CC BY
38
Ш1В-21 и т1В-155 в регуляции ЮР-рШМАО-сигнального пути в линии клеток рака молочной железы с различным метастатическим потенциалом
З.Н. Никифорова, И.А. Кудрявцев, В.Е. Шевченко
ФГБНУ«Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина»; Россия, 115201, Москва, Каширское шоссе, 24
Контакты: Зоя Николаевна Никифорова [email protected]
Рак молочной железы (РМЖ) является одной из основных онкопатологий среди женщин. Метастазы — главная причина фатальных исходов при РМЖ. В этой связи особый интерес приобретает изучение молекулярных механизмов эпителиально-мезенхималь-ного перехода (ЭМП). В механизмы ЭМПвовлечен TGF-в 1/SMAD-сигнальный путь, через регуляцию которого можно воздействовать на процессы метастазирования при РМЖ. В данной работе была изучена экспрессия мРНК семейства SMAD, тгЯ-21 и тгЯ-155. Экспрессия тгЯ-21 в опухолевых клетках линий MCF-7, ZR-75-1, ВТ-474 бьла увеличена. Уровень экспрессии т1Я-155 был значительно ниже уровня экспрессии тгЯ-21. В опухолевых клетках РМЖ внутриклеточные механизмы регуляции SMAD2, SMAD4, SMAD7были нарушены.
Исследована корреляционная связь экспрессии тгЯ-21 и т1Я-155 с регуляцией SMADs в TGF-в 1/SMAD-сигнальном пути в 3 линиях карцином молочной железы человека с различным метастатическим потенциалом (MCF-7, ZЯ-75-1, ВТ-474). В клеточной линии MCF-7 значимая обратная корреляция наблюдалась между SMAD4 и т1Я-155. В клеточной линии ВТ-474 — между уровнями экспрессии SMAD2, SMAD4, SMAD7 и т1Я-155, тгЯ-21. В клеточной линии ZЯ-75-1 была выявлена корреляция экспрессии мРНК SMAD2, SMAD4, SMAD7 как с т1Я-155, так и с тгЯ-21. Результаты работы свидетельствуют о том, что т1Я-155 и тгЯ-21 в различной степени влияли на экспрессию SMAD2, SMAD4, SMAD7, блокируя работу этих генов и усиливая прогрессию и степень злокачественности клеток РМЖ человека, а в некоторых случаях их эффект был кумулятивным.
Ключевые слова: рак молочной железы, микроРНК, тгЯ-21, т1Я-155, SMAD2, SMAD4, SMAD7, TGF-P1, эпителиально-мезенхи-мальный переход, TGF-в1/SMAD-сигнальный путь
DOI: 10.17650/1994-4098-2015-11-3-15-21
miR-21 and miR-155 in the regulation of TGF-01/SMAD signaling pathway of the line breast cancer cells
with different metastatic potential
Z.N. Nikiphorova, I.A. Kudryavtsev, V.Е. Shevchenko N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center; 24 Kashirskoe Shosse, Moscow, 115201, Russia
Breast cancer (BC) is the most common form of cancer, leading to high mortality rates among women worldwide. Metastasis is the main cause of fatal outcomes in BC. In this regard, of particular interest takes the study of molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition (EMT). In the EMT processes involved in TGF-f!1/SMAD-signaling pathway through the regulation of which can affect the processes of metastasis in BC.
In this study we have analyzed changes of mRNA expression of the mRNA SMADs, miR-21, and miR-155 of the tumor BC cells with different metastatic potential MCF-7, BT-474, ZR-75-1. High expression of miR-21 was detected in all the tumor cell lines (MCF-7, ZR-75-1 and BT-474). In the BC cell lines, the expression level of miR-155 was significantly lower than that of miR-21. Analysis of mRNA expression has clearly shown impairments of intracellular mechanisms of regulation of SMAD2, SMAD4, SMAD7 in BC.
Investigated the correlation of expression of miR-21 and miR-155 regulation of SMADs in TGF-P1/SMAD signaling pathway in three carcinomas lines of the human breast with different metastatic potential (MCF-7, ZR-75-1, BT-474). A significant inverse correlation was observed between SMAD4 and miR-155 in MCF-7 cells. Inverse correlation between the expression of SMAD2, SMAD4, SMAD7 and miR-155; miR-21 was found in the BT-474 cells.
The results obtained in this study showed that miR-21 and miR-155 regulate activity of several genes SMAD2, SMAD4, SMAD7 in the tumor cell ZR-75-1 and on some genes they exhibited a cumulative effect. It should be noted that the miR-155 and miR-21 in various degrees influenced the expression of SMAD2, SMAD4, SMAD7, blocking the work of these genes and, thereby exacerbating the progression and degree of malignancy of BC cells human; in some cases their effects on individual genes were cumulative.
Key words: breast cancer, microRNA, miR-21, miR-155, SMAD2, SMAD4, SMAD7, TGF-P1, epithelial-mesenchymal transition, TGF-P1/ SMAD-signaling pathway
Введение
В России рак молочной железы (РМЖ) занимает 1-е место по показателям заболеваемости (20 %) и смертности (17,3 %) среди злокачественных новообразований у женщин в возрасте от 40 до 85 лет [1]. Метастазы — главная причина фатальных исходов при РМЖ. В этой связи особый интерес приобретает изучение молекулярных механизмов эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), играющего важную роль при метастазировании солидных опухолей. ЭМП — комплекс изменений в фенотипе клеток, которые приобретают повышенные инвазивные свойства [2]. Отмечена повышенная экспрессия генов ЭМП в базальноподобных опухолях молочной железы, большинстве инвазивных новообразований [3] с наихудшим прогнозом и опухолях с резистентностью к химиотерапии [4].
В ЭМП вовлечены сигнальные пути: TGF-P1/ SMAD, MAPK, Pi3K/Akt/mTOR, PGE2 /COX, Notch, Hedgehog, Wnt/ p-catenin. Изучая их роль в регуляции ЭМП, можно воздействовать на процессы метастази-рования при РМЖ.
Большой интерес при изучении молекулярных механизмов метастазирования вызывают трансформирующие факторы роста (TGF-a и TGF-P) — важные регуляторы морфологической и инвазивной фазы ЭМП. Известно, что TGF-P1 активирует сигнальные пути, участвующие в ЭМП, в частности TGF-pl/SMAD-сигнальный путь [5]. Эпителиальные клетки способны продуцировать собственный эндогенный фактор роста TGF-P1. Показано, что TGF-P1 может быть как супрессором опухолевого роста, так и прометастатическим фактором в системе TGF-pl/SMAD-сигнальной регуляции в ту или иную сторону [6]. Нарушение TGF-P1/ SMAD-сигнальной регуляции происходит через белки семейства SMAD и TGF-P1, что связано с неопластической трансформацией, метастазированием
Таблица 1. Характеристика клеточных линий РМЖ[22—25]
и прогрессией опухоли [7]. Однако не ясно, за счет каких механизмов происходят эти нарушения.
Известно, что микроРНК осуществляют регуляцию трансляционной эффективности или скорости деградации мРНК за счет комплементарного связывания с мишенью и поэтому экспрессия мРНК не дает достоверной информации об образовании белка. При высоком уровне экспрессии мРНК синтез его продукта может быть снижен за счет микроРНК [8]. В настоящее время только для небольшого количества микроРНК определены мРНК-мишени. Отмечена регуляция ш1Я-21 и ш1Я-155 ЭМП через TGF- 1 /БМАБ-сигнальный путь [9, 10]. шгЯ-21 и ш1Я-155 сверхэкспрессированы в клетках РМЖ человека [11, 12]. Предполагают, что ш1К-21 регулирует способность эпителиальных клеток отвечать на стимуляцию TGF-pl, воздействуя на туморогенность клеток. Повышение экспрессии ш1Я-155 было обнаружено при инвазивном РМЖ [13]. Эти данные свидетельствуют о том, что ш1К-155 может играть важную роль в TGF-p-индуцированном ЭМП при метастази-ровании РМЖ. Недостаточно ясна роль ш1К-21 и ш1Я-155 в регуляции TGF-pl/ БМАБ-сигнального пути при РМЖ.
В данной работе изучена экспрессия мРНК семейства SMAD, ш1Я-21 и ш1К-155. Исследована корреляционная связь экспрессии ш1К-21 и ш1Я-155 с регуляцией БМАБб в TGF-pl/ БМАБ-сигнальном пути в 3 линиях карцином молочной железы человека с различным метастатическим потенциалом (MCF-7, /Я-75-1, В^474).
Материалы и методы
Исследование проводили на культурах клеток РМЖ человека с различным метастатическим потенциалом: MCF-7, /Я-75-1 и В^474 (табл. 1). Культуры клеток получены в Институте цитологии РАН. В качестве питательной среды для /Я-75-1 и В^474 ис-
Линия клеток Происхождение Тип клеток Фенотипические особенности
MCF-7 Аденокарцинома молочной железы; метастаз плеврального выпота Эпителио-подобная ЕЯ+/РЯ+, экспрессия НЕЯ-2 (0—1+), Кь67 - 90 %, люминальный А. Клеточная линия характеризуется очень слабой миграцией и инвазивностью, положительной экспрессией СК8, СК18, СК19, отрицательной экспрессией виментина. Образование TGF-p1— 2 пг/мл
к ^ о ZR-75-1 Протоковая карцинома; асцит Эпителио-подобная ЕЯ+/РЯ+, экспрессия НЕЯ-2 (2+), Кь67 — 80 %, люминальный А. Характеризуется низкой инвазивностью, положительной экспрессией СК8, СК18, СК19, отрицательной экспрессией виментина. Образование TGF-p1 более 100 пг/мл
4 о 5 S га BT-474 Протоковая карцинома; эпителий протоков молочной железы Эпителио-подобная ЕЯ+/РЯ+, экспрессия НЕЯ-2 (3+), Кь67 — 70 %, люминальный В. Характеризуется миграцией и инвазивностью. Клетки опухоли способны давать метастазы в лимфоузлы, легкие. Характеризуется положительной экспрессией СК8, СК18, СК19, экспрессией виментина (+/—)
Примечание. ER — рецепторы эстрогенов, PR — рецепторы прогестерона, СК — цитокератины.
пользовали RPMI-1640 c L-глутамином; для клеток MCF-7 — среду DMEM c L-глутамином. В состав питательных сред входила 10 % эмбриональная телячья сыворотка.
Выделение мРНК проводили с использованием набора Perfect Pure RNA Cell and Tissue kit (5 PRIME, США). Приготовление образцов и выделение мРНК осуществляли в соответствии с рекомендациями производителя. Для выделения мРНК использовали ~ 1 х 106 клеток. Полученные образцы хранили при температуре —80 °С. Концентрацию мРНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, США). Анализ чистоты выделенной мРНК проводили по показателю соотношения интен-сивностей пиков А260/А280. Для очищенной мРНК это соотношение составляло 1,8—2,1.
Реакцию обратной транскрипции проводили по стандартному протоколу Reverse Transcription ProtoCol (Promega, США) согласно рекомендациям производителя в объеме 20 мкл. В качестве праймеров использовали разработанные специфические олигонук-леотиды и обратную транскриптазу M-MuLV (ДНК-синтез, Россия). Реакция проходила при температуре 42 °С в течение 50 мин с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 70 °С в течение 15 мин.
Экспрессию генов анализировали методом поли-меразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени с использованием системы iQ5 (Bio-Rad, США). Праймеры для анализа экспрессии гена были разработаны фирмой «Синтол» (Россия) с использованием Primer Express версии 1.0 (табл. 2). В качестве флуоресцентного красителя в зонде использовался карбоксифлуоресцеин (^max поглощения составляло 490 нм). ПЦР проводили по стандартному протоколу в объеме 25 мкл. Программа для проведения ПЦР в реальном времени: 1 цикл: 95 °С — 3 мин; 55 циклов: 95 °С — 15 с, 60 °С — 1 мин (измерение флуоресценции). В качестве референсного гена использовали ß-actin. Из полученных образцов комплементарной ДНК для каждой клеточной линии делали калибровочный раствор. Его использовали для построения калибровочных кривых, по которым определяли относительное количество комплементарной ДНК в образцах.
Анализ экспрессии miR-21 и miR-155. Для выделения микроРНК использовали фенол-хлороформную смесь (1:1) и набор mirVanaTMmiRNA Isolation Kit (Ambion, США). Выделение микроРНК осуществляли по стандартному протоколу к набору. Измерения концентрации микроРНК в пробах проводили на спектрофотометре NanoDrop ND-1000. Чистоту выделенной микроРНК измеряли по соотношению АМ0/А280, которое составляло 1,8—2,1.
Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit в комбинации с набором TaqMan MicroRNA Assays (Applied Biosystems, США). Температурный режим: 30 мин — 16 °С, 30 мин — 42 °С, 5 мин — 85 °С. Полученную комплементарную ДНК хранили при —20 °С.
ПЦР проводилась с помощью наборов: TaqMan MicroRNA Assays MiR21, TaqMan MicroRNA Assays MiR155 (Applied Biosystems, США) и iQTM Supermix (Bio-Rad, США). Пробы готовили по стандартному протоколу TaqMan MicroRNA Assays. Объем реакционной смеси составлял 25 мкл. Программа для проведения ПЦР в реальном времени: 1 цикл: 95 °С — 10 мин; 55 циклов: 95 °С — 15 с, 60 °С — 1 мин, измерение флуоресценции канала карбоксифлуоресцеина (Xmax поглощения составляло 490 нм). Все результаты анализировали с использованием программного обеспечения iQ5 Optical System Software, v. 2 (Bio-Rad, США).
Статистическая обработка данных. Эксперименты проводили в 3 независимых сериях опытов. Данные предоставляли в виде среднего значения 3 измерений со стандартной ошибкой среднего. Дополнительно выполняли корреляционный анализ, в котором вычисляли коэффициент детерминации (R2) — квадрат множественного коэффициента корреляции, отражающий долю вариации результативного признака и коэффициент корреляции. Коэффициент корреляции может принимать значения от 1 до —1, положительные свидетельствовали о том, что при изменении экспрессии одного из генов экспрессия другого изменяется пропорционально в ту же сторону. Чем больше значение коэффициента, тем выше вероятность такого синхронного изменения. Отрицательные значения коэффициента
Таблица 2. Последовательность использованных праймеров для проведения ПЦР в реальном времени
Название праймера Forward primer (5'-3') Reverse primer (5'-3')
SMAD2 TGTGTAAACCCTTACCACTATCAGAGA AGAGGCGGAAGTTCTGTTAGGAT
SMAD4 AAAACGGCCATCTTCAGCAC CATTGTGAACAGGCCAGTAATGTC
SMAD7 CGACTCTGCGAACTAGAGTCTCC ACAGCATCTGGACAGTCTGCA
ß-асйп GGCCGCGGTGTACGCCAACACAGTGCTC CCCGGGGCCGTCATACTCCTGCTTGCTG
говорили о разнонаправленности изменений. Все изменения считали статистически достоверными при значенияхр < 0,05.
Результаты и обсуждение
В настоящее время ЭМП рассматривается как возможный механизм, с помощью которого эпителиальные клетки опухоли приобретают более инвазивный фенотип и формируют метастатические ниши в организме. Молекулярные механизмы ЭМП включают несколько ключевых моментов: подавление экспрессии белков эпителиального фенотипа (Е-кадгерина, СК8, 18 и 19); увеличение экспрессии генов, ответственных за мезенхимальный фенотип эпителиоцитов (N-кадгерина, виментина, фибронектина, ZEB-1, ZEB-2, Slug, SNAIL1) [15]; усиление клеточной подвижности вследствие активации сигнальных путей, приводящих к реорганизации цитоскелета. Большой интерес для изучения молекулярных механизмов мета-стазирования вызывают трансформирующие факторы роста (TGF-a и TGF-P) — основные регуляторы морфологической и инвазивной фазы ЭМП. Нарушение TGF-pl/SMAD-сигнальной регуляции связано с неопластической трансформацией, метастазированием и прогрессией опухоли [7].
Известно, что TGF-P1 регулирует уровни экспрессии Е-кадгерина, который играет важную роль в ЭМП. Снижение экспрессии Е-кадгерина сопровождается прогрессированием опухолевого процесса, появлением метастазов [1, 6]. В семейство белков SMAD входит 8 факторов транскрипции, из них 5 являются рецеп-тор-регулируемыми (R-SMADs): SMAD1, SMAD2, SMAD3, SMAD5, SMAD9. TGF-p 1 связывается с рецепторами 1-го и 2-го типов, которые в свою очередь фосфорилируют R-SMADs: SMAD2 и SMAD3 [6], которые затем соединяются с общим SMAD4, и такой комплекс белков транслоцируется в ядро клетки [6], где они регулируют экспрессию специфичных генов через связывание участков промоутеров, взаимодействуют с факторами транскрипции.
Известно, что SMAD2 является медиатором клеточного сигнала от TGF-p 1 и поэтому регулирует множество клеточных процессов (клеточная пролиферация, апоптоз, дифференциация клеток) [7]. Тем не менее механизм, с помощью которого SMAD2, SMAD4 и SMAD7 вносят свой вклад в регулирование TGF-p 1/SMAD-сигнального пути при РМЖ, остается з в значительной степени неизученным.
В представленной работе была изучена экспрессия ^ мРНК семейства SMAD в 3 хорошо изученных (см. в табл. 1) линиях карцином молочной железы человека s c различным метастатическим потенциалом (MCF-7, я ZR-75-1, BT-474). Исследование экспрессии SMAD2, g SMAD4, SMAD7в клетках РМЖ выявило достоверные различия по содержанию мРНК. В исследуемых ли-
ниях клеток уровень экспрессии SMAD2 был выше, чем SMAD4 (табл. 3). Для линий с более высокой степенью злокачественности BT-474 и ZR-75-1 уровень экспрессии SMAD4 не различался, но был ниже, чем в линии MCF-7 (см. табл. 3). Гены SMAD2 и SMAD4 являются негативными регуляторами экспрессии некоторых онкогенов: p38, MAPK, ERK, PI3K, JNK, Rho [6, 8].
Белок SMAD7 необходим для конкурентного ингибирования фосфорилирования R-SMADs через рецепторный комплекс TpRI. SMAD7 связан с регуляцией TGF-p 1/SMAD-сигнального пути и ЭМП в опухолевых клетках [10], регулирует прогрессию, инвазию и метастазирование [5], ассоциирован с негативным прогнозом у больных РМЖ и рассматривается рядом авторов в качестве потенциального маркера [10]. В клетках линий BT-474 и ZR-75-1 уровни экспрессии SMAD7 статистически не различались между собой и были в 1,8 раза выше, чем в клетках MCF-7 (см. табл. 3). Увеличение экспрессии мРНК коррелирует со степенью злокачественности при прогрессии опухолевого роста [14].
В результате сравнения данных по уровню экспрессии мРНК стало ясно, что в опухолевых клетках РМЖ внутриклеточные механизмы регуляции SMAD2, SMAD4, SMAD7нарушены. Мы предположили, что эти нарушения регулируют микроРНК — miR-21 и miR-155, так как изменения в их функционировании непосредственно связаны с возникновением, прогрессией и метастазированием некоторых злокачественных опухолей. Так, известно, что нарушения в регуляции miR-21 приводят к трансформации нормальной клетки в опухолевую, в частности при РМЖ через PTEN, PCCD4, Spry1 или регуляцию протеинов, таких как Bcl-2, ZEB-1, EGF/HER-2, TGF-p [15, 16].
Анализ экспрессии микроРНК в опухолевых клетках линий MCF-7, ZR-75-1, BT-474 показал высокий уровень экспрессии miR-21 во всех исследуемых линиях. Уровень экспрессии miR-155 был значительно ниже уровня miR-21. Наибольшие уровни экспрессии miR-21 и miR-155 наблюдали в опухолевых клетках линии MCF-7 (см. табл. 3). Результаты ряда исследований показали, что экспрессия miR-21 изменяется в клетках опухоли [17] и является регулятором процессов, запускающих ЭМП в опухолевых клетках линии MCF-7 [18].
Различные процессы в клетке регулирует miR-155: апоптоз, дифференцировку, ангиогенез, пролиферацию, ЭМП. Экспрессия miR-155 коррелирует с экспрессией эстрогеновых и прогестероновых рецепторов [19]. Высокие уровни экспрессии miR-21 и miR-155 при РМЖ связаны с прогрессированием клеточной стадии опухоли, метастазированием в лимфоузлы и неблагоприятным прогнозом для пациента и могут
Таблица 3. Данные по уровню экспрессии SMAD2, SMAD4, SMAD7, шгК-21 и шгК-155 в клеточных линиях РМЖ
Линия клеток 8ИЛВ2 х 10-7, нг/мкл 8ИЛВ4 х 10-7, нг/мкл 8МЛЯ7 х 10-7, нг/мкл т'Ш-21, нг/мкл тШ-155 х 10-7, нг/мкл
MCF-7 57 ± 0,14 52 ± 2,88 0,093 ± 0,004 0,781 ± 0,0062 1,54 ± 0,0416
гЯ-75-1 123 ± 6,37 35,9 ± 4,58 0,17 ± 0,054 0,122 ± 0,0077 0,0265 ± 0,00108
В^474 89,5 ± 1,31 31,5 ± 2,25 0,15 ± 0,0022 0,342 ± 0,012 0,0539 ±_0,0028
являться кандидатами в прогностические маркеры метастазирования [11, 12].
МикроРНК взаимодействуют с мРНК путем ингибирования трансляции белка через сайты связывания на 3'-UTR или редуцирования экспрессии белка без изменения уровня мРНК. Более того, известно, что специфичные мРНК регулируются множеством микроРНК, обусловливая кумулятивный эффект [15]. Корреляционная связь мРНК SMAD2, SMAD4, SMAD7с шгЯ-21 и шгЯ-155 при РМЖ в настоящее время не изучена.
Следующей задачей настоящего исследования было оценить корреляцию изменений относительной экспрессии мРНК SMAD2, SMAD4, SMAD7 с микро-РНК ш1Я-21 и ш1Я-155 в образцах клеточных линий РМЖ. Полученные результаты статистической обработки приведены в табл. 4, 5.
Статистически значимая корреляционная связь между SMAD2, SMAD7и ш1Я-21 выявлялась в 3 клеточных линиях РМЖ (см. табл. 4), но в случае SMAD7/шiR-21 для менее метастатической клеточной линии MCF-7 наблюдали обратную корреляцию. Анализ показал отсутствие статистически значимой корреляции между показателями экспрессии мРНК SMAD4 и шiR-21 в клеточной линии MCF-7. Следует особо отметить, что для клеточной линии В^474 наблюдали обратную корреляцию между уровнями экспрессии SMAD2, SMAD4, SMAD7 и шiR-21 (см. табл. 4). Коэффициент детерминации свидетельствовал о том, что изменение экспрессии SMAD2 приводило к значительным изменениям экспрессии шiR-21 в линии клеток /Я-75-1 и В^474, тогда как в клеточной
линии MCF-7 коэффициент детерминации менялся незначительно (см. табл. 4). Значения коэффициентов детерминации между уровнями экспрессии SMAD4/шiR-21 для клеточной линии /Я-75-1 и SMAD7/шiR-21 для линий клеток MCF-7, /Я-75-1, В^474 превышали 50 % (см. табл. 4). Эти данные свидетельствовали о том, что шiR-21 в различной степени регулирует экспрессию SMAD2, SMAD4, SMAD7, блокируя на различных этапах работу этих генов, что способствует озлокачествлению опухолевой клетки. Полученные данные подтверждают важную роль шiR-21 в TGF-pl/SMAD-сигнальном пути и ЭМП, согласуясь с результатами работ, выполненных на других клеточных моделях [20].
Нашли высокую корреляцию между уровнями относительной экспрессии SMAD2, SMAD4, SMAD7 и шiR-155 в клеточной линии /Я-75-1 (см. табл. 5), что подтверждалось показателями коэффициентов детерминации между уровнями экспрессии этих генов в клетках /Я-75-1 (см. табл. 5). Более того, в клеточной линии /Я-75-1 была выявлена корреляция экспрессии мРНК SMAD2, SMAD4, SMAD7 как с шiR-155, так и с шiR-21, что свидетельствовало в данном случае о синергизме действия 2 микроРНК на один и тот же ген.
Для клеточной линии В^474, как и в случае с шiR-21, наблюдали обратную корреляцию между уровнями экспрессии SMAD2, SMAD4, SMAD7 и шiR-155. Значения коэффициентов детерминации в линии В^474 превышали 90 % между уровнями экспрессии SMAD4 /шiR-155 и 60 % в случае с экспрессией SMAD2/шiR-155 и SMAD7/шiR-155 (см. табл. 5). Следует отметить, что значения коэф-
Таблица 4. Коэффициенты корреляции и детерминации между SMAD2, SMAD4, SMAD7и шiR-21 в протоковъа карциномах клеточныхлиний РМЖ (р = 0,05)
Линия клеток г (8МЛВ2/ тШ-21) г (8МЛй4/ тШ-21) г ^МЛ37/ m¡R-21) Я2 (SMЛD2/ тШ-2Т) Я2 (SMЛD7/ тШ-21) Я2 ^МЛ34/ тШ-21)
MCF-7 0,56 —0,1 —0,76 0,31 0,57 0,009
гЯ-75-1 0,92 0,91 0,99 0,84 0,97 0,83
В^474 —0,98 —0,65 —0,98 0,96 0,95 0,42
Таблица 5. Коэффициенты детерминации и корреляции между SMAD2, SMAD4, SMAD7 и тгЯ-155 в протоковых карциномах клеточных линий РМЖ (р = 0,05)
Линия клеток r (SMAD2/ miR-155) r (SMAD4/ miR-155) r (SMAD7/ miR-155) R2 (SMAD2/ miR-155) R2 (SMAD4/ miR-155) R2 (SMAD7/ miR-155)
MCF-7 0,55 -0,98 0,45 0,30 0,96 0,201
ZR-75-1 1 0,87 1 0,99 0,75 0,99
BT-474 -0,77 -1 -0,79 0,6 0,99 0,62
фициентов детерминации между уровнями экспрессии SMAD2/miЯ-21 и SMAD2/miЯ-155; SMAD7/miЯ-21 и SMAD7/miЯ-155 превышали 60 % в линии ВТ-474 (см. табл. 4, 5), что свидетельствовало о групповой взаимосвязи экспрессии этих генов с miЯ-21 и miЯ-155 при РМЖ. В клеточной линии МСБ-7 значимая обратная корреляция наблюдалась между SMAD4 и miЯ-155 (см. табл. 5). Значение коэффициента детерминации свидетельствовало о том, что в 96 % случаев изменение экспрессии miЯ-155 приводит к изменению экспрессии SMAD4 в клетках МСБ-7 (см. табл. 5). В случае экспрессии miЯ-155 и SMAD7 в клетках МСБ-7 корреляция была незначительной. Эти результаты свидетельствовали о том, что miЯ-155 в различной степени влияет на экспрессию SMAD2, SMAD4, SMAD7, блокируя на различных этапах работу этих генов в ЭМП. Наши данные согласуются
с данными литературы, где показано влияние miЯ-155 на регуляцию гена SMAD4 в ЭМП на других клеточных линиях и тканях РМЖ [15, 21].
Заключение
В опухолевых клетках РМЖ внутриклеточные механизмы регуляции SMAD2, SMAD4, SMAD7 нарушены. SMAD2 является негативным регулятором метастатического потенциала опухолевых клеток, а SMAD7 коррелирует со степенью злокачественности при прогрессии опухолевого роста. Полученные результаты подтверждают участие miЯ-21 и miЯ-155 в регуляции TGF-pl/БМЛБ-сигнального пути через регуляцию белков БМЛБ. МикроРНК влияет на прогрессию и степень злокачественности опухоли, что было показано в протоковых карциномах 3 клеточных линий РМЖ с различным метастатическим потенциалом.
ЛИТЕРАТУРА
1. Greenlee R.T., Murray T., Bolden S., Wingo P.A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin 2000;50(1):7-33.
2. Zavadil J., Haley J., Kalluri R. et al. Epithelial-mesenchymal transition. Cancer Res 2008;68(23):9574-7.
3. Serlie T., Perou C.M., Tibshirani R. et al. Gene expression patterns of breast carcinomasdistinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc Natl Acad Sci USA 2001;98(18):10869-74.
4. Rysman E., Brusselmans K., Scheys K. et al. De novo lipogenesis protects cancer cells from free radicals and chemotherapeutics
by promoting membrane lipid saturation. Cancer Res 2010;70(20):8117-26.
5. Hugo H., Ackland M.L., Blick T. et al. œ Epithelial-mesenchymal and mesenchymal-
epithelial transitions in carcinoma progression. o J Cell Physiol 2007;213(2):374-83. c 6. Petersen M., Pardali E., van der Horst G. ° et al. Smad2 and Smad3 have opposing roles S in breast cancer bone metastasis by differentially S affecting tumor angiogenesis. Oncogene « 2010;29(9):1351-61. E 7. Pardali K., Moustakas A. Actions of TGF-beta as tumor suppressor and pro-metastatic
factor in human cancer. Biochim Biophys Acta 2007;1775(1):21-62.
8. Tang J., Ahmad A., Sarkar F.H. et al. The role of microRNAs in breast cancer migration, invasion and metastasis. Int J Mol Sci 2012;13(10):13414-37.
9. Sundqvist A., Ten Dijke P., van Dam H. et al. Key signaling nodes in mammary gland development and cancer: Smad signal integration in epithelial cell plasticity. Breast Cancer Res 2012;14(1):204.
10. Wu Y., Zhou B.P. New insights of epithelial-mesenchymal transition in cancer metastasis. Acta Biochim Biophys Sin 2008;40(7):643-50.
11. Sun Y., Wang M., Lin G. et al. Serum microRNA-155 as a potential biomarker to track disease in breast cancer. PLoS One 2012;7(10):e47003.
12. Yan L.X., Huang X.F., Shao Q. et al. MicroRNA miR-21 overexpression in human breast cancer is associated with advanced clinical stage, lymph node metastasis
and patient poor prognosis. RNA 2008;14(11):2348-60.
13. Zheng S.R. Clinical significance of miR-155 expression in breast cancer and effects
of miR-155 ASO on cell viability and apoptosis. Oncol Rep 2012;27(4):1149-55.
14. Stolfi C., Marafini I., De Simone et al. The dual role of Smad7 in the control
of cancer growth and metastasis. Int J Mol Sci 2013;14(12):23774-90.
15. Aigner A. MicroRNAs (miRNAs)
in cancer invasion and metastasis: therapeutic approaches based on metastasis-related miRNAs. J Mol Med (Berl) 2011;89(5): 445-57.
16. Chen L., Li Y., Fu Y. et al. Role
of deregulated microRNAs in breast cancer progression using FFPE tissue. PLoS One 2013;8(1):e54213.
17. Zhu S., Wu H., Wu F. et al. MicroRNA-21 targets tumor suppressor genes in invasion and metastasis. Cell Res 2008;18(3):350-9.
18. Han M., Liu M., Wang Y. et al. Reexpression of miR-21 contributes to migration and invasion by inducing epithelial-mesenchymal transition consistent with cancer stem cell characteristics in MCF-7 cells. Mol Cell Biochem 2012;363(1-2):427-36.
19. Lu Z., Ye Y., Jiao D. et al. miR-155 and miR-31 are differentially expressed in breast cancer patients and are correlated with the
estrogen receptor and progesterone receptor status. Oncol Lett 2012;4(5):1027-32
20. Li Q., Zhang D., Wang Y. et al. MiR-21/ Smad7 signaling determines TGF-p1-induced CAF formation. Sci Rep 2013;3:2038.
21. Kong W., Yang H., He L. et al. MicroRNA-155 is regulated by the transforming growth factor beta/Smad pathway and contributes to epithelial cell plasticity
by targeting RhoA. Mol Cell Biol 2008;28:6773-84.
22. Subik K., Lee J.F., Baxter L. et al.
The expression patterns of ER, PR, HER-2, CK5/6, EGFR, Ki-67 and AR by immuno-histochemical analysis in breast cancer cell lines. Breast Cancer (Auckl) 2010;4:35-41.
23. Liang Y., Benakanakere I., Besch-Wlliford C. et al. Synthetic progestins induce growth and
metastasis of BT-474 human breast cancer xenografts in nude mice. Menopause 2010;17(5):1040-7.
24. http://www.lgcstandards-atcc.org/.
25. Lattrich C., Stegerer A., Haring J. et al. Estrogen receptor p agonists affect growth and gene expression of human breast cancer cell lines. Steroids 2013;78(2):
195-202.
Авторы статьи «Протеомные исследования, направленные на поиск маркеров рака молочной железы» (журнал а «Опухоли женской репродуктивной системы» № 2 за 2015 г.) М.А. Таипов, З.Н. Никифорова и В.Е. Шевченко и редакция журнала приносят извинения С.Н. Тамкович, В.Е. Войцицкому, П.П. Лактионову, результаты труда кото- ^ рых были заимствованы из ранее опубликованной статьи «Современные методы диагностики рака молочной железы» в («Биомедицинская химия» № 4 (60) за 2014 г., с. 141—160).
Статьи М.А. Таипова впредь в журнале «Опухоли женской репродуктивной системы» публиковаться не будут. Просим читателей не использовать материалы статьи М.А. Таипова и соавт. «Протеомные исследования, направ- £ ленные на поиск маркеров рака молочной железы», а также не ссылаться на нее.
