобензидина DAB+ (фирма «Dako», Дания). Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера. Контрольный
срез оставляли без первой инкубации. Ставили негативный и позитивный контроль.
Оценку реакции в клетках первичных опухолей проводили полуколичественным методом с учетом интенсивности окрашивания и количества антиген-позитивных клеток, которые в совокупности определяли уровень экспрессии белковых маркеров (высокий или низкий). Иммуногисто-химическая реакция оценивалась как негативная («-» - нет реакции), слабопозитивная («+» - <10 % окрашенных клеток), умереннопозитивная («++» - >10 % клеток средней интенсивности окраски) и сильнопозитивная («+++» - >10 % клеток высокой интенсивности окраски).
Для дальнейшего сравнительного иммуно-гистохимического исследования выделяли два основных уровня иммунореактивности: низкий уровень, или редуцированная экспрессия белков (-/+) и высокий уровень, или гиперэкспрессия маркеров (++/+++). Экспрессию белка ^erbB-2 считали повышенной только при интенсивном окрашивании мембран раковых клеток (++/+++).
Статистические параметры рассчитывались в программе «Statistica 6 for Windows». Достоверность различий качественных показателей определялась по непараметрическому критерию X2 (хи-квадрат). Выживаемость рассчитывалась методом по Kaplan-Meier (1958). Достоверность различий выживаемости определялась по log-rank тесту.
Результаты и обсуждение
Гиперэкспрессия белка ^rbB-2 в клетках РЖ отмечалась в 31 (34,1 %) из 91 изученного наблюдения. Сильно выраженная иммунореактивность (+++) наблюдалась в 12 (13,2 %) и умеренно выраженная (++) - в 19 (20,9 %) случаях (рис. 1). Негативный ^erbB-2 статус опухолей больных РЖ определялся в 60 (65,9 %) случаях и выражался в полном отсутствии (-) (36 наблюдений) или слабой мембранной реакции (+) на поверхности опухолевых клеток (24 наблюдения), а также в различной по интенсивности цитоплазматической и мембранноцитоплазматической иммунореактивности. Интенсивное окрашивание цитоплазмы раковых клеток с выраженной мембранноцитоплазматической реакцией наблюдалось в
ЭКСПРЕССИЯ C-ERBB-2 (HER2/NEU) ПРИ РАКЕ ЖЕЛУдКА ...
---------------------------------------------------------------------------- 7
Таблица 1
Связь экспрессии с-егЬВ-2 при рж с клинико-морфологическими признаками
Признак Экспрессия c-erbB-2 (Her2/neu)
Высокая (n=31) Низкая (n=60) р*
Возраст (лет) >60 14 33 0,504
<60 17 27
Пол Муж 15 31 0,940
Жен 16 29
Глубина инвазии Тз.Т,, Т2 3 23 0,009
Т Т V 4 28 37
Н/треть 4 22
С/треть 18 23
Локализация опухоли В/треть 6 11 0,135
Тотально 3 3
Резец. желудок 0 1
Ранний рак 0 5
В1 1 7
Макроскопический тип В11 4 14 0,096
ВШ 19 23
В^ 7 11
Размеры опухоли <4см 7 33 0,008
>4 см 22 25
Степень дифференцировки Высокая 1 4
Умеренная 8 14 0,781
Низкая 22 42
Стадия 0/1/11 5 34 <0,001
Ш/ГУ 26 25
Метастазы в лимфоузлах рЫ+ 26 24 <0,001
рШ 5 36
Отдаленные метастазы Есть 4 2 0,194
Нет 27 58
Примечание: * - оценка р с помощью критерия %2
52 (57,1 %) опухолях желудка, однако, в соответствии с современными критериями, не учитывалось при оценке специфической реакции (гиперэкспрессии белка). Слабая мембранная, или негативная, экспрессия маркера в клетках опухолей желудка наблюдались в 39 (42,9 %) случаях. В большинстве наблюдений отмечалась невысокая интенсивность окрашивания эпителия пограничных с опухолью участков слизистой оболочки желудка.
Экспрессия онкобелка в первичных опухолях желудка зависела от ряда клиникоморфологических характеристик заболевания (табл. 1). Увеличение глубины инвазии и стадии заболевания сочеталось с повышенной мембранной экспрессией с-егЬВ-2 при РЖ (р=0,009,
Рис. 1. Гиперэкспрессия онкобелка c-erbB-2 в клетках первичной опухоли желудка. Иммуногистохимическая реакция с антителами c-erbB-2, Rabbit pAb. х250
p<0,001 соответственно). Размеры опухоли более 4 см статистически чаще встречались при гиперэкспрессии c-erbB-2 (p=0,008). В группе больных с гиперэкспрессией c-erbB-2 в клетках РЖ лимфогенные метастазы обнаружены у 83,9 % (26 из 31) больных, а у пациентов с низкими показателями экспрессии белка в опухоли - в 40 % (24 из 60) случаев (р<0,001). Определялась тенденция к увеличению частоты гиперэкспрессии c-erbB-2 до 45,2 % (19 из 42 больных) при BIII (язвенно-инфильтративном) макроскопическом типе опухоли по R. Borrmann (1926). Различия стремятся к своей статистической значимости (р=0,096). Гиперэкспрессия белка c-erbB-2 в опухолях больных РЖ не была статистически связана с полом (р=0,504) и возрастом (р=0,940) больных, локализацией опухоли (р=0,135) и наличием отдаленных метастазов (р=0,194).
В группе больных, у которых выявлена гиперэкспрессия онкобелка в мембранах опухолевых клеток, наблюдалось сокращение сроков без-рецидивной выживаемости (БРВ) через 14 мес после операции: одногодичная БРВ - 71,0 ± 10,3 %, 2-летняя - 56,8 ± 15,1 %, 3-летняя БРВ не достигнута. Однако различия в показателях БРВ были статистически незначимы (%2=0,154; df=1; р=0,796; log-rank test) (рис. 2). Частота прогрессирования опухолевого заболевания не зависела от уровня экспрессии c-erbB-2 и составляла при гиперэкспрессии 29,2 % (7 из 24), а при редуцированной экспрессии c-erbB-2 - 30,9 % (17 из 55) (р=1,0; критерий х2).
Повышенное содержание c-erbB-2 в клетках первичной опухоли было связано с сокращением общей выживаемости (ОВ) (рис. 3). При высоких значениях данного маркера в опухолях 2-летняя ОВ составила 47,9 ± 17,4 %, летальный исход заболевания наблюдался в 29,2 % (7 из 27) прослеженных случаев, медиана - 16 мес. При низком уровне экспрессии c-erbB-2 2- и 3-летняя ОВ составила 61,1 ± 9,1 %, умерло 27,3 % (15 из 55) прослеженных больных, медиана ОВ не достигнута (%2=0; df=1; р=0,999; log-rank test).
Учитывая малое количество пациентов в выборке по стадиям, мы сравнили влияние уровня экспрессии c-erbB-2 на выживаемость в подгруппах пациентов с локализованным (0-II стадии) (n=39) и с местнораспространенными и диссеминированными формами РЖ (III-IV стадии) (n=51). Нами установлена ассоциация между гиперэкспрессией c-erbB-2 и сокращением ОВ и БРВ у больных с местнораспространенными или диссеминированными формами РЖ (р=0,594, р=0,249) (табл. 2). Из-за малой выборки больных с локализованными формами РЖ в сочетании с гиперэкспрессией c-erbB-2 (n=5) мы посчитали, что проводить анализ и делать выводы по выживаемости в данной группе больных преждевременно.
С внедрением иммуногистохимического метода диагностики в повседневную практику клиницисты получили потенциальную возможность оценить индивидуальный прогноз для больного, опираясь на уровень экспрессии
о Завершенные Цензурированные
"’•V, р=0,999
8 ””,С|
h
++/+++
----{■ | |
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
30 36
Срок жизни в месяцах
Рис. 2. Безрецидивная выживаемость больных РЖ в зависимо- Рис. 3. Общая выживаемость больных РЖ в зависимости от
сти от уровня экспрессии с-егЬВ-2 уровня экспрессии с-егЬВ-2
Таблица 2
Показатели 2-летней выживаемости пациентов рж в зависимости от уровня экспрессии с-егЬВ-2 и стадии заболевания
Стадия Экспрессия c-erbB-2
Высокая (n=31) Низкая (n=61) р*
Общая выживаемость
0/I/II 100 % 71,6 ± 13,7 % 0,324
III/IV 25,6 ± 20,3 % 48,5 ± 12,3 % 0,594
Безрецидивная выживаемость
0/I/II 100 % 75,6 ± 11,6 % 0,317
III/IV 40,4 ± 18,8 % 45,5 ± 10,2 % 0,249
Примечание: * - оценка р с помощью log-rank test.
с-егЬВ-2. В нашем исследовании в 34,1 % случаев первичных опухолей желудка выявлена гиперэкспрессия с-егЬВ-2. Полученные результаты соответствуют данным литературы, по которым начиная с 1990 г. высокий уровень экспрессии при РЖ выявлялся в 9-35 % случаев [4, 8].
Мы продемонстрировали достоверную взаимосвязь между экспрессией с-егЬВ-2 и местным распространением опухоли, ее размерами. Опухоли с гиперэкспрессией с-егЬВ-2 имели более высокую частоту поражения регионарных лимфатических узлов (р<0,001). В нашем исследовании мы выявили ассоциацию между гиперэкспрессией онкобелка с-егЬВ-2 и сокращением ОВ и БРВ.
Осознание механизмов опухолевой инвазии и метастазирования и возможность определения патологического уровня белков дают возможность для применения таргетных препаратов. Уже длительное время используется Трастузу-маб (Герцептин®) при гиперэкспрессии с-егЬВ-2 у пациентов при раке молочной железы. Добавление к стандартной химиотерапии Трасту-зумаба (Герцептина®) позволяет значительно продлить жизнь больным РЖ с гиперэкспрессией НЕЯ2. Данные международного исследования III фазы ToGA показали, что у пациентов при НЕК2-положительном распространенном или неоперабельном РЖ, получавших Герцептин, риск смерти снижается на 26 % по сравнению с больными, не получавшими данный препарат. Еще большие преимущества от добавления Гер-цептина в схему лечения получают пациенты с высоким уровнем экспрессии НЕЯ2, у таких больных продолжительность жизни увеличивается в среднем до 16 месяцев [7]. Кроме того.
имеются сообщения об успешном применении Герцептина в неоадъювантном режиме [9]. Применение Герцептина в качестве монотерапии или в комбинации с другими противоопухолевыми препаратами, а также режимы введения находятся в стадии исследования [2, 5].
Заключение
В 34,1 % случаев выявляется гиперэкспрессия онкобелка c-erbB-2 мембранного типа при РЖ. Полученные результаты позволяют предполагать, что изменения экспрессии белка c-erbB-2, которые наблюдаются в клетках первичных опухолей желудка, связаны с распространенностью и инвазивно-метастатическим потенциалом опухолевого процесса. Высокий уровень экспрессии белка c-erbB-2 ассоциировался с ухудшением ОВ и БРВ. Прогностическое значение гиперэкспрессии онкобелка c-erbB-2 в опухолях желудка было ограничено, скорее всего, из-за небольшого числа антиген-позитивных наблюдений. Выявление гиперэкспрессии в первичной опухоли c-erbB-2, с учетом зарубежных данных об эффективности Герцептина при метастатическом c-erbB-2 положительном РЖ, требует рассмотрения вопроса об адъювантной терапии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Gamboa-DominguezA., Dominguez-Fonseca C., Quintanilla-Martinez L. et al. Epidermal growth factor receptor expression correlates with poor survival in gastric adenocarcinoma from Mexican patients: a multivariate analysis using a standardized immunohis-tochemical detection system // Modern pathology. 2004. Vol. 17. P. 579-587.
2. Gravalos C., Jimeno A. HER2 in gastric cancer: a new prognostic factor and a novel therapeutic target // Ann. Oncol. 2008. Vol. 19 (9). P. 1523-1529.
3. Harari D., Yarden Y. Molecular mechanisms underlying ErbB2/HER2 action in breast cancer // Oncogene. 2000. Vol. 19. P 6102-6114.
4. Hilton D.A., WestK.P. C-erbB-2 oncogene product expression and prognosis in gastric carcinoma // J. Clin. Pathol. 1992. Vol. 45. P. 456-458.
5. Jorgensen J.T. Targeted HER2 treatment in advanced gastric cancer // Oncology. 2010. Vol. 78 (1). P. 26-33.
6. OugolkovA., YamashitaK., Bilim V et al. Abnormal expression of E-cadherin, beta-catenin, and c-erbB-2 in advanced gastric cancer: its association with liver metastasis // Int. J. Colorectal Dis. 2003. Vol. 18 (2). P 160-167.
7. Satoh T., Leon J., Lopez R.I. et al. Quality of life results from a phase III trial of trastuzumab plus chemotherapy in first-line HER2-
positive advanced gastric and GE junction cancer // 2010 Gastrointestinal Cancers Symposium Proceedings. P. 59 (abstr. 7).
8. Song Y, Huang J., Wang J.-W. Correlation of HER-2/neu gene amplification and protein expression with the prognosis of advanced gastric patients // Chin. J. Cancer. 2010. Vol. 29. P. 71-75.
9. Wang J., Saukel G.W., Garberoglio C.A. et al. Pathological complete response after neoadjuvant chemotherapy with trastuzumab-containing regimen in gastric cancer: a case report // J. Hematol. Oncol. 2010. Vol. 3. P. 31-35.
nocrynHna 12.11.10
