CC BY
178
УДК / UDC 582.282.12357.083.138.4:546.26
ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАВИСИМОСТИ АНТАГОНИСТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ГРИБОВ РОДА TRICHODERMA SPP. ОТ КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ ИСТОЧНИКА УГЛЕРОДА В ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ
INVESTIGATION OF THE DEPENDENCE OF THE ANTAGONISTIC ACTIVITY OF TRICHODERMA SPP. ON THE QUANTITATIVE CONTENT OF CARBON SOURCE
IN THE NUTRIENT MEDIUM
Полякова М.А.*, соискатель Polyakova M.A., Applicant Ревкова Е.В., старший преподаватель кафедры иностранных языков
Revkova E.V., Senior Teacher of the Foreign Languages Department ФГБОУ ВО «Орловский государственный аграрный университет
имени Н.В. Парахина» Орёл, Россия Federal State Budgetary Educational Establishment of Higher Education "Orel State Agrarian University named after N.V. Parakhin", Orel, Russia *E-mail: morskaya marina @mail.ru
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА
антагонизм, фунгицидные свойства, Trichoderma virens, Trichoderma harzianum, микофильные грибы, Fusarium oxysporum, вторичные метаболиты.
KEY WORDS
antagonism, antifungal activity of Trichoderma virens, Trichoderma harzianum, mycophilia fungi, Fusarium oxysporum, secondary metabolites.
Введение. В настоящее время многообещающей альтернативой химическому методу защиты растений от болезней, вызванными фитопатогенными грибами, является использование микроорганизмов, выступающих в качестве естественных антагонистов возбудителей болезней и продуцентов антибиотических веществ с фунгицидными свойствами.
В связи с длительным применением в сельском хозяйстве синтетических органических фунгицидов наблюдается тенденция к уничтожению полезной почвенной микрофлоры и, как следствие, массовые заселения почв фитопатогенными грибами и снижение плодородия почв [4, 11]. Исходя из этого, в последнее время все больше внимания уделяется созданию биологических средств защиты растений от вредителей и болезней [5, 12].
В данном исследовании внимание направлено на микофильные грибы рода Trichoderma как наиболее перспективных продуцентов антибиотических веществ с фунгицидным спектром действия [8, 14]. Гриб-антагонист является одним из универсальных и эффективных агентов биологического регулирования болезней увядания и корневых гнилей многих культур, располагает рядом механизмов, дающих возможность подавлять развитие возбудителей семенной, корневой и почвенной инфекции, а также болезней плодов и листьев [2, 3, 9].
Известно, что микромицеты рода Trichoderma spp. выделяют различные метаболиты: факторы роста (ауксины, цитокины и этилен), органические кислоты, внутриклеточные аминокислоты, витамины и свыше 100 антибиотиков. Каждый вид характеризуется специфичным набором метаболитов [1, 6, 10]. При выборе агента биоконтроля для создания средств защиты растений помимо селекции исходных штаммов микроорганизма и их метаболитов на способность синтезировать ферменты или токсины, вирулентность, продуктивность,
фитокомпетентность, очень важным является подбор оптимальной питательной среды для культивирования биологических агентов [8]. Состав питательной среды влияет на метаболизм микроорганизмов, приводя к синтезу различных соединений. В комплексе они могут действовать как положительно, так и отрицательно на развитие растений [13].
Целью данной работы являлось исследование влияния качественного и количественного состава источника углерода в питательной среде на антагонистические свойства грибов рода Trichoderma.
Условия, материалы и методы. В качестве объектов исследования были использованы штаммы микромицета Trichoderma virens, Trichoderma harzianum и культура фитопатогена Fusarium oxysporum, как наиболее распространенный вид возбудителей болезней базовых сельскохозяйственных культур в Орловской области.
Для подбора оптимального источника углерода в качестве компонента питательной среды был выбран метод совместного взаимодействия метаболитов Trichoderma spp. с культуральной жидкостью Fusarium oxysporum на микропланшетах в фотометре при 620 нм, контролем служила питательная среда. Данная технология значительно сократила время подбора оптимальной питательной среды и позволила одновременно анализировать по две модифицированные среды в одном планшете [7]. Культуру грибов выращивали при комнатной температуре и внешнем освещении, без прямых солнечных лучей в 100 мл колбах со средой Чапека в течение 5 дней без встряхивания. Затем биомассу фильтровали в асептических условиях, центрифугировали при 6000 тыс. оборотах в течение 10 мин для осаждения оставшихся спор. Затем фильтровали через 0,2 Мм стерильный ацетатный фильтр.
Аликвоты финальной культуры использовали в исследовании. Конидии Fusarium oxysporum были получены выращиванием в среде Чапека на агаре в течение 7 суток при комнатной температуре и внешнем освещении. Конидии собирали путем прокатки стерильных ватных тампонов по поверхности чашки Петри и переносили в стерильный среду Чапека. Концентрация спор - 0,5 мР.
Контроль роста мицелия проводили на микропланшетах в фотометре при 620 нм каждые 24 часа.
Результаты и обсуждение. Результат активности роста мицелия Fusarium oxysporum при искусственном совместном взаимодействии метаболитов Trichoderma spp. с культуральной жидкостью Fusarium oxysporum представлен в таблице 1.
Таблица 1 - Результат активности роста мицелия Fusarium oxysporum при искусственном совместном взаимодействии метаболитов Trichoderma spp. с КЖ Fusarium oxysporum_
Trichoderma harzianum Trichoderma virens
Время экспозиции Глицерин Крахмал Сахароза Глюкоза Глицерин Крахмал Сахароза Глюкоза Контроль
0 сутки 0,002 0,003 0,001 0,003 0,003 0,001 0,005 0,003 0,003
1 сутки 0,016 0,017 0,014 0,011 0,009 0,013 0,008 0,013 0,013
2 сутки 0,045 0,041 0,026 0,047 0,030 0,032 0,022 0,037 0,021
Таким образом, исследование показало, что использование сахарозы в качестве компонента питательной среды в глубинном культивировании микромицетов Trichoderma spp. ингибирует рост и развитие фитопатогена. Также выявлено, что эффективным агентом являются метаболиты Trichoderma virens.
Для дальнейшего изучения влияния различных концентраций сахарозы в качестве источника углерода на антагонистические свойства Trichoderma spp. были выбраны метаболиты Trichoderma virens. Культивирование микромицета проводили на модифицированной среде Чапека трех типов: с содержанием сахарозы 50%, 75%, 100%. Для получения этилацетатного экстракта вторичных метаболитов были использованы посевные инокуляты 5-дневной и 10-дневной культуры. Для приготовления инокулюма фитопатогена чистую суточную культуру Fusarium oxysporum, выросшую на твердой (агаровой) среде Чапека, помещали в пробирку со стерильным физиологическим раствором. Далее все суспензии микроорганизмов стандартизировали по показателю мутности 0,5 по Мак-Фарланду, что соответствует концентрации 1,5 х 108 КОЕ/мл. Затем, предварительно полученные методом серийных разведений рабочие растворы наносили на предметные стекла в объемах 10 мкл и 50 мкл для вторичных метаболитов Trichoderma virens и 50 мкл для фитопатогена Fusarium oxysporum и помещали их в чашки Петри. Через 24 часа препарат фиксировали для дальнейшего микроскопирования и оценки результата.
Антагонистические свойства оценивали по прорастанию конидий Fusarium oxysporum и формированию его мицелия. Результаты микроскопирования представлены в таблице 2, 3.
Таблица 2 - Результаты культивирования фитопатогена Fusarium oxysporum с метаболитами Trichoderma virens в объёме 10 мкл
Содержание сахарозы в среде Чапека для глубинного культивирования гриба, % от нормы Совместное культивирование Fusarium oxysporum с метаболитами, выделенным из 5-сут. культуры гриба Trichoderma virens
10 мкл
0 день Через 24 часа
50 ' ' ¿с, £ с' v" . X 0 ■ 44\NL
75 — —
100 ■
Таблица 3 - Результаты культивирования фитопатогена Fusarium oxysporum с метаболитами Trichoderma virens в объёме 10 мкл
Содержание сахарозы в среде Чапека для глубинного культивирования гриба, % от нормы Совместное культивирование Фузариум с метаболитами, выделенным из 5-сут. культуры гриба Триходерма
50 мкл
0 день Через 24 часа
50 Wrk !Ü
75 4 о • - \ 'V ff '. : " • / о . ' • - /Ä. * ■ • ' f¡ UV» < - * • .p- • .....i-1• '<иь 1ЧШ í
100
Выводы. Полученные данные позволяют сделать вывод об обратной зависимости антагонистической активности Trichoderma virens от количественного содержания углерода в модифицированной среде Чапека. Чем меньше количество сахарозы в среде при культивировании, тем антагонистические свойства микромицета Trichoderma virens в отношении Fusarium oxysporum были более выражены. Вместе с тем, 10-дневная посевная культура Trichoderma virens также обладала более сильной антагонистической активностью в отношении фитопатогена Fusarium oxysporum по сравнению с 5-дневной культурой. Эти результаты могут быть использованы для подбора оптимальных условий культивирования грибов рода Trichoderma с целью получения максимальной антагонистической активности в отношении фитопатогенов и для дальнейшей разработки средств биоконтроля.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Trichoderma secondary metabolites that affect plant metabolism / F. Vinale et all. // Nat Prod Commun. 2012. Vol. 11. № 7. P. 50-52.
2. Biotechnology and Biology of Trichoderma / V.G. Gupta, M. Schmoll, A. Herrera-Estrella et all. Elsevier, 2014. 650 p.
3. Алимова Ф.К., Тазетдинова Д.И., Тухбатова Р.И. Промышленное применение грибов рода Trichoderma: учеб. пособие. Казань: УНИПРЕСС ДАС, 2007. 234 с.
4. Буракаева А.Д. Микофильные грибы в биотехнологии фунгицидных препаратов // Вестник Оренбургского государственного университета. 2014. № 6. С. 98-103.
5. Гнеушева И.А., Павловская Н.Е., Яковлева И.В. Биологическая активность грибов рода Trichoderma и их промышленное применение // Вестник ОрелГАУ. 2010. № 3 (24). С.36-39.
6. Огарков Б.Н. Mycota - основа многих биотехнологий. Иркутск: Время странствий, 2011. 207 с.
7. МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания. 2012. 19 с.
8. Влияние вторичных метаболитов грибов рода Trichoderma на посевные качества семян гороха / Н.Е. Павловская, И.А. Гнеушева, И.Ю. Солохина, И.В. Яковлева // Сельскохозяйственная биология. 2012. № 3. С 114-116.
9. Садыкова В.С. Экология грибов рода Trichoderma бассейна реки Енисей, их биологические свойства и практическое использование: автореф. дис. ... докт. биол. наук. Москва, 2012. 46 с.
10. Сейкетов Г.Ш. Грибы рода Trichoderma и их использование в практике. Алма-Ата: Наука, 2011. 245 с.
11. Сидоров А.А. Эколого-биологические основы патогенеза злаковых культур при поражении возбудителями корневых гнилей. М.: Общество фитопатологов, 2013. 182 с.
12. Хоанг Л.Т. Биологическая активность жидкого препарата Trichoderma в опытах in vivo и in vitro // Фундаментальные исследования. 2011. № 11-2. С. 415-419.
13. Чхенкели В.А. Некоторые аспекты медико-биологических исследований высших дереворазрушающих базидиомицетов как источника биологически активных веществ // Сиб. мед. журнал. 2011. № 1. С. 59-65.
14. Штерншис М.В. Тенденции развития биотехнологии микробных средств защиты растений в России // Вестник Томского государственного университета. 2012. № 2. С. 92-100.
