CC BY
27
ISSN 0321-3005 IZVESTIYA VUZOV. SEVERO-KAVKAZSKII REGION.
NATURAL SCIENCE. 2017. No. 4-2
УДК 577.21:616.34-006.6 DOI 10.23683/0321-3005-2017-4-2-84-95
ОСОБЕННОСТИ ПРОТЕОМНОГО ПРОФИЛЯ В ТКАНЯХ БОЛЬНЫХ КОЛОРЕКТАЛЬНЫМ РАКОМ С МЕТАСТАЗАМИ И БЕЗ МЕТАСТАЗОВ
© 2017г. Д.С. Кутилин1, О.И. Кит1, Д.И. Водолажский1, А.В. Шапошников1, Н.В. Николаева1, Д.В. Бурцев2, Е.А. Дженкова1, А.А. Маслов1, М.Н. Дурицкий1, Ю.А. Фоменко1
1Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, Ростов-на-Дону, Россия, 2Областной консультативно-диагностический центр, Ростов-на-Дону, Россия
PECULIARITIES OF PROTEOM PROFILE IN TISSUES OF PATIENTS WITH METASTATIC AND NON-METASTATIC COLORECTAL CANCER
D.S. Kutilin1, O.I. Kit1, D.I. Vodolazhsky1, A.V. Shaposhnikov1, N.V. Nikolaeva1, D.V. Burtsev2, E.A. Dzhenkova1, A.A. Maslov1, M.N. Duritskiy1, Yu.A. Fomenko1
1Rostov Research Institute of Oncology, Rostov-on-Don, Russia, 2Regional Consultative and Diagnostic Center, Rostov-on-Don, Russia
Кутилин Денис Сергеевич - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, лаборатория молекулярной онкологии, Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, ул. 14-я линия, 63, г. Ростов-на-Дону, 344037, Россия, e-mail: k.denees@yandex.ru
Кит Олег Иванович - доктор медицинских наук, профессор, генеральный директор, Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, ул. 14-я линия, 63, г. Ростов-на-Дону, 344037, Россия, e-mail: rnioi@list.ru
Водолажский Дмитрий Игоревич - кандидат биологических наук, руководитель лаборатории молекулярной онкологии, Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, ул. 14-я линия, 63, г. Ростов-на-Дону, 344037, Россия, e-mail: dvodolazhsky@gmail.com
Шапошников Александр Васильевич - доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник, отделение общей онкологии, Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, ул. 14-я линия, 63, г. Ростов-на-Дону, 344037, Россия, e-mail: rnioi@list.ru
Николаева Надежда Владимировна - доктор медицинских наук, врач-гематолог, Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, ул. 14-я линия, 63, г. Ростов-на-Дону, 344037, Россия
Бурцев Дмитрий Владимирович - доктор медицинских наук, главный врач, Областной консультативно-диагностический центр, ул. Пушкинская, 127, г. Ростов-на-Дону, 344000, Россия, e-mail: dr-burtsev@mail.ru
Дженкова Елена Алексеевна - доктор биологических наук, доцент, ученый секретарь, Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, ул. 14-я линия, 63, г. Ростов-на-Дону, 344037, Россия, e-mail: enikipelova@mail.ru
Denis S. Kutilin - Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher, Laboratory of Molecular Oncology, Rostov Research Institute of Oncology, 14-ya Liniya St., 63, Rostov-on-Don, 344037, Russia, e-mail: k.denees@yandex.ru
Oleg I. Kit - Doctor of Medicine, Professor, General Director, Rostov Research Institute of Oncology, 14-ya Liniya St., 63, Rostov-on-Don, 344037, Russia, e-mail: rnioi@list.ru
Dmitry I. Vodolazhsky - Candidate of Biological Sciences, Head of the Laboratory of Molecular Oncology, Rostov Research Institute of Oncology, 14-ya Liniya St., 63, Rostov-on-Don, 344037, Russia, e-mail: dvodolazhsky@gmail.com
Alexander V. Shaposhnikov - Doctor of Medicine, Professor, Main Researcher, General Oncology Department, Rostov Research Institute of Oncology, 14-ya Liniya St., 63, Rostov-on-Don, 344037, Russia, e-mail: rnioi@list.ru
Nadezhda V. Nikolaeva - Doctor of Medicine, Hematologist, Rostov Research Institute of Oncology, 14-ya Liniya St., 63, Rostov-on-Don, 344037, Russia
Dmitry V. Burtsev - Doctor of Medicine, Chief Physicion, Regional Consultative and Diagnostic Center, Pushkinskaya St., 127, Rostov-on-Don, 344000, Russia, e-mail: dr-burtsev@mail. ru
Elena A. Dzhenkova - Doctor of Biological Sciences, Associate Professor, Scientific Secretary, Rostov Research Institute of Oncology, 14-ya Liniya St., 63, Rostov-on-Don, 344037, Russia, e-mail: enikipelova@mail.ru
ISSN 0321-3005 IZVESTIYA VUZOV. SEVERO-KAVKAZSKII REGION. NATURAL SCIENCE. 2017. No. 4-2
Маслов Андрей Александрович - доктор медицинских наук, профессор, главный врач, руководитель отделения абдоминальной онкологии № 3, Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, ул. 14-я линия, 63, г. Ростов-на-Дону, 344037, Россия, e-mail: maslov.36@mail.ru
Дурицкий Максим Николаевич - заведующий консультативно-диагностическим отделением, Ростовский научно-ис-сле—дова—тельский онкологический институт, ул. 14-я линия, 63, г. Ростов-на-Дону, 344037, Россия, e-mail: Duritskimaxim75@mail. ru
Фоменко Юрий Александрович - кандидат медицинских наук, заместитель главного врача по клинико-экспертной работе, Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, ул. 14-я линия, 63, г. Ростов-на-Дону, 344037, Россия
Andrey A. Maslov - Doctor of Medicine, Professor, Chief Physicion, Head of Department of Abdominal Oncology No. 3, Rostov Research Institute of Oncology, 14-ya Liniya St., 63, Rostov-on-Don, 344037, Russia, e-mail: maslov.36@mail.ru
Maksim N. Duritskiy - Head of Consultative and Diagnostic Department, Rostov Research Institute of Oncology, 14-ya Liniya St., 63, Rostov-on-Don, 344037, Russia, e-mail: Durits-kimaxim75@mail. ru
Yuriy A. Fomenko - Candidate of Medicine, Deputy Chief Physicion for Clinical Expertise, Rostov Research Institute of Oncology, 14-ya Liniya St., 63, Rostov-on-Don, 344037, Russia
Цель - поиск протеомных информативных биомаркеров колоректального рака у пациентов с метастазами и без, которые затем могут применяться в рутинных гистохимических исследованиях.
Методы. Для исследования использовали ткани (опухолевые и условно здоровые) 20 пациентов с гистологически подтвержденным диагнозом «аденокарцинома толстой кишки»: 10 пациентов с метастазами и 10 - без. Экстракцию белков из свежезамороженных тканей проводили с применением набора Panorama Antibody Microarray - Cell Signaling Kit (Sigma, США). Для маркировки белков использовали красители Су3 и Су5; маркированную белковую пробу наносили на микрочип (слайд с моноклональными антителами), содержащий 224 антитела, нанесенные на нитроцеллюлозное покрытие в двух повторностях, плюс положительный контроль (Cy3- и Су5-конъюгированные с БСА) и немеченый БСА-отрицательный контроль (512 точек (спотов) на слайд). Далее слайды сканировали на сканере для микрочипов GenePix 4100A (Molecular Devices, США) и обрабатывали с использованием программного обеспечения для анализа изображений GenePixTM Pro 6.0. Применяли два метода нормализации: смена красителя и по референсным белкам (актин). Рассчитывались частоты встречаемости у пациентов с повышенной или пониженной экспрессией белка; проводился статистический анализ с использованием критерия x2 и Манна - Уитни для порогового уровня статистической значимости р<0,05.
Результаты. В опухолевой ткани больных колоректальным раком с метастазами обнаружено достоверное (p<0,05) увеличение экспрессии белков с-myc, SMAD4, PCAF, Adaptin b1+b2, FAKPhospho (pY577), PKC g, Phospho-Pyk2 (pY579/580) по сравнению с условно нормальной тканью кишки. В опухолевой ткани у 50 % пациентов с метастазами обнаружено увеличение экспрессии белка c-myc, PKC g, Phospho-Pyk2 (pY579/580) относительно нормальной ткани, у 40 - повышение экспрессии белка FAK Phospho (pY577); у 33 - повышение экспрессии белков Phospho-DAPK (pS308), Cdk6, Cyclin D3, SMAD4, HAT1 (Histone acetyltransferase), PCAF, Adaptin b1+b2, Cytokeratin pep, Ezrin в 2,5 раза, NAK, PKC b в опухолевой ткани относительно нормальной.
В опухолевой ткани пациентов без метастазов обнаружено достоверное (p<0,05) увеличение экспрессии NGFR p75 и Phospho-Ta (pS199/202, у 50 % пациентов без метастазов - увеличение экспрессии NGFR p75 и Phospho-Pyk2; у 43 - увеличение экспрессии белков p14 arf и Cytokeratin pep 7 относительно нормальной ткани, у 50 - снижение экспрессии белков b-Synuclein (PNP-14), FAK Phospho (pY577), PKC b и Phospholipase C g1 относительно нормальной ткани.
Выводы.
1. Протеомный профиль значительно отличается в опухолевых тканях больных с метастазами и без: обнаружено изменение экспрессии 30 белков, дифференциальное в каждой группе пациентов.
2. Выявлены кластеры протеомных маркеров, обладающих высоким потенциалом для прогнозирования течения заболевания (с метастазами или без): PKC g и b, c-myc, FAK, NGFR p75, b-Synuclein, Phospholipase C, SMAD4, Cdk6, Cyclin D3 и DAPK.
Ключевые слова: протеомный профиль, аденокарцинома толстой кишки, метастазы, онкомаркеры.
Aim - search for proteomic informative biomarkers of colorectal cancer in patients with and without metastases, which can then be used in routine histochemical studies.
Methods. Tissues (tumor and non-tumor) of 20 patients with histologically confirmed diagnosis of colon adenocarcinoma (10 patients with metastases and 10 patients without) were used for the study. Extraction ofproteins from fresh-frozen tissues was carried out using the Panorama Antibody Microarray-Cell Signaling Kit (Sigma, USA). For marking of proteins were used dyes Cy3 and Cy5. The marked protein sample was applied to a microchip (slide with monoclonal antibodies) containing 224 antibodies applied to a nitrocellulose coating in duplicate plus positive control (Cy3 and Cy5 conjugated to BSA) and unlabeled BSA negative control (512 points (spots) per slide). Next, the slides were scanned on a GenePix 4100A microarray scanner (Molecular Devices, USA) and processed using the GenePixTM Pro 6.0 image analysis software. Two methods of normalization were used: the change of the dye and the reference proteins (actin). The frequencies of occurrence in patients with increased or decreased expression of the protein were calculated and statistical analysis was performed using the X and Mann-Whitney test for a threshold level of statistical significance p<0.05.
Results. In tumor tissue of patients with colorectal cancer with metastases, a significant (p<0.05) increase in the expression of c-myc, SMAD4, PCAF, Adaptin b1 + b2, FAKPhospho (pY577), PKCg, Phospho-Pyk2 (pY579 / 580) with conventionally normal tissue was found. In tumor tissue, an increase in the expression of the protein c-myc, PKCg, Phospho-Pyk2 (pY579 / 580) with respect to normal tissue was found in 50 % ofpatients with metastases. An increase in the expression of FAK Phospho protein (pY577) was found in 40 % of patients. In 33 % of patients, the expression of Phospho-DAPK (pS308), Cdk6, Cyclin D3, SMAD4, HAT1 (Histone acetyltransferase), PCAF, Adaptin b1 + b2, Cytokeratin pep, Ezrin 2.5 times, NAK, PKC b in tumor tissue relatively normal.
In the tumor tissue of patients without metastases, a significant (p<0.05) increase in the expression of NGFR p75 and Phospho-Ta (pS199 / 202) was detected. In tumor tissue, an increase in NGFR expression of p75 andPhospho-Pyk2 was detected in 50 % of patients without metastases, 43% of patients showed an increase in expression of p14 arf and Cytokeratin pep 7proteins relative to normal tissue, 50 % of patients showed a decrease in the expression of b-Synuclein proteins (PNP -14), FAK Phospho (pY577), PKC b and Phospholipase C g1 relative to normal tissue.
Conclusions
1. The proteome profile differs significantly in tumor tissues of patients with and without metastases: a change in the expression of 30 proteins, a differential in each group ofpatients, is found.
2. Clusters ofproteomic markers with high potential for predicting the course of the disease (with or without metastases) have been identified: PKC g and b, c-myc, FAK, NGFRp75, b-Synuclein, Phospholipase C, SMAD4, Cdk6, Cyclin D3 and DAPK.
Keywords: proteomic profile, colon adenocarcinoma, metastasis, tumor markers.
Введение
Колоректальный рак (КРР) - наиболее распространенный тип неоплазии в развитых странах и второй - по причине смерти среди раковых заболеваний. За последние 20 лет в мире число смертей от данной патологии увеличилось с 490 000 до 715 000 в год, при этом ежегодно во всем мире более чем у 1 млн человек диагностируется КРР [1, 2].
Летальность от этого заболевания довольно высока по причине поздней диагностики. Она достигает 40 % в течение года с момента выявления болезни. Наиболее частым органом, в который мета-стазирует КРР, является печень, что обусловлено особенностями венозного оттока от кишечника, который осуществляется через систему воротной вены печени. Метастазы в печени при КРР обнаруживаются у 50 % пациентов [3, 4].
КРР хорошо охарактеризован с генетической точки зрения [1, 5, 6]: это относительно медленный процесс, который требует нескольких последовательных мутаций в опухолевых клетках и занимает десятилетия, чтобы развиться полностью. Но, несмотря на знание о генетических событиях, которые необходимы для развития КРР, данные о белковых биомаркерах весьма скудны. Системы диагностики КРР в настоящее время основаны на результатах гистологических исследований, поэтому большинство опухолей обнаруживается уже на поздних стадиях, что приводит к снижению выживаемости. Генетические исследования КРР на основе анализа ДНК микрочипов не дали новых инструментов для его классификации или усовершенствованного прогнозирования [7].
Многочисленные изменения генов и белков связаны с каждым типом рака. Эти изменения могут рассматриваться в качестве биомаркеров и быть полезны в диагностике, определении прогноза и
мониторинга развития заболевания (лимфогенного и отдаленного метастазирования). К сожалению, поиск новых опухолевых маркеров - непростая задача. Описаны только 10 белков, которые эффективно используют в качестве маркеров (например, prostate-специфический антиген, карциноэмбрио-нальный антиген и СА125) [8]. Но и они показывают отсутствие высокой чувствительности или обладают высокими показателями ложных срабатываний.
Таким образом, новые инструменты и стратегии необходимы для улучшения этой ситуации. Про-теомные исследования в целом и использование белковых микрочипов в частности являются очень привлекательной стратегией для скрининга новых высокоспецифичных биомаркеров, позволяющих улучшить прогнозирование течения заболевания.
Цель исследования - поиск протеомных информативных биомаркеров КРР у пациентов с метастазами и без, которые затем могут быть использованы в рутинных гистохимических исследованиях.
Материалы и методы
Клиническим материалом для исследования послужили ткани (опухолевые и условно здоровые) 20 пациентов Юга России с гистологически подтвержденным диагнозом «аденокарцинома толстой кишки» (стадия дифференцировки G2): 10 пациентов с метастазами и 10 пациентов - без. Образцы тканей получены в процессе хирургического вмешательства в Ростовском научно-исследовательском онкологическом институте (РНИОИ) в 2014 г. Для верификации образцов тканей проводилось стандартное патолого-морфологическое исследование с окрашиванием фиксированных срезов гематоксилин-эозином. Биоптаты тканей после проведения патолого-морфологического исследования раздели-
ISSN 0321-3005 IZVESTIYA VUZOV. SEVERO-KAVKAZSKII REGION.
NATURAL SCIENCE.
2017. No. 4-2
ли на две группы: опухолевые (малигнизированные) и контрольные (немалигнизированные) образцы.
Экстракцию белков из свежезамороженных тканей проводили с использованием набора Panorama Antibody Microarray - Cell Signaling Kit (Sigma, США) по инструкции производителя. Ткань в камере криостата при температуре -20 °C нарезали слайсами 10 мкм толщиной по 15-20. Гомогенизацию проводили в Magna Lyser при 5000 оборотах за 30 с в буфере, содержащем ингибиторы протеаз и фосфатаз, а также бензоназу. В экстрактах определяли концентрацию белка по Мэрион Брэдфорд и нормализовали её буфером до 1 мг/мл.
Для маркировки белков использовали красители Су3 и Су5, растворенные в карбонатно-бикарбо-натном буфере pH 9,5. Протеомный экстракт инкубировали при комнатной температуре 30 мин, после чего удаляли не связавшиеся с белками свободные красители Су3/Су5 из промаркированной пробы с использованием колонок SigmaSpin.
После этого снова определялась концентрация белка и вычислялось молярное соотношение краски с белком (D/P). Если D/P>2 маркированную белковую пробу инкубировали с микрочипом (слайдом с моноклональными антителами).
Каждый слайд (микрочип) содержит 224 антитела, нанесенные на нитроцеллюлозное покрытие в двух экземплярах на 32-сеточный микрочип, каждая сетка - дубликаты 7 антител плюс положительный контроль (Cy3- и Су5 -конъюгированные с бычьим сывороточным альбумином (БСА)) и немеченый БСА-отрицательный контроль, в результате чего получается 512 точек (спотов) на слайд. Кроме того, антитела к актину, миозину и тубулину включены в микрочип для целей нормализации, так как экспрессия этих белков не должна меняться при различных обработках образца и контроля.
Условно нормальные и опухолевые образцы, помеченные различными красителями, смешивали перед нанесением на слайд в инкубационном буфере до одинаковой конечной концентрации 8 мг/мл. Чтобы верифицировать результаты, проводили замену красителей (normalization by dye swapping): каждый нормальный образец, меченный Су3, смешивали с опухолевым, меченным Су5, а нормальный образец, меченный Су5, смешивали с опухолевым, меченным Су3. Смешанные с буфером образцы помещали в инкубационную емкость и инкубировали при комнатной температуре 30 мин, на качающемся шейкере при умеренной частоте встряхивания. Далее слайды сканировали на сканере для микрочипов GenePix 4100A (Molecular Devices, США).
Изображения микрочипов были обработаны с использованием программного обеспечения для анализа изображений GenePixTM Pro 6.0. Измеренную интен-
сивность флуоресценции от каждого элемента микрочипа сравнивали с локальным фоном и вычитали из нее значение фона. Перед нормализацией значения флуоресценции по каналам Су3 и Су5, равные или меньшие суммы среднего значения, и 2 негативных контроля отбрасывались. Для спотов микрочипа, находящихся в нескольких повторностях, рассчитывали среднее арифметическое для обоих каналов (рис. 1, 2).
Поскольку нормализация по референсным белкам является частным случаем нормализации по суммарной интенсивности флюоресценции, а dye swapping может быть использован в обоих вариантах нормализации, мы использовали два метода: нормализацию сменой красителя и по референсным белкам.
Нормализованную интенсивность для каждого элемента микрочипа (антитела) рассчитывали как среднее геометрическое интенсивностей Cy3 и Cy5 двух разных слайдов, т.е. среднее геометрическое между интенсивностью флуоресценции образца нормальной ткани, окрашенного Cy3, с одного слайда и интенсивностью флуоресценции образца нормальной ткани, окрашенного Cy5, со второго слайда.
Далее рассчитывали нормализующий коэффициент по референсному белку.
Narray
2 Ri
N = i=1 (1)
Ntotal Narray ' (V
i=1
Формулу (1), согласно данным J. Quackenbush [9], можно преобразовать в следующую:
Nref =
_ Z Г=1 Rref (i) 21-iGref (i)
(2)
где Кге^(■) - среднее геометрическое интенсивности
флуоресценции Су3- и Су5-референтных белков образца опухолевой ткани; Оге^(■) - среднее геометрическое интенсивности флуоресценции Су3- и Cy5-референтных белков образца нормальной ткани.
Окончательный результат получали по формуле (3), следующей из формулы (4),
_ Я(сапсег ) ^погта1( )^ге/
1 Я
(3)
T = 4 = .
G Ntotal Gi
(4)
где Т - отношение среднего геометрического интенсивности флуоресценции /-го спота по каналам Су3 и Су5 для опухолевой ткани к среднему геометрическому интенсивности флуоресценции /-го спота по каналам Су3 и Су5 для нормальной ткани с учетом коэффициента нормализации по рефе-ренсному белку.
ISSN 0321-3005 IZVESTIYA VUZOV. SEVERO-KAVKAZSKII REGION.
NATURAL SCIENCE.
2017. No. 4-2
FE35 Mean- B635
• • • • • t • 35000
♦ ' • •
• • • * 30000
• * * * * * г г.
• • * »a * i 25000
• • * •
О О О 20000
• * о * о о
• 9 » •• • • • * 15000
* * DO**
* « > t 10000
« • • •
рЦМЦцДИНЬрЯд'
■f Су3 среднее
I Су5 среднее
Рис. 1. Изображение, полученное после сканирования слайда (слева) и изменения распределения интенсивностей флуоресценции до (сверху) и после преднормализации (снизу) по негативным контролям / Fig. 1. Image obtained after scanning the slide (left) and changing the distribution of fluorescence intensities to (above) and after pre-normalization (from below) through negative controls
Рис. 2. Алгоритм преднормализации - объединение дубликатов (слева) и изменение разброса данных до и после нормализации (справа) / Fig. 2. Algorithm before normalization - combining duplicates (left) and changing the spread
of data before and after normalization (right)
ISSN0321-3005 IZVESTIYA VUZOV. SEVERO-KAVKAZSKII REGION.
NATURAL SCIENCE.
2017. No. 4-2
На рис. 3 представлены графики разброса данных при нормализации по суммарной интенсивности, актину и тубулину. При нормализации по ре-ференсным белкам в отличие от нормализации по суммарной интенсивности отклонение от среднего значительно меньше, а при нормализации по актину несколько меньше, чем по тубулину. Исходя из
этих данных, нормализацию проводили по рефе-ренсному белку актину.
Уровень экспрессии белка признавался достоверно повышенным, если абсолютное значение коэффициента было >1,49, или достоверно пониженным, если абсолютное значение коэффициента <0,7.
Рис. 3. Графическое представление результатов нормализации / Fig. 3. Graphical representation of the results of normalization
Рассчитывались частоты встречаемости у пациентов с повышенной или пониженной экспрессией белка. Проводился статистический анализ с использованием критерия х2 для порогового уровня p<0,05, а также давалась оценка достоверности различий по критерию Манна - Уитни для порогового уровня статистической значимости р<0,05 между нормальной и опухолевой тканью для двух выборок (с метастазами и без).
Результаты и обсуждение
В опухолевой ткани больных КРР с метастазами обнаружено достоверное ф<0,05) увеличение экспрессии белков с^у^ SMAD4, PCAF, Adaptin Ь1+Ь2, FAK Phospho ^577), PKC g, Phospho-PУk2 ^579/580) в 2,1; 1,5; 1,5; 1,5; 2,7 и 1,6 раза соот-
ветственно по сравнению с условно нормальной тканью кишки.
В опухолевой ткани у 50 % пациентов с метастазами обнаружено увеличение экспрессии белка c-myc в среднем в 3,2 раза, PKC g - в 4,3, Phospho-Pyk2 (pY579/580) - в 2,3 раза относительно нормальной ткани. У 40 % пациентов обнаружено повышение экспрессии белка FAK Phospho (pY577) в 2,1 раза; у 33 % пациентов повышена экспрессия белков Phospho-DAPK (pS308) в 2,2, Cdk6 - 2,5, Cyclin D3 - 2,3, SMAD4 - 2,7, HAT1 (Histone acetyltransferase) - 2,3, PCAF - 2,6, Adaptin b1+b2 -2,6, Cytokeratin pep 7 - 2,1, Ezrin - 2,5, NAK - 2,5, PKC b - 2,5 раза в опухолевой ткани относительно нормальной (рис. 4). Полный список белков, изменивших свою экспрессию у пациентов этой группы, представлен в таблице.
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10%
50 50 33 1/ 50 60 67 67 33 50 50 67 33 67 67 33 67 67 33
67 67 33
50 50 17 33 17 33
40
33 33 33 33
/
К"4
^ ^ сЗ" & ^ Ф Ф' „ч" О
У у У
А
^ г4
^ с-
* S /
xí sT
г У
не изменилась ■ понижена повышена
Рис. 4. Процент пациентов (группа с метастазами) с измененной и неизмененной экспрессией белков в опухолевой ткани относительно нормальной / Fig. 4. Percentage of patients (metastatic group) with altered and unchanged expression of proteins in
tumor tissue relatively normal
В опухолевой ткани пациентов без метастазов обнаружено достоверное (p<0,05) увеличение экспрессии белков Nerve Growth Factor Receptor (NGFR p75) в 3,8 раза и Phospho-Ta (pS199/202) - в 1,9.
В опухолевой ткани у 50 % пациентов без метастазов обнаружено увеличение экспрессии белка Nerve Growth Factor Receptor (NGFR p75) в среднем в 6,7 раза, Phospho-Pyk2 (pY579/580) - 2; у 43 - p14
arf и Cytokeratin pep 7 - в 1,6 раза относительно нормальной ткани, у 50 - снижение экспрессии белка b-Synuclein (PNP-14) в 2,3 раза, FAK Phospho (pY577) - в 2,5, PKC b - в 3 и Phospholipase C g1 - в 2,8 раза относительно нормальной ткани. Данные об изменении экспрессии других исследованных белков (с частотой менее 40 %) в опухолевой ткани относительно нормальной ткани у пациентов без метастазов представлены на рис. 5 и в таблице.
Рис. 5. Процент пациентов (группа без метастазов) с измененной и неизмененной экспрессией белков в опухолевой ткани относительно нормальной / Fig. 5. Percentage of patients (group without metastases) with altered and unchanged expression
of proteins in tumor tissue relatively normal
ISSN 0321-3005 IZVESTIYA VUZOV. SEVERO-KAVKAZSKII REGION. NATURAL SCIENCE. 2017. No. 4-2
Частота встречаемости измененной и неизмененной экспрессии белков среди обследованной выборки пациентов / The frequency of occurrence of proteins altered and unchanged expression among the patients sample
Белок Частота, %
Пациенты без метастазов Пациенты с метастазами
Повышена Понижена Не изменилась Повышена Понижена Не изменилась
PKC g* 29 0 71 50 0 50
PKC b* 25 50 25 33 0 67
PKC a* 29 14 57 17 0 83
c-myc* 14 0 86 50 0 50
Cytokeratin pep 7 43 0 57 33 0 67
Cytokeratin pep 4* 29 0 71 17 0 83
HAT1 (Histone acetyltransferase) 29 14 57 33 0 67
PCAF 29 14 57 33 0 67
Cathepsin D* 29 14 57 17 0 83
Cystatin A 14 29 57 17 17 66
p14 arf 43 0 57 33 0 67
FAK Phospho (pY577)* 25 50 25 40 0 60
Myosin IIA* 29 0 71 17 0 83
Myosin Va (LE-16)* 29 0 71 17 0 83
Vinculin* 29 14 57 17 0 83
Nerve Growth Factor Receptor (NGFR p75)* 50 17 33 17 0 83
b-Synuclein (PNP-14)* 17 50 33 17 17 66
Phospho-Ta (pS199/202)* 33 17 50 17 17 66
Tryptophane Hydroxylase* 33 14 53 17 0 83
Cdc7 Kinase 14 29 57 17 17 66
Phospholipase C gl* 0 40 60 17 0 83
Phospho-Pyk2 (pY579/580) 50 25 25 50 17 33
AP2 gamma* 29 0 71 17 0 83
SMAD4* 0 14 86 33 0 67
Adaptin b1+b2* 14 14 72 33 17 50
Ezrin* 14 0 86 33 17 50
NAK* 14 0 86 33 0 67
Cdk6 0 14 86 33 0 67
Cyclin D3 0 0 100 33 0 67
Phospho-DAPK (pS308) 0 0 100 33 0 67
* - выявлена на основании критерия х2 ассоциация изменения экспрессии белка с формированием или отсутствием метастазов (х2>6, р<0,05).
Из представленных данных видно, что протеом-ный профиль опухолевых тканей пациентов с метастазами и без значительно отличается. Первое значительное отличие касается повышенной экспрессии у 50 % больных с метастазами протоонкоген-ного белка с-тус, представляющего собой фактор
транскрипции, который у человека регулирует экспрессию до 15 % всех генов [10], связываясь с эн-хансерными последовательностями в ДНК (E-boxes) и усиливая активность ацетилтрансфераз гистонов (HAT). Это и наблюдается у 33 % пациентов с метастазами, в опухолевой ткани которых в
ISSN 0321-3005 IZVESTIYA VUZOV. SEVERO-KAVKAZSKII REGION.
2,3 раза повышена экспрессия HAT1 (Histone acetyltransferase). У пациентов без метастазов изменения экспрессии белка c-myc не наблюдаются, однако экспрессия HAT1 повышена у 29 % больных и снижена у 14.
Второе отличие касается дифференциальной экспрессии изоформ белка протеинкиназы С у больных с метастазами и без.
Протеинкиназы С (PKC) представляют собой семейство серин- и треонинспецифических проте-инкиназ, которые могут быть активированы кальцием и вторичным мессенджером диацилглицери-ном. Члены семейства PKC фосфорилируют разнообразные белковые мишени и участвуют в разнообразных путях передачи клеточных сигналов, а также служат в качестве основных рецепторов для форболовых сложных эфиров (класс опухолевых промоутеров). Каждый член семейства PKC имеет определенный профиль экспрессии и играет различные роли в клетках. Семейство PKC состоит из 15 изоферментов (в организме человека) [11]. Они разделены на 3 подсемейства на основании активирующих их вторичных мессенджеров: обычные (или классические), новые и атипичные. Обычные PKC содержат изоформы альфа (a), бета (b) и гамма (g). Они требуют Ca2+, ДАГ и фосфатидилсерина для активации.
Протеинкиназа гамма (PKC g), по данным литературы, экспрессируется только в головном и спинном мозге, и её локализация ограничивается нейронами [12]. Протеинкиназа бета (PKC b) участвует в активации В-клеток, индукции апопто-за, пролиферации эндотелиальных клеток и всасывании сахара в кишечнике. Протеинкиназа альфа (PKC a) участвует в различных клеточных процессах, таких как клеточная адгезия и трансформация клеток. Повышенная активация PKC а связана с ростом и инвазией раковых образований [13].
Экспрессия PKC g и PKC b повышена у 50 и 33 % исследованных больных КРР с метастазами, а у больных без метастазов повышение экспрессии PKC а, PKC b и PKC g наблюдается не более чем в 30 % случаев. При этом у 50 % больных без метастазов наблюдается снижение экспрессии белка PKC b.
Экспрессия FAK Phospho (pY577) в опухолевой ткани 40 % больных КРР с метастазами увеличена в среднем в 2,1 раза. Focal Adhesion Kinase (FAK), ассоциированная с фокальной адгезией протеинки-наза, участвует в клеточной адгезии (контактах клеток друг с другом и их окружением) и в распространении процессов (передвижении клеток) [14]. FAK фосфорилируется в ответ на взаимодействия с интегринами, фактором стимуляции роста и действием митогенных нейропептидов, он может иг-
NATURAL SCIENCE. 2017. No. 4-2
рать другие роли в клетке, в том числе регуляции опухолевого супрессора р53. Избыточная экспрессия FAK приводит к ингибированию апоптоза и увеличению распространенности метастатических опухолей [15]. В [16] было показано, что блокировка FAK приводит к уменьшению подвижности раковых клеток, делая их менее метастатическими. В нашем исследовании у больных КРР без метастазов экспрессия FAK Phospho (pY577) в опухолевой ткани повышена только в 25 % случаев, а в 50 она снижена в 2,5 раза.
У больных КРР с метастазами и без метастазов в 50 % случаев повышена экспрессия белка Phospho-Pyk2 (pY579/580). Pyk2 (Protein tyrosine kinase 2 beta) - нерецепторная цитоплазматическая тиро-зинкиназа, в норме преимущественно экспресси-рующаяся в клетках гемопоэтических линий и центральной нервной системы, участвующая в каль-цийиндуцированной регуляции ионных каналов и активации сигнального пути МАР-киназы. Она является членом подсемейства FAK протеинтирозин-киназ [17]. У 17 и 25 % больных с метастазами и без наблюдается снижение экспрессии этого белка в 1,5 и 2 раза соответственно. То есть изменения в экспрессии Phospho-Pyk2 (pY579/580) сходны у больных КРР с метастазами и без в опухолевой ткани по сравнению с нормальной.
У пациентов обеих групп наблюдается увеличение экспрессии Cytokeratin pep 7: у 33 % пациентов с метастазами и у 43 - без. Цитокератин-7 является представителем низкомолекулярных цитокерати-нов. Цитокератины - кератинсодержащие белки промежуточных филаментов цитоскелета, находящиеся в цитоплазме эпителиальной ткани. Этот тип цитокератина специфически экспрессируется в эпителии, выстилающем полости внутренних органов, а также желез и кровеносных сосудов. Эпителиальные клетки легких и молочной железы содержат цитокератин-7, а железистый эпителий толстой кишки и простаты - нет. Поэтому антитела к цитокератину-7 могут быть использованы в имму-ногистохимии для детекции карцином толстой кишки и предстательной железы [18]. Увеличение экспрессии Cytokeratin pep 4 также наблюдается у пациентов обеих групп, но у пациентов с метастазами реже (у 17 %), чем у пациентов без метастазов (у 29 %). Кератин-4 представляет собой II тип ци-токератинов, он обнаружен в клетках слизистых оболочек и эпителия пищевода [19].
Интересные результаты получены касательно экспрессии белка Phospho-DAPK (pS308) (DAPK1, Death-associated protein kinase). DAPK1 участвует в различных клеточных процессах, таких как апоптоз, аутофагия и воспаление, является положительным медиатором гамма-интерферона, индуци-
рующим запрограммированную гибель клеток, является кандидатом в супрессоры опухолей [20]. При многих видах рака наблюдается снижение экспрессии гена DAPK [21]. В нашем исследовании экспрессия белка DAPK не изменяется в опухолевой ткани в сравнении с нормальной тканью толстой кишки у пациентов без метастазов и увеличивается у 33 % пациентов с метастазами в 2,2 раза. Показана связь белков DAPK1, SMAD4, p14 arf, Phospho-Ta и Myosin IIA в клеточных сигнальных путях [22].
Экспрессия белка SMAD4 повышена у 33 % пациентов с метастазами в 2,7 раза и снижена у 14 без метастазов в 1,5 раза. SMAD4 взаимодействует с другими членами семейства SMAD, такими как SMAD2 или SMAD3, формируя с ними комплекс, может связываться с ДНК и изменять экспрессию нескольких генов, ответственных за пролиферацию или дифференцировку [23]. Белок SMAD4 экспрес-сируется в коже, поджелудочной железе, толстой кишке и матке. Для многих видов рака характерны мутации в гене SMAD4 (наследственные или приобретенные в течение жизни человека). Функционально SMAD4 участвует в регуляции TGF-ß пути передачи сигнала, который негативно регулирует рост эпителиальных клеток и внеклеточного мат-рикса. Изменение структуры SMAD4 нарушает регуляцию экспрессии генов, участвующих в росте клеток, и пролиферации клеток могут продолжаться без какого-либо торможения, что приводит к формированию опухолей, в частности к КРР [24]. Наблюдаемая повышенная экспрессия белка у пациентов с метастазами может отражать и увеличение аберрантного белка с утраченной функциональностью.
Изменения в экспрессии белков адаптинов (1 и 2 ß) наблюдаются у больных КРР с метастазами и без метастазов в опухолевой ткани относительно нормальной, однако эти изменения более выражены у пациентов с метастазами. Из этой группы пациентов экспрессия адаптинов изменяется у 50 % (у 33 увеличивается, у 17 уменьшается), в группе без метастазов только у 28 % пациентов (у 14 увеличивается, у 14 уменьшается), при этом у 72 % пациентов не отличается от экспрессии в нормальной ткани. Адаптины представляют собой белки, которые участвуют в образовании везикул на покрытых клатрином углублениях путем взаимодействия с мембранно-связанными рецепторами. Кластеры адаптинов формируют комплекс AP2.
Изменение экспрессии белка ß-синуклеина (phosphoneuroprotein 14) затрагивает 67 и 34 % выборки пациентов без метастазов и с метастазами соответственно, причем для пациентов без метастазов характерно снижение экспрессии белка у 50 % выборки. Синуклеины (а, ß и у) являются неболь-
шими, растворимыми, высококонсервативными нейрональными белками, которые привлекли значительное внимание в связи с их участием в нейро-дегенеративных заболеваниях и раке. Содержится Р-синуклеин в норме в ЦНС (равномерно распределён в терминалях аксонов нейронов всей ЦНС), астроцитах, клетках Сертоли (яички), сетчатке и оптическом нерве, в слизистой обонятельной системе. На основе полуколичественной РТ-ПЦР была обнаружена экспрессия мРНК синуклеинов в восьми клеточных линиях КРР. Результаты ве-стерн-блоттинга показали, что уровни экспрессии этих белков в клетках опухоли толстой кишки приблизительно соответствуют уровням экспрессии мРНК синуклеина. Также было показано, что экспрессия белков синуклеинов достоверно коррелирует с клинической стадией и вовлечением лимфоузлов в развитие КРР. При распространении опухолевого процесса на лимфатические узлы (метастазы) обнаружено повышение экспрессии синуклеи-нов (р и у) [25].
У пациентов и с метастазами, и без обнаружено увеличение экспрессии белка p14ARF. Этот белок индуцируется в ответ на повышение митогенной стимуляции, такой как аберрантный сигнал роста, от белков MYC и Ras [26]. Накапливается p14ARF в основном в ядрышке, где он образует устойчивые комплексы с NPM или Mdm2, что позволяет ему действовать как супрессор опухоли путем ингиби-рования биогенеза рибосом или инициирования p53-зависимой остановки клеточного цикла и апоптоза [27].
Отличия в протеомном профиле двух групп пациентов затрагивают и ещё один белок - фосфоли-пазу С, которая является ключевым ферментом метаболизма фосфатидилинозитола и липидных сигнальных путей. У больных КРР без метастазов у 40 % выборки наблюдается снижение экспрессии данного белка, с метастазами - только увеличение экспрессии фосфолипазы С и только у 17 % выборки.
Выводы
1. В ходе проведенного исследования обнаружено изменение протеомного профиля в малигни-зированной ткани толстой кишки, причем про-теомный профиль значительно отличается в опухолевых тканях больных с метастазами и без. Всего обнаружено изменение экспрессии 30 белков, дифференцированное в каждой группе пациентов.
2. Из этих белков 63 % в пределах каждой группы пациентов изменяют свою экспрессию разнонаправленно (снижают или увеличивают), что, вероятно, может быть обусловлено гендерным и возрастным разнообразием выборки. Тем не менее про-
веденное исследование позволило выявить кластеры протеомных маркеров, обладающих высоким потенциалом для прогнозирования течения заболевания (с метастазами или без): PKC g и b, c-myc, FAK, NGFR p75, b-Synuclein, Phospholipase C, SMAD4, Cdk6, Cyclin D3 и DAPK.
Литература
1. Madoz-Gurpide J., Canamero M., Sanchez L. [et al.]. Proteomics Analysis of Cell Signaling Alterations in Colorectal Cancer // Molecular & Cellular Proteomics. 2007. Vol. 6. Р. 2150-2164.
2. Global, regional, and national life expectancy, all-cause mortality, and cause-specific mortality for 249 causes of death, 1980-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015 // Lancet. 2016. Vol. 388 (10053). P. 14591544. DOI 10.1016/S0140-6736(16)31012-1.
3. Патютко Ю.И., Пылёв А.Л. Диагностика и лечение метастазов колоректального рака в печени // РМЖ. 2009. № 22. С. 1505.
4. Vladimirova L.Y., Kit O.I., Nikipelova E.A. Resilts of monoclonal antibodies against EGFR-receptors application in patients with metastatic colorectal cancer // Clinical Oncology. 2013. Vol. 31, № 15S. P. 19047.
5. Кит О.И., Водолажский Д.И., Двадненко К.В., Гуду-ева Е.Н., Кутилин Д.С., Геворкян Ю.А., Владимирова Л.Ю. Частота мутаций в гене KRAS в различных клинических группах пациентов Юга России c колоректальным раком // Мед. генетика. 2014. Т. 13, № 12 (150). С. 35-41.
6. Кит О.И., Водолажский Д.И., Кутилин Д.С., Двадненко К.В., Тимошкина Н.Н., Енин Я.С., Максимов А.Ю., Геворкян Ю.А., Кожушко М.А., Петров Д.С. Комплексный анализ потенциальных биомаркеров у больных колорек-тальным раком // Злокачественные опухоли. 2015. № 4-2 (16). С. 318-319.
7. Madoz-Gurpide J., Lopez-Serra P., Martinez-Torrecuadrada J. [et al.]. Proteomics-based validation of ge-nomic data: applications in colorectal cancer diagnosis // Molecular & Cellular Proteomics. 2006. Vol. 5. P. 1471-1483.
8. Sidransky D. Emerging molecular markers of cancer // Nat. Rev. Cancer. 2002. Vol. 2 (3). P. 210-219.
9. Quackenbush J. Microarray data normalization and transformation nature // Genetics supplement. 2002. Vol. 32. P. 496-501. DOI 10.1038/ng1032.
10. Gearhart J., Pashos E.E., Prasad M.K. Pluripotency redux-advances in stem-cell research // The New England J. of Medicine. 2007. Vol. 357, № 15. P. 1469-1472.
11. RingvoldH.C., KhalilR.A. Protein Kinase C as Regulator of Vascular Smooth Muscle Function and Potential Target in Vascular Disorders // Adv. Pharmacol. 2017. Vol. 78. P. 203-301.
12. Saito N., Shirai Y. Protein kinase C gamma (PKC gamma): function of neuron specific isotype // J. Biochem. 2003. Vol. 132 (5). P. 683-687.
13. Koivunen J., Aaltonen V., Peltonen J. Protein kinase C (PKC) family in cancer progression // Cancer Letters. 2006. Vol. 235 (1). P. 1-10.
14. Blackshaw S.E., Dow J. K., Lackie J. M. The dictionary of cell and molecular biology (3rd ed.). San Diego: Academic Press, 1999. 502 p.
15. Mehlen P., Puisieux A. Metastasis: a question of life or death // Nat. Rev. Cancer. 2006. Vol. 6 (6). P. 449-58. DOI 10.1038/nrc1886. PMID 16723991.
16. Chan K.T., Cortesio Ch.L., Hutenlocher A. FAK alters invadopodia and focal adhesion composition and dynamics to regulate breast cancer invasion // J. Cell. Biol. 2009. DOI 10.1083/jcb.200809110.
17. Eleniste P.P., Patel V., Posritong S. [et al.]. Pyk2 and Megakaryocytes Regulate Osteoblast Differentiation and Migration Via Distinct and Overlapping Mechanisms // Cell. Biochem. 2016. Vol. 117 (6). P. 1396-1406. DOI 10.1002/jcb.25430. PMID 26552846.
18. Leong A. S-Y., Cooper K., Leong F. Manual of Diagnostic Cytology (2 ed.). Greenwich Medical Media, Ltd, 2003. P. 173.
19. Chao S.C., Tsai Y.M., YangM.H., Lee J.Y. A novel mutation in the keratin 4 gene causing white sponge naevus // Br. J. Dermatol. 2003. Vol. 148 (6). P. 1125-1128.
20. Steinmann S., Scheibe K., Erlenbach-Wuensch K. [et al.]. Death-associated protein kinase: A molecule with functional antagonistic duality and a potential role in inflammatory bowel disease (Review) // Int. J. Oncol. 2015. Vol. 47. P. 5-15. PMID 25963636.
21. Huang Y., Chen L., Guo L., Hupp T.R., Lin Y. Evaluating DAPK as a therapeutic target // Apoptosis. 2014. Vol. 19 (2). P. 371-386.
22. Bialik S., Kimchi A. The DAP-Kinase Interactome // Apoptosis. 2014. Vol. 19. P. 316-328.
23. LinX., LiangM., Liang Y.Y. [et al.]. Activation of transforming growth factor-beta signaling by SUMO-1 modification of tumor suppressor Smad4/DPC4 // The J. of Biological Chemistry. 2003. Vol. 278 (21). P. 18714-18719.
24. Kumar V., Abbas A.K., Fausto N., Robbins S.L., Cotran R.S. Robbins and Cotran pathologic basis of disease (7th ed.). St. Louis, Mo: Elsevier Saunders, 2005. 1525 p.
25. Ye Q., Wang T.F., Peng Y.F. [et al.]. Expression of alpha-, beta- and gamma-synuclein in colorectal cancer, and potential clinical significance in progression of the disease // Oncol. Rep. 2010. Vol. 23 (2). P. 429-436.
26. Abida W.M., Gu W. p53-Dependent and p53-independent activation of autophagy by ARF // Cancer Res.
2008. Vol. 68 (2). P. 352-357.
27. Sherr C.J. Autophagy by ARF: a short story // Mol. Cell. 2006. Vol. 22 (4). P. 436-437.
References
1. Madoz-Gurpide J., Canamero M., Sanchez L. [et al.]. A Pro-teomics Analysis of Cell Signaling Alterations in Colorectal Cancer. Molecular & Cellular Proteomics. 2007, vol. 6, pp. 2150-2164.
2. Global, regional, and national life expectancy, all-cause mortality, and cause-specific mortality for 249 causes of death, 1980-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet. 2016, vol. 388 (10053), pp. 14591544. DOI 10.1016/S0140-6736(16)31012-1.
3. Patyutko Yu.I., Pylev A.L. Diagnostika i lechenie metastazov kolorektal'nogo raka v pecheni [Diagnosis and treatment of metastases of colorectal cancer in the liver]. RMZh.
2009, No. 22, p. 1505.
4. Vladimirova L.Y., Kit O.I., Nikipelova E.A. Resilts of monoclonal antibodies against EGFR-receptors application in patients with metastatic colorectal cancer. Clinical Oncology. 2013, vol. 31, No. 15S, p. 19047.
ISSN 0321-3005 IZVESTIYA VUZOV. SEVERO-KAVKAZSKII REGION.
5. Kit O.I., Vodolazhskii D.I., Dvadnenko K.V., Gudueva E.N., Kutilin D.S., Gevorkyan Yu.A., Vladimirova L.Yu. Chastota mutatsii v gene KRAS v razlichnykh klinicheskikh gruppakh patsientov Yuga Rossii c kolorektal'nym rakom [The frequency of mutations in the KRAS gene in different clinical groups of patients in Southern Russia with colorectal cancer]. Med. genetika. 2014, vol. 13, No. 12 (150), pp. 35-41.
6. Kit O.I., Vodolazhskii D.I., Kutilin D.S., Dvadnenko K.V., Timoshkina N.N., Enin Ya.S., Maksimov A.Yu., Gevorkyan Yu.A., Kozhushko M.A., Petrov D.S. Kompleksnyi analiz potentsial'nykh biomarkerov u bol'nykh kolorektal'nym rakom [The frequency of mutations in the KRAS gene in different clinical groups of patients in Southern Russia with colorectal cancer]. Zlokachestvennye opukholi. 2015, No. 4-2 (16), pp. 318-319.
7. Madoz-Gurpide J., Lopez-Serra P., Martinez-Torrecuadrada J. [et al.]. Proteomics-based validation of genomic data: applications in colorectal cancer diagnosis Molecular & Cellular Proteomics. 2006, vol. 5, pp. 1471-1483.
8. Sidransky D. Emerging molecular markers of cancer. Nat. Rev. Cancer. 2002, vol. 2 (3), pp. 210-219.
9. Quackenbush J. Microarray data normalization and trans-formation nature. Genetics supplement. 2002, vol. 32, pp. 496-501. DOI 10.1038/ng1032.
10. Gearhart J., Pashos E.E., Prasad M.K. Pluripotency redux-advances in stem-cell research. The New England J. of Medicine. 2007, vol. 357, No. 15, pp. 1469-1472.
11. Ringvold H.C., Khalil R.A. Protein Kinase C as Regulator of Vascular Smooth Muscle Function and Potential Target in Vascular Disorders. Adv. Pharmacol. 2017, vol. 78, pp. 203-301.
12. Saito N., Shirai Y. Protein kinase C gamma (PKC gamma): function of neuron specific isotype. J. Biochem. 2003, vol. 132 (5), pp. 683-687.
13. Koivunen J., Aaltonen V., Peltonen J. Protein kinase C (PKC) family in cancer progression. Cancer Letters. 2006, vol. 235 (1), pp. 1-10.
14. Blackshaw S.E., Dow J. K., Lackie J. M. The dictionary of cell and molecular biology (3rd ed.). San Diego: Academic Press, 1999, 502 p.
15. Mehlen P., Puisieux A. Metastasis: a question of life or death. Nat. Rev. Cancer. 2006, vol. 6 (6), pp. 449-58. DOI 10.1038/nrc1886. PMID 16723991.
NATURAL SCIENCE. 2017. No. 4-2
16. Chan K.T., Cortesio Ch.L., Hutenlocher A. FAK alters invadopodia and focal adhesion composition and dynamics to regulate breast cancer invasion. J. Cell. Biol. 2009. DOI 10.1083/jcb.200809110.
17. Eleniste P.P., Patel V., Posritong S. [et al.]. Pyk2 and Megakaryocytes Regulate Osteoblast Differentiation and Migration Via Distinct and Overlapping Mechanisms. Cell. Biochem. 2016, vol. 117 (6), pp. 1396-1406. DOI 10.1002/jcb.25430. PMID 26552846.
18. Leong A. S-Y., Cooper K., Leong F. Manual of Diagnostic Cytology (2 ed.). Greenwich Medical Media, Ltd., 2003, p. 173.
19. Chao S.C., Tsai Y.M., Yang M.H., Lee J.Y. A novel mutation in the keratin 4 gene causing white sponge naevus. Br. J. Dermatol. 2003, vol. 148 (6), pp. 1125-1128.
20. Steinmann S., Scheibe K., Erlenbach-Wuensch K. [et al.]. Death-associated protein kinase: A molecule with functional antagonistic duality and a potential role in inflammatory bowel disease (Review). Int. J. Oncol. 2015, vol. 47, pp. 5-15. PMID 25963636.
21. Huang Y., Chen L., Guo L., Hupp T.R., Lin Y. Evaluating DAPK as a therapeutic target. Apoptosis. 2014, vol. 19 (2), pp. 371-386.
22. Bialik S., Kimchi A. The DAP-Kinase Interactome. Apoptosis. 2014, vol. 19, pp. 316-328.
23. Lin X., Liang M., Liang Y.Y. [et al.]. Activation of trans-forming growth factor-beta signaling by SUMO-1 modification of tumor suppressor Smad4/DPC4. The J. of Biological Chemistry. 2003, vol. 278 (21), pp. 18714-8719.
24. Kumar V., Abbas A.K., Fausto N., Robbins S.L., Cotran R.S. Robbins and Cotran pathologic basis of disease (7th ed.). St. Louis, Mo: Elsevier Saunders, 2005, 1525 p.
25. Ye Q., Wang T.F., Peng Y.F. [et al.]. Expression of alpha-, beta- and gamma-synuclein in colorectal cancer, and potential clinical significance in progression of the disease. Oncol. Rep. 2010, vol. 23 (2), pp. 429-436.
26. Abida W.M., Gu W. p53-Dependent and p53-independent activation of autophagy by ARF. Cancer Res. 2008, vol. 68 (2), pp. 352-357.
27. Sherr C.J. Autophagy by ARF: a short story. Mol. Cell. 2006, vol. 22 (4), pp. 436-437.
Поступила в редакцию /Received_6 сентября 2017 г. /September 6, 2017
