CC BY
83
Роль ЮР-р ШМДО-сигнального каскада в регуляции экспрессии циклооксигеназы-2 в клетках молочной железы человека
М.А. Таипов, З.Н. Никифорова, О.М. Павлова, И.А. Кудрявцев, Н.Е. Арноцкая, В.Е. Шевченко
ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва
Контакты: Марат Азатович Таипов [email protected]
Проведен анализ экспрессии генов SMAD2, SMAD4, SMAD7, СOX-2 и уровней белков SMAD4, SMAD7, фосфорилированной формы SMAD2 в линиях клеток рака молочной железы (РМЖ) человека MCF-7, BT-474, ZR-75-1. В результате обнаружено, что белки SMAD2, SMAD4 подавляют экспрессию фермента СOX-2 в ER(+)-клетках РМЖ и связаны с их метастатическим потенциалом. Белки SMAD4 и SMAD2, очевидно, супрессируют синтез мРНК белка COX-2, а SMAD7является их антагонистом и стимулирует образование СOX-2. Белки SMAD2, SMAD4, SMAD7можно рассматривать в качестве новых потенциальных мишеней для тар-гетной терапии РМЖ.
Ключевые слова:рак молочной железы, СOX-2, сигнальный путь TGF-pl/SMAD, гены и белки SMAD2, SMAD4, SMAD7, фосфори-лированная форма белка SMAD2, ингибиторы COX-2, PGE2, линии опухолевых клеток молочной железы человека MCF-7, BT-474, ZR-75-1, мишени для таргетной терапии
Role of TGF-01/SMAD signaling cascade in the regulation of cyclooxygenase-2 expression in human breast cancer cells
M.A. Taipov, Z.N. Nikiforova, O.M. Pavlova, I.A. Kudryavtsev, N.Ye. Arnotskaya, V.Ye. Shevchenko
N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
The expression of the SMAD2, SMAD4, SMAD7, and ^X-2 genes and the levels of Smad4, phosphorylated Smad2, and Smad7 proteins were analyzed in the human breast cancer (BC) cell lines MCF-7, BT-474, and ZR-75-1. The SMAD2 and SMAD4 genes were found to suppress COX-2 gene expression in the estrogen receptor-positive BC cells and to be linked to their metastatic potential. Smad4 and Smad2 apparently suppress COX-2 mRNA and protein synthesis and Smad7 is their antagonist and stimulates COX-2 formation. Smad2, Smad4, Smad7 proteins may be regarded as new potential targets for targeted BC therapy.
Key words: breast cancer, cyclooxygenase-2 (COX-2), TGF-P1/SMAD signaling pathway, SMAD2, SMAD4, and SMAD7genes, Smad4, Smad2, and Smad7 proteins, phosphorylated Smad2, inhibitors of COX-2, PGE2, human breast cancer cell lines MCF-7, BT-474, and ZR-75-1, targets for targeted therapy
Введение
Рак молочной железы (РМЖ) — наиболее распространенная форма рака у женщин в мире [1, 2]. В настоящее время достигнут значительный прогресс в идентификации генетических нарушений, которые ведут к развитию РМЖ, а также в выяснении роли белков этих генов в патофизиологии опухолевой клетки. Трансформирующий фактор роста р1 (ТОБ-р1) является одним из важнейших факторов в патогенезе различных онкологических заболеваний человека, в том числе и РМЖ, клетки которого способны продуцировать ТОБ-р1. Нарушение ТОР-р1/8МАБ-сигнального з пути связано с неопластической трансформацией, метастазированием и прогрессированием РМЖ [3]. с; В ряде исследований обнаружено, что ТОБ-р1/ ® 8МАБ2/4-сигнальный каскад играет важную роль Е в супрессии роста опухоли путем активации апоптоза * в клетках РМЖ, имеющих рецепторы к эстрогену [4]. ^ Эстроген является митогенным фактором для эстроген-позитивных (ЕЯ(+)) линий клеток РМЖ человека.
Протеин БМАБ4 — это ТОР-р1-сигнальный трансдук-тор, он участвует в передаче сигнала от ТОБ-р1-рецепторов и одновременно выступает в качестве транскрипционного репрессора эстрогена. Белок БМАБ4 активирует апоптоз в ЕЯ(+)-клетках линии МСБ-7, но не влияет на рост эстроген-независимых ЕЯ(-)-клеток культуры МБА-МВ-231 [4]. Протеин БМАБ4 ингибирует рост ЕЯ(+)-опухолей путем индукции апоптоза. Тем не менее, недостаточно известна роль ТОР-р1/8МАБ-сигнального пути в регуляции экспрессии гена COX-2 в клетках РМЖ. В представленной работе определены уровни белков БМАБ4, БМАБ7, фосфорилированной формы белка БМАБ2 и экспрессия генов SMAD4, SMAD7 и COX-2
в опухолевых клетках молочной железы (МЖ) человека ЕЯ(+)-линий МСБ-7, ВТ-474, 7Я-75-1 с различным метастатическим потенциалом. На основании анализа полученных данных мы предположили, что белки БМАБ2 и БМАБ4 являются негативными регуляторами метастатического потенциала ЕЯ(+)-опухо-
левых клеток и подавляют экспрессию гена COX-2, а SMAD7 стимулирует процессы опухолевого роста, инвазии, метастазирования РМЖ и является индуктором экспрессии гена COX-2.
Материалы и методы
Методика работы с культурой клеток
Изучали ЕЯ(+)-линии клеток аденокарциномы (MCF-7, ZR-75-1) и инфильтрирующей (инвазивной) протоковой карциномы (BT-474) МЖ человека из коллекции клеточных культур Института цитологии РАН. Культуры опухолевых клеток различались между собой по метастатической активности: линия MCF-7 — клетки с низким потенциалом к метастазированию (НПМ), линии ZR-75-1 и BT-474 — с высоким потенциалом к метастазированию (ВПМ).
Условия культивирования. Все клеточные культуры культивировали при 37 °С и 5 % СО2. Клетки линии MCF-7 культивировали в среде DMEM с 10 % эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС) и гентамицином (50 мкг/мл); ZR-75-1 - в RPMI-1640 с 10 % ЭТС, пенициллином (100 ед/мл), стрептомицином (100 мкг/мл); BT-474 - в RPMI-1640 с 10 % ЭТС, пенициллином (100 ед/мл) и стрептомицином (100 мкг/мл) и бычьим инсулином (10 мкг/мл).
В работе использовали рекомбинантный человеческий фактор некроза опухоли а (TNF-a) (R&D systems). Влияние TNF-а на продукцию эндогенного TGF-ß1 опухолевыми клетками линии MCF-7 оценивали через 72 ч после начала культивирования (48 ч с 10 % ЭТС + 24 ч без ЭТС), когда клетки контроля в среде с 10 % ЭТС достигали 80 % монослоя на 3-и сутки роста. Во всех случаях TNF-a добавляли в среду через 72 ч после начала культивирования, рабочая концентрация препарата TNF-a составила 10 нг/мл среды.
Получение лизатов клеток. Для анализа уровней протеинов методом ELISA клетки лизировали в 0,5 мл однократного фосфатного буфера с добавлением 5 мкл коктейля ингибиторов протеаз. Образцы лизатов хранили при температуре -80 °С. Концентрации белка в пробах измеряли на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific) с помощью программы NanoDrop ND-1000 по методу Бредфорда.
Измерение концентрации уровня белков SMAD4, фосфорилированной формы SMAD2, SMAD7, TGF-ß1 методом иммуноферментного анализа (ELISA). В исследовании использовали коммерческие киты ELISA kit SMAD4, ELISA kit SMAD7 (Life Science Ins.), ELISA kit human TGF-ß1 (RnD Systems), SMAD2, SMAD2/ Phospho. Концентрацию белков SMAD4, SMAD2/ Phospho, SMAD7 анализировали на приборе ELISA Model 680XR Microplate reader (Bio-Rad).
Выделение РНК из клеток. РНК выделяли с помощью коммерческого кита Perfect Pure RNA Cell and
Tissue kit на 50 выделений (5PRIME). Для выделения РНК брали 1 х 106 клеток. Выделенные образцы хранили при температуре -80 °С.
Определение концентрации РНК. Измерения концентрации ДНК и РНК в пробах были проведены на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific) с помощью программы NanoDrop ND-1000. Для высокоочищенной РНК соотношение А260/А280 составляло 1,8-2,1.
Метод полимеразной цепной реакции в реальном времени (RT-PCA). Обратную транскрипцию проводили по стандартному протоколу (Promega) с использованием фермента Reverse Transcriptase (Promega). Экспрессию генов изучали с помощью метода RT-PCA с использованием системы iQ5 (Bio-Rad) и «Набора для анализа экспрессии генов методом RT-PCA COX-2, SMAD2, SMAD4, SMAD7» («ДНК-Синтез»).
В реакции амплификации использовали модифицированный олигонуклеотид, который на 5'-кон-це содержал флуоресцирующую группу (FAM), а на 3'-конце - тушитель флуоресценции BQH1. Поли-меразную цепную реакцию проводили по стандартному протоколу к набору («ДНК-Синтез»). В качестве внутреннего стандарта использовали ген GAPDH. Результаты анализировали с использованием программного обеспечения iQ5 Optical System Software (Bio-Rad). В серии опытов получена хорошая воспроизводимость результатов, ошибка измерения составила ~ 2 %.
Результаты
Уровень экспрессии белка TGF-ß1 в лизатах клеток линии ZR-75-1 составлял 0,747 нг/мл, что в 1,7 раза выше, чем в лизатах культуры MCF-7, в которых концентрация TGF-ß1 была 0,434 нг/мл (рис. 1).
При стимуляции в течение 24 ч TNF-a (10 нг/мл) клеток линии MCF-7 наблюдали увеличение концен-
LL
о
(О о.
ф З'
о
Рис.
MCF-7 ZR-75-1
1. Концентрация TGF-ß1 в лизатах клеток линий MCF-7 и ZR-75-1
MCF-7
ZR-75-1
Рис. 2. Уровень белка TGF-pl в лизатах клеток линии MCF-7, культивированных с TNF-a (10 нг/мл), относительно контроля
о.и 0,06 -|
0,05 0,04 0,030,020,01 0
ВТ-474
MCF-7
ZR-75-1
Рис. 3. Оптическая плотность относительно фосфорилированной формы SMAD2 в лизатах клеток линий MCF-7, BT-474, ZR-75-1
трации TGF-ß1 в 1,7 раза в сравнении с контролем, а его уровень достигал 0,729 нг/мл (рис. 2).
Как видно из рис. 3—5, уровни экспрессии белков фосфорилированной формы SMAD2, SMAD4, SMAD7 различались в лизатах линий MCF-7, BT-474, ZR-75-1. При сравнительной оценке уровень экспрессии фосфорилированной формы белка SMAD2 был в 1,98 и 1,74 раза выше (см. рис. 3) в лизатах клеток MCF-7 по сравнению с ВТ-474 и ZR-75-1 соответственно.
В лизате клеток линии MCF-7 концентрация протеина SMAD4 составляла 0,459 нг/мл, ZR-75-1 - 0,517 нг/мл, BT-474 — 0,852 нг/мл. Таким образом, концентрация белка SMAD4 в лизатах клеток культур MCF-7 и ZR-75-1 была ниже, чем в BT-474, в 1,85 и 1,7 раза соответственно (см. рис. 4).
Концентрация белка SMAD7 в лизате клеток линии MCF-7 составляла 0,247 нг/мл, ZR-75-1 — 0,285 нг/мл,
BT-474 — 0,733 нг/мл. Следовательно, такая же зависимость, как и для белка SMAD4, наблюдалась и для концентраций протеина SMAD7: в лизатах клеток BT-474 уровень этого белка был выше в 3 и 2,6 раза по сравнению с MCF-7 и ZR-75-1 соответственно (см. рис. 5).
Анализ экспрессии генов SMAD2, SMAD4, SMAD7, COX-2 проводили относительно гена GAPDH, уровень экспрессии которого был принят за 1. Экспрессия генов COX-2 и SMAD7в клетках линий MCF-7 и ZR-75-1 не обнаружилась данным методом, в отличие от линии BT-474 (рис. 6). На рис. 7 и 8 представлены относительные уровни экспрессии генов SMAD2 и SMAD4. Анализ полученных результатов показал, что в клетках линии ВТ-474 уровень экспрессии гена SMAD4 был в 12,5 и 3,125 раза выше, чем в клетках линий MCF-7 и ZR-75-1 соответственно. Уровень экспрессии гена SMAD2 в клетках линии MCF-7 был в 5 раз выше, чем в клетках линий BT-474 и ZR-75-1. Сравнительный анализ экспрессии генов SMAD2 и SMAD4 выявил, что экспрессия SMAD2 в клетках линии MCF-7 была в 9,4 раза выше, чем SMAD4 (см. рис. 7), тогда как для BT-474 (см. рис. 6) и ZR-75-1 (см. рис. 8) наблюдалась другая зависимость — уровень экспрессии SMAD4 был в 6,25 и 2 раза соответственно выше, чем SMAD2, что коррелировало с данными, полученными в опытах ELISA.
Обсуждение
Недавние исследования показали, что TGF-ß1/ SMAD-сигнальный каскад регулирует экспрессию ци-клооксигеназы-2 (COX-2) в различных типах клеток [5, 6]. С ферментом СОХ-2 связывают воспаление и неопластическую трансформацию высокодифферен-цированных клеток МЖ. Повышенная экспрессия COX-2 наблюдается в опухолевой ткани и способствует развитию, росту и метастазированию РМЖ. Ингибиторы СОХ-2 высокоэффективны при использовании
ВТ-474
MCF-7
ZR-75-1
Рис. 4. Концентрация SMAD4 в лизатах клеток линий MCF-7, BT-474, ZR-75-1
в комбинированной химиотерапии многих опухолей, в частности РМЖ. Существуют различные пути передачи ТОР-р1-сигнала в клетке, один из которых подавляет экспрессию гена СОХ-2, а другой стимулирует. Мы предположили, что подавление экспрессии СОХ-2 осуществляется через ТОР-р1/8МАБ2/4-сигнальный каскад, а активация СОХ-2 - через ТОР-р1/8МАБ7. Эти 2 сигнальных пути связаны и взаимно регулируются. Показано, что ТОБ-р1 может быть как супрессором опухолевого роста, так и прометастатическим фактором при смещении равновесия в системе ТОР-р1/8МАО-сигнальной регуляции в ту или иную сторону [7, 8]. ТОБ-р1 и СОХ-2 вовлечены в регуляцию пролиферации клеток и контролируют процессы опухолевого роста, инвазии и метастазирования [9-14].
ТОБ-р1 является важным регулятором роста нормальных эпителиальных клеток МЖ человека. Тем не
ВТ-474
MCF-7
ZR-75-1
Рис. 5. Концентрация SMAD7 в лизатах клеток линий MCF-7, BT-474, ZR-75-1
менее, данные о влиянии TGF-ß1 на развитие и про-грессирование РМЖ противоречивы. Рост многих опухолевых линий РМЖ подавляется TGF-ß1 [15, 16] в связи с торможением деления клеток и индукцией апоптоза. Гипотеза о влиянии TGF-ß1 на клетки РМЖ как опухолевого супрессора согласуется с экспериментальными данными, полученными при воздействии TGF-ß1 на дифференцированные опухолевые клетки МЖ человека [17, 18]. Обнаружена способность некоторых опухолевых клеток продуцировать собственный TGF-ß1, что и было показано нами в представленной работе. Уровень эндогенного TGF-ß1 в клетках линии ZR-75-1 был в 1,7 раза выше, чем в клетках линии MCF-7 (см. рис. 1).
По нашим данным, TNF-а увеличивает продукцию эндогенного TGF-ß1 опухолевыми клетками РМЖ линии MCF-7 (см. рис. 2): в стимулированных TNF-а клетках линии MCF-7 уровень эндогенного TGF-ß1 возрастал в 1,7 раза в сравнении с контролем.
GAPDH
SMAD2
SMAD4
СОХ-2
SMAD7
Рис. 6. Анализ уровня экспрессии генов SMAD2, SMAD4, COX-2, SMAD7 в клетках линии BT-474
Таким образом, TNF-a стимулирует образование клетками опухоли эндогенного TGF-pi и одновременно является индуктором COX-2. В работе показано, что уровень экспрессии TGF-pi коррелирует с потенциалом опухолевых клеток МЖ к метастазированию. Гиперэкспрессия эндогенного TGF-pi клетками линии ZR-75-1, обладающими повышенной метастатической активностью, подтверждает гипотезу о том, что опухолевые клетки на более поздних стадиях РМЖ могут трансформироваться и приобретать чувствительность к прометастатическому эффекту TGF-pi [19, 20].
Следует отметить, что уровни белков SMAD2 и SMAD4 коррелируют с экспрессией мРНК SMAD2 и SMAD4 в ER(+)-клетках РМЖ. По данным ряда авторов, гены SMAD2 и SMAD4 являются негативными регуляторами экспрессии некоторых онкогенов: p38, MAPK, ERK, PI3K, JNK, Rho и подавляют экспрессию гена COX-2 [21, 22]. На основании полученных нами результатов можно предположить, что SMAD4 связан с регуляцией метастатической активности опухолевых клеток, а SMAD2 является супрессором опухолевого роста.
Белки SMAD являются основными преобразователями сигналов TGF-pi. TGF-pi связывается с гомоди-мером рецептора TGF-p II типа (TGF-pRII), который активизирует гомодимеры рецептора TGF-p I типа (TGF-pRI). Активированный TGF-pRI фосфорилирует SMAD2 [23, 24], который активирует SMAD4. Эти активные гетерокомплексы находятся в клеточном ядре, где они связываются с ДНК и регулируют экспрессию TGF-pi-зависимых генов [25]. TGF-p i-сигнализация изменяется в различных типах опухолей, отсутствие экспрессии TGF-pRII достоверно коррелирует с лучшим прогнозом у ER(—)-больных РМЖ [26], однако очень мало известно о влиянии TGF-pi-сигнального пути на прогноз при различных типах РМЖ. Делеция или мутация гена SMAD4 (также известная как DPC4,
вАРйН
вмАйг
ЭМА04
Рис. 7. Анализ уровня экспрессии генов SMAD2 и SMAD4 в клетках линии MCF-7
делеция при раке поджелудочной железы (РПЖ)) обнаружена в различных типах эпителиальных опухолей, в том числе РПЖ [27, 28], раке пищевода [29], колорек-тальном раке [30], почечно-клеточном раке [31], а также РМЖ [32—34]. Тем не менее, мало данных о роли 8ИЛВ4 в регуляции экспрессии ^Х-2 или его прогностическом значении при РМЖ.
Ряд авторов указывают, что гены SMAD2, SMAD4, белки БМАБ4, БМАБ2, фосфорилированный БМАБ2 являются негативными регуляторами метастатической активности неопластических клеток [35, 36]. Гены SMAD2 и SMAD4 экспрессированы в ЕЯ(+)-опухолях МЖ человека, что служит благоприятным прогностическим фактором для больных [35]. Из литературных источников известно, что в ЕЯ(—)-клетках РМЖ гены SMAD2 и SMAD4 неактивны и это является негативным прогностическим фактором при метастазировании РМЖ [36].
Экспериментальные исследования [37] показали высокий уровень активности белка 8МЛБ4 в ЕЯ(+)-клет-ках и слабую его экспрессию в ЕЯ(-)-клетках. Низкий уровень экспрессии 8МЛБ4 коррелирует с высоким потенциалом опухолевых клеток к метастазированию и ин-вазивностью ЕЯ(-)-линий РМЖ человека. Также в ЕЯ(-)-линиях РМЖ обнаружена высокая активность СОХ-2 по сравнению с ЕЯ(+)-линиями, в которых фермент СОХ-2 неактивен [38]. Гены COX-2 и SMAD7 гипер-экспрессированы в ЕЯ(-)-линиях и неактивны в ЕЯ(+)-линиях РМЖ МСБ-7, 7Я-75-1, ВТ-474 [39]. Эти данные согласуются с полученными нами результатами: в ЕЯ(+)-клетках линий МСБ-7 и 7Я-75-1 экспрессия генов СОХ-2 и SMAD7 практически не определялась. Для высокоин-вазивной линии ВТ-474 наблюдалась обратная зависимость — в клетках данной линии уровень экспрессии SMAD2 был в 5 раз ниже, чем в клетках линии МСБ-7, и в отличие от линий МСБ-7 и 7Я-75-1 определялась экспрессия генов SMAD7 и СОХ-2.
По данным ряда авторов, гены SMAD2 и SMAD4 являются супрессорами гена Ш.Х-2 [40]. В нашем исследо-
вании эти результаты подтвердились (см. рис. 6—8). В линии опухолевых клеток 7Я-75-1 экспрессировалась мРНК генов 5ЫЛВ2 и SMAD4 (см. рис. 8), тогда как мРНК ШхХ-2 и SMAD7 не определялась. Таким образом, уровень экспрессии мРНК SMAD2 и SMAD4 обратно коррелирует с экспрессией мРНК ^Х-2, что доказывает наличие возможной взаимной регуляции генов. Очевидно, что один из механизмов антиметастатической активности генов SMAD2 и SMAD4 связан с подавлением ряда прометастатических генов, в том числе и COX-2; следствие этого — прекращение выработки РОЕ2, важнейшего регулятора опухолевой инвазии, прогрессии и метастазирования.
Известно, что белки БМА02 и 8МЛБ4, индуцируемые ТОБ-р1, в ряде случаев подавляют метастатическую активность клеток опухоли [41]. Уровень фосфорилиро-ванной формы БМАБ2 был максимальным в клетках линии МСБ-7 с НПМ в сравнении с клетками линий ВТ-474 и 7Я-75-1 с ВПМ. Белок БМАБ2 и его фосфорилированная форма подавляют выработку фермента СОХ-2. Анализ экспрессии генов SMAD2 и SMAD4 показал, что она ярко выражена в ЕЯ(+)-культурах МСБ-7, 7Я-75-1, ВТ-474, это объясняет отсутствие активности генов SMAD7 и Ш.Х-2.
Полученные нами результаты и данные литературы позволяют заключить, что гиперэкспрессия гена SMAD2 в ЕЯ(+)-клетках линии МСБ-7 и слабая его активность в ЕЯ(-)-клетках (по данным литературы) обратно коррелируют с повышенной метастатической активностью и инвазивностью ЕЯ(—)-опухолей и экспрессией SMAD7и ШХ-2. Анализ белка БМАБ4 показал, что его экспрессия ярко выражена в ЕЯ(+)-клет-ках линий 7Я-75-1 и ВТ-474 с ВПМ. Таким образом, белок БМАБ4, возможно, связан с регуляцией опухолевой прогрессии и метастазирования, а нарушение работы и мутации гена SMAD4 в ряде случаев могут быть связаны с возникновением и развитием РМЖ.
1,2 1
в АРОН
БМА02
ЭМА04
Рис. 8. Анализ уровня экспрессии генов SMAD2 и SMAD4 в клетках линии ZR-75-1
По данным литературы, белки БМАБ2 и БМАБ4 подавляют экспрессию фермента СОХ-2, что объясняет отсутствие экспрессии этого фермента в исследуемых линиях клеток.
Известно, что в некоторых случаях ТОР-р1/8МАБ-сигнальный каскад способен трансформироваться из опухолевого супрессора в индуктор неопластической трансформации, инвазии, прогрессии и метастазиро-вания РМЖ. Протеин БМАБ7 связан с регуляцией ТОР-р1-сигнального пути и эпителиально-мезенхи-мальным переходом опухолевых клеток [42]. Белок БМА07 — регулятор прогрессии, инвазии и метастази-рования РМЖ [43], ассоциированный с негативным прогнозом у больных РМЖ и рассматриваемый рядом авторов в качестве потенциального маркера [44]. Белок БМА07, тормозящий БМЛО-сигнальный путь, выступает в качестве ключевого регулятора формирования обратной связи в механизмах ТОР-р1-сигнального пути. Протеин БМАБ7, индуцируемый ТОР-р1-сигналом, является антагонистом и супрессором белков БМАБ2 и БМАБ4. Белок БМА07 блокирует апоптоз опухолевых клеток [45], тормозит деятельность протеинов БМАБ2 и БМАБ4, тем самым индуцируя рост опухоли, ангиогенез и метастазирование в кости РМЖ. Анализ содержания белка БМА07 в клетках показал его повышенную экспрессию в линии ВТ-474, обладающей более высоким метастатическим потенциалом в сравнении с низкометастатической линией МСБ-7, в которой уровень этого протеина был ниже в 3 раза. Также в клет-
ках линии ВТ-474, в отличие от МСБ-7 и 7Я-75-1, определялась экспрессия генов СОХ-2 и БМА07. Это подтверждает гипотезу, что БМАБ7 стимулирует экспрессию СОХ-2. Таким образом, белок БМА07 стимулирует опухолевый рост и метастазирование, индуцирует СОХ-2, ассоциирован с негативным прогнозом у больных и рассматривается нами в качестве потенциального маркера РМЖ. Протеин БМАБ7 в будущем может быть эффективной мишенью для новых таргет-ных препаратов в терапии РМЖ [46].
Заключение
Нарушение регуляции ТОБ-р 1/БМАБ-сигнального пути связано с неопластической трансформацией, метастазированием и прогрессией РМЖ. Обнаружена корреляция уровня эндогенного ТОБ-Р1 с потенциалом опухолевых клеток к метастазирова-нию. Белки БМА02 и БМАБ4 являются негативными регуляторами экспрессии СОХ-2 в ЕЯ(+)-клетках РМЖ, БМАБ7 стимулирует СОХ-2 и запускает процессы опухолевого роста, инвазии и метастазирова-ния. Фосфорилированная форма белка БМАБ2 является супрессором опухолевого роста. Нарушение регуляции генов 8МАВ2 и 8МАВ4 связано с развитием РМЖ, и в ряде случаев гиперэкспрессия БМАБ4 приводит к индукции метастатической активности опухолевых клеток. Белки БМАБ2, БМАБ4 и БМАБ7 можно рассматривать в качестве новых потенциальных мишеней для таргетной терапии РМЖ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Cancer Incidence in Five Continents. Vol. IX / M.P. Curado, B. Edwards, H.R. Shin
et al. (Eds.). IARC Scientific Publications No. 160. Lyon: IARC, 2007.
2. Schedin P., Borges V. Breaking down barriers: the importance of the stromal microenvironment in acquiring invasiveness in young women's breast cancer. Breast Cancer Res 2009;11(2):102.
3. Kretzschmar M. Transforming growth factor-beta and breast cancer: Transforming growth factor-P/SMAD signaling defects and cancer. Breast Cancer Res 2000;2(2):107-15.
4. Li Q., Wu L., Oelschlager D.K. et al. Smad4 inhibits tumor growth by inducing apoptosis in estrogen receptor-alpha-positive breast cancer cells. J Biol Chem 2005;280(29):27022-8.
5. Matsumura T., Suzuki T., Aizawa K. et al. Regulation of transforming growth factor-beta-dependent cyclooxygenase-2 expression in fibroblasts. J Biol Chem 2009;284(51):35861—71.
6. Okano H., Shinohara H., Miyamoto A. et al. Concomitant overexpression of cyclooxygenase-2 in HER-2-positive on
Smad4-reduced human gastric carcinomas is associated with a poor patient outcome. Clin Cancer Res 2004;10(20):6938-45.
7. Mo N., Li Z.Q., Li J., Cao Y.D. Curcumin inhibits TGF-p1-induced MMP-9 and invasion through ERK and Smad signaling in breast cancer MDA- MB-231 cells. Asian Pac J Cancer Prev 2012;13(11):5709-14.
8. Hsu H.Y., Lin T.Y., Hwang P.A. et al. Fucoidan induces changes in the epithelial to mesenchymal transition and decreases metastasis by enhancing ubiquitin-dependent TGFp receptor degradation in breast cancer. Carcinogenesis 2013 [in print].
9. Gomes L.R., Terra L.F., Wailemann R.A. et al. TGF-P1 modulates the homeostasis between MMPs and MMP inhibitors through p38 MAPK and ERK1/2 in highly invasive breast cancer cells. BMC Cancer 2012;12:26.
10. Baselga J., Rothenberg M.L., Tabernero J. et al. TGF-beta signalling-related markers in cancer patients with bone metastasis. Biomarkers 2008;13(2):217-36.
11. Schrey M.P., Patel K.V. Prostaglandin E2 production and metabolism in human breast
cancer cells and breast fibroblasts. Regulation by inflammatory mediators. Br J Cancer 1995;72(6):1412—9.
12. Wang D., DuBois R.N. Cyclooxygenase 2-derived prostaglandin E2 regulates the angiogenic switch. Proc Natl Acad Sci USA 2004;101(2):415—6.
13. Guo J., Meng H., Pei J., Zhu M. Association between the TNF-a-238G>A and TGF-ß1 L10P polymorphisms and breast cancer risk: a meta-analysis. Breast Care (Basel) 2011;6(2):126—9.
14. Reinholz M.M., An M.W., Johnsen S.A. et al. Differential gene expression of TGF beta inducible early gene (TIEG), Smad7, Smad2 and Bard1 in normal and malignant breast tissue. Breast Cancer Res Treat 2004;86(1):75—88.
15. Basolo F., Fiore L., Ciardiello F. et al. Response of normal and oncogene-transformed human mammary epithelial cells to transforming growth factor beta 1 (TGF-beta 1): lack of growth-inhibitory effect on cells expressing the simian virus 40 large-T antigen. Int J Cancer 1994;56(5):736-42.
16. Zugmaier G., Ennis B.W., Deschauer B. et al. Transforming growth factors type beta 1 and beta 2 are equipotent growth inhibitors of human breast cancer cell lines. J Cell Physiol 1989;141(2):353-61.
17. Dai J.L., Bansal R.K., Kern S.E. G1 cell cycle arrest and apoptosis induction by nuclear Smad4/Dpc4: phenotypes reversed by a tumorigenic mutation. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96(4):1427-32.
18. Derynck R. TGF-beta-receptor-mediated signaling. Trends Biochem Sci 1994;19(12):548—53.
19. Gorsch S.M., Memoli V.A., Stukel T.A. et al. Immunohistochemical staining for transforming growth factor beta 1 associates with disease progression in human breast cancer. Cancer Res 1992;52(24):6949-52.
20. Siegel P.M., Shu W., Cardiff R.D. et al. Transforming growth factor beta signaling impairs Neu-induced mammary tumorigenesis while promoting pulmonary metastasis. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100(14):8430-5.
21. Stuelten C.H., Buck M.B., Dippon J. et al. Smad4-expression is decreased in breast cancer tissues: a retrospective study. BMC Cancer 2006;6:25.
22. Petersen M., Pardali E., van der Horst G. et al. Smad2 and Smad3 have opposing roles in breast cancer bone metastasis by differentially affecting tumor angiogenesis. Oncogene 2010;29(9):1351-61.
23. Kawabata M., Inoue H., Hanyu A. et al. Smad proteins exist as monomers in vivo and undergo homo- and hetero-oligomerization upon activation by serine/threonine kinase receptors. Embo J 1998;17(14):4056-65.
24. Kloos D.U., Choi C., Wingender E. The TGF-beta-Smad network: introducing bioinformatic tools. Trends Genet 2002;18(2):96-103.
25. Heldin C.H., Miyazono K., ten Dijke P. TGF-beta signalling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins. Nature 1997;390(6659):465-71.
26. Buck M., Fritz P., Dippon J. et al. Prognostic significance of transforming growth factor beta receptor II in estrogen receptor
negative breast cancer patients. Clin Cancer Res 2004;10(2):491—8.
27. Hahn S.A., Schutte M., Hoque A.T. et al. DPC4, a candidate tumor suppressor gene at human chromosome 18q21.1. Science 1996;271(5247):350—3.
28. Wilentz R.E., Su G.H., Dai J.L. et al. Immunohistochemical labeling for dpc4 mirrors genetic status in pancreatic adenocarcinomas : a new marker of DPC4 inactivation. Am J Pathol 2000;156(1):37-43.
29. Wilentz R.E., Iacobuzio-Donahue C.A., Argani P. et al. Loss of expression of Dpc4 in pancreatic intraepithelial neoplasia: evidence that DPC4 inactivation occurs late in neoplastic progression. Cancer Res 2000;60(7):2002—6.
30. Natsugoe S., Xiangming C., Matsumoto M. et al. Smad4 and transforming growth factor beta1 Expression in patients with squamous cell carcinoma of the esophagus. Clin Cancer Res 2002;8(6):1838-42.
31. Salovaara R., Roth S., Loukola A. et al. Frequent loss of SMAD4/DPC4 protein in colorectal cancers. Gut 2002;51(1):56-9.
32. Cardillo M.R., Lazzereschi D., Gandini O. et al. Transforming growth factor-beta pathway in human renal cell carcinoma and surrounding normal-appearing renal parenchyma. Anal Quant Cytol Histol 2001;23(2):109—17.
33. Schutte M. DPC4/SMAD4 gene alterations in human cancer, and their functional implications. Ann Oncol 1999;10(4):56-9.
34. Schutte M., Hruban R.H., Hedrick L. et al. DPC4 gene in various tumor types. Cancer Res 1996;56(11):2527-30.
35. Scollen S., Luccarini C., Baynes C. et al. TGF-ß signaling pathway and breast cancer susceptibility. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2011;20(6):1112—9.
36. Xiong Z., Ding L., Sun J. et al. Synergistic repression of estrogen receptor transcriptional activity by FHL2 and Smad4 in breast cancer cells. IUBMB Life 2010;62(9):669-76.
37. Erkinheimo T.L., Lassus H., Finne P. et al. Elevated cyclooxygenase-2 expression is
associated with altered expression of p53 and SMAD4, amplification of HER-2/neu, and poor outcome in serous ovarian carcinoma. Clin Cancer Res 2004;10(2):538-45.
38. Zhao X., Goswami M., Pokhriyal N. et al. Cyclooxygenase-2 expression during immortalization and breast cancer progression. Cancer Res 2008;68(2):467-75.
39. Serra K.P., Sarian L.O., Rodrigues-Peres R.M. et al. Expression of cyclooxygenase-2 (COX-2) and p53 in neighboring invasive and in situ components of breast tumors. Acta Histochem 2012;114(3):226—31.
40. Singh M., Chaudhry P., Parent S., Asselin E. Ubiquitin-proteasomal degradation of COX-2 in TGF-P stimulated human endometrial cells is mediated through endoplasmic reticulum mannosidase I. Endocrinology 2012;153(1):426—37.
41. Banz-Jansen C., Munchow B., Diedrich K., Finas D. Bridge-1 is expressed in human breast carcinomas: silencing of Bridge-1 decreases Smad2, Smad3 and Smad4 expression in MCF-7 cells, a human breast cancer cell line. Arch Gynecol Obstet 2011;284(6):1543—9.
42. Luo X., Ding Q., Wang M. et al. In vivo disruption of TGF-beta signaling by Smad7 in airway epithelium alleviates allergic asthma but aggravates lung carcinogenesis in mouse. PLoS One 2010;5(4):e10149.
43. Shen J.L., Yan C.H., Liu Y. et al. Studies of TGF-beta/Smads expression in lung cancer. Yi Chuan Xue Bao 2003;30(7):681-6.
44. Reinholz M.M., Nibbe A., Jonart L.M. et al. Evaluation of a panel of tumor markers for molecular detection of circulating cancer cells in women with suspected breast cancer. Clin Cancer Res 2005;11(10):3722-32.
45. Kim S., Han J., Lee S.K. et al. Smad7 acts as a negative regulator of the epidermal growth factor (EGF) signaling pathway in breast cancer cells. Cancer Lett 2012;314(2):147-54.
46. Jeon W.K., Hong H.Y., Seo W.C. et al. Smad7 sensitizes A549 lung cancer cells to cisplatin-induced apoptosis through heme oxygenase-1 inhibition. Biochem Biophys Res Commun 2012;420(2):288-92.
