CC BY
896
УДК 57.083.13
Д. Д. Зиганшин, А. С. Сироткин ОСОБЕННОСТИ ГЛУБИННОГО И ПОВЕРХНОСТНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГРИБОВ TRICHODERMA ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ КЛЕТОК ГРИБА
Ключевые слова: Trichoderma, культивирование, биопрепарат.
На основе литературных данных охарактеризованы особенности глубинного и поверхностного культивирования грибов рода Trichoderma с целью получения биопрепаратов для растениеводства. Обсуждена необходимость учета видо- и штаммоспецифичности культур р. Trichoderma для их эффективного культивирования на питательных средах разного состава в различных физико-химических условиях среды.
Keywords: Trichoderma, cultivation, biological product.
Based on the literature data the features of submerged and surface cultivation of Trichoderma fungi with the purpose of obtaining biologics for plant growing are characterized. The necessity to take into account the species and strain specificity of the Trichoderma spp. for their effective cultivation on nutrient media of different composition in different physicochemical conditions of the medium was discussed.
Введение
Грибы рода Trichoderma - это широкая группа микроорганизмов, играющая важную роль в природе. Представители рода были найдены во всех климатических зонах. Наиболее часто они встречаются в почве и на мертвой древесине [1].
Грибы рода Trichoderma обладают целлюлозолитической и хитинолитической активностью, поэтому их часто используют для получения ферментов, разрушающих целлюлозу, лигнин, хитин и пектин [2]. Также их часто используют при производстве кормового белка и некоторых биологически активных веществ, в том числе антибиотиков и токсинов [3,4].
Способность разрушать хлорорганические вещества и различные пестициды, гербициды и инсектициды, а также полиэтилен и некоторые пластмассы открывают возможность для использования в процессах биологической очистки загрязненных почв и в переработке отходов [5].
Антагонистическая активность грибов рода Trichoderma по отношению ко многим фитопатогенам, обусловливает их применение в качестве биофунгицидов [6,7]. Также была отмечена рострегулирующая активность, способствующая интенсификации поглощения растением микро- и макроэлементов, стимулирование развития на корнях азотфиксирующих бактерий, что позитивно влияет на рост многих культурных растений [8].
Все вышесказанное свидетельствует о большой ценности грибов рода Trichoderma как объекта исследования биотехнологии.
В связи с этим, целью настоящей статьи было обобщение информации об особенностях глубинного и поверхностного культивирования грибов рода Trichoderma с целью получения биопрепарата на основе клеток гриба.
1 Глубинное культивирование 1.1 Источники углерода
Одним из основных элементов, влияющих на рост и развитие не только грибов, но и всех живых существ является, безусловно, углерод.
Исследователями по всему миру было проведено множество экспериментов по определению влияния различных источников углерода на рост грибов рода Trichoderma.
При их изучении как продуцентов целлюлолитических ферментов было выявлено, что скорость роста и развития при использовании в качестве источника углерода глюкозы, фруктозы, сахарозы и крахмала была одинаково высокой и стабильной. Значительное снижение роста наблюдалось при использовании лактозы, карбоксиметилцеллюлозы, целлюлозы [9].
Согласно другим исследованиям [10], в вопросе выбора источника углерода имеет место видо- и штаммоспецифичность. Среди веществ, которые усваиваются на порядок хуже глюкозы как эталона, всеми или большинством изученными в статье видами, можно назвать: L- и D- арабиноза, мальтоза, лактоза, D-мелизитоза, этанол, инозитол, D-глюкозоамин, растворимый крахмал, инулин, салицин. В качестве источников углерода, которые для большинства изученных видов показывают аналогичную или лучшую усвояемость в сравнении с глюкозой, следует отметить D-фруктозу, D-маннозу, D-галактозу, D-ксилозу, декстрин. Замечено, что в то время, как сахароза и глицерин некоторыми видами усваивались лучше, чем глюкоза, другие виды на них практически не росли.
1.2 Источники азота
Важным элементом питания является азот. Некоторые авторы утверждают [10], что для роста Trichoderma на буферизованных средах с рН 4,2-4,3 в качестве источника азота подходят L-аланин, L-аспарагиновая кислота, L-глутаминовая кислота. В то же время D-аспаргиновая кислота, L-гистидин и Р-аланин являлись бедными источниками азота. Нитрит натрия оказывал токсическое действие на культуру, о чем свидетельствовало отсутствие роста на соответствующих средах. Отмечен лучший рост микромицетов на средах, содержащих ионы аммония, чем на средах, содержащих нитраты. Считается [10], что в качестве неорганического
источника азота предпочтительней применять нитрат аммония (аммиачную селитру).
Согласно данным других авторов [11], при сравнении в качестве источника азота нитрата калия, нитрата натрия и сульфата аммония, наибольший выход биомассы был получен при использовании сульфата аммония (25,6 г/л), а наименьший - при использовании нитрата натрия (22,2 г/л).
1.3 Физико-химические факторы среды
Одним из важных факторов, определяющих нормальный рост триходермы и ее биосинтетические возможности, является реакция среды. При ее изменении в область неблагоприятных значений организм перестает расти даже в тех случаях, если все остальные условия являются оптимальными. При исследовании оптимальной кислотности среды было установлено [12], что, в зависимости от вида, максимальный рост грибов наблюдается при рН в пределах от 3,7 до 4,7.
Изменение рН среды влияет на накопление конечных продуктов обмена веществ триходермы в культуральной жидкости.
Немаловажным фактором, оказывающим воздействие на рост культуры, является температура культивирования. Согласно [12] для различных видов р. Trichoderma оптимальная температура роста отличается и лежит в пределах от 22 до 34 °С.
Грибы рода Trichoderma являются аэробами, поэтому для них особенно важен режим аэрации. Так, при культивировании в колбах Эрленмейера необходимо, чтобы объем питательной среды не превышал 20% от объема колбы. Оптимальная скорость перемешивания составляет 150 об/мин [13].
1.4 Спорообразование
Выше были рассмотрены условия для накопления максимальной биомассы в ходе культивирования. Однако, для получения культуральной жидкости, которую можно было бы использовать в качестве биопрепарата-пестицида, после максимального накопления биомассы грибом необходимо индуцировать процесс образования конидий и/или хламидоспор, совмещенный с автолизом мицелия, и добиваться максимального конидиеобразования [14].
Есть несколько факторов, способствующих индукции процесса спорообразования у грибов рода Trichoderma:
- минеральные элементы питания. Выявлено, что ионы Са2+ способствуют активации процесса спорообразования у Trichoderma viride [15];
- освещение. Доказано [16], что освещение способствует активному конидиеобразованию у грибов рода Trichoderma. При этом оптимальным является освещение синего цвета и область ближнего ультрафиолета. Согласно некоторым исследованиям [17], большое значение имеет также режим освещения. При чередовании световой и
темновой фазы культивирования каждые 12 часов наблюдается самое интенсивное
конидиеобразование. Кроме того, проводились исследования, показавшие, что эффективным может быть кратковременное отключение подачи воздуха в ферментер с одновременным отключением света [18];
- соотношение углерода и азота в составе питательной среды. Так, была выявлена зависимость между конидиеобразованием и соотношением С^ [19, 20]. Для сахарозы в концентрации 6 г/л максимальное конидиеобразование наблюдалось при соотношении 160:1. Показано, что более высокие концентрации источника углерода, а также меньшая разница в соотношении С^ для Trichoderma viride увеличивает выход мицелия, а не конидий [21]. Это наблюдение подтверждают результаты исследований [22,23] о том, что внезапное исчезновение в среде азота стимулирует конидиеобразование у T. аtroviride.
Методом глубинного культивирования получают, в частности, следующие биопрепараты р. Trichoderma:
- Лигнорин, разработанный на основе почвенной культуры Trichoderma harzianum S-4. Препарат подвергается лиофильной сушке и выпускается в виде сухого порошка с титром конидий не менее 5х109 КОЕ/г [24];
- Оргамика Ф - биофунгицид, защищающий растения от грибных и бактериальных заболеваний. В основе - конидии природного штамма Trichoderma asperellum OPF-19, обладающего широким спектром антагонистической активности. Наиболее выраженное действие отмечено на фитопатогенных грибах (корневые гнили, снежная плесень, мучнистая роса и др.). Препарат представляет собой жидкую суспензию конидий гриба в культуральной жидкости, содержащей остатки питательной среды и продукты метаболизма штамма T. asperellum OPF-19 с титром конидий не менее 108 КОЕ/мл [25].
После анализа и обобщения данных по глубинному культивированию грибов рода Trichoderma с целью получения биопрепарата на основе клеток гриба можно отметить следующие характеристики процесса:
- продолжительность культивирования составляет от 4 до 7 сут [10,13];
- выход биомассы в зависимости от питательной среды и используемого вида может составлять от 3 до 48 г/л [10, 26];
- максимальный титр конидий находится в пределах 1х108 - 7х109 КОЕ/мл [27].
2 Поверхностное культивирование
Помимо глубинного культивирования для получения биопрепаратов на основе грибов рода Trichoderma применяют поверхностный метод культивирования. При культивировании поверхностным способом грибы выращивают на поверхности плотной, сыпучей среды или в тонком слое жидкой среды, при этом микроорганизмы получают кислород непосредственно из газовой
воздушной фазы. При подборе питательной среды для поверхностного твердофазного
культивирования стараются использовать комплексные натуральные питательные среды, имеющие в своем составе как источник углерода, так и источник азота.
В исследованиях, проведенных российскими учеными, в качестве источника питания, чаще всего, используются отходы лесоперерабатывающей и сельскохозяйственной промышленности. Так, авторами были показаны возможность использования в качестве субстрата для поверхностного культивирования коры и древесной зелени пихты [28], коры лиственницы [29], вегетативной части топинамбура [30].
Зарубежными исследователями в качестве субстрата применяются кукурузные и пшеничные отруби [31], отходы переработки манго [32] и агавы [33].
При поверхностном твердофазном
культивировании преимущественно используются Trichoderma asperellum, T. viride, T.harzianum, T. ^п^И, что связано с тем, что изоляты именно этих видов чаще всего встречаются в гниющей древесине и ризосфере деревьев [34].
Следует отметить следующие особенности поверхностного культивирования грибов рода Trichoderma:
1. Титр конидий в среднем на порядок выше при поверхностном культивировании в сравнении с глубинным. Однако, время культивирования увеличивается в 2-3 раза. Увеличение продолжительности ферментации объясняется особенностями массопереноса при твердофазном культивировании, который значительно более затрудненный в этом случае, чем при жидкофазном.
2. При твердофазном культивировании особую роль начинает играть достаточная влажность субстрата. Так, в работе [31] показано, что изменение влажности на 5-10% от оптимальной является причиной уменьшения титра конидий в 510 раз.
Основными характеристиками поверхностного культивирования грибов рода Trichoderma с целью получения биопрепарата на основе клеток гриба являются следующие:
- максимальный титр конидий находится в пределах 1х108 - 1х1010 КОЕ/г [10, 31];
- продолжительность культивирования варьируется в зависимости от вида продуцента и составляет от 7 до 15 суток [31, 32, 35].
Примерами биопрепаратов, полученных методом поверхностного культивирования, являются, в частности:
- Стернифаг - биологический фунгицид на основе гриба Trichoderma harzianum, разработанный с целью ускорения разложения стерни и соломы злаковых, растительных остатков сои, сорго, кукурузы, подсолнечника и подавления фитопатогенов на растительных остатках и в почве.
Данный препарат имеет титр конидий 1010 КОЕ/г [6];
- Триходермин, действующим веществом которого являются споры и мицелий гриба-антагониста Trichoderma lignorum T 13-82, культивируемый на сыпучем зерновом субстрате, а также продуцируемые культурой гриба в процессе производственного культивирования биологически активные вещества. Данный препарат имеет титр конидий 6х109 КОЕ/мл [24];
- Глиокладин - грибная культура Trichoderma harzianum ВИЗР-18, используемая в качестве лечебного и профилактического средства при внесении в почву, эффективно подавляет возбудителей грибных заболеваний на всех видах садовых культур и комнатных растениях [6].
Заключение
На основании вышесказанного можно сделать следующие выводы:
1. Грибы рода Trichoderma являются ценным объектом биотехнологий благодаря широкой гамме возможных применений, в частности, на их основе перспективным является получение многоцелевых биопрепаратов для растениеводства.
2. Из-за высокой видо- и штаммоспецифичности грибов рода Trichoderma выбор культуры, корректировка и оптимизация состава питательных сред, а также физико-химических условий среды является ключевыми аспектами исследований для дальнейшего эффективного использования в составе биопрепаратов.
Литература
1. Druzhinina I.S., Kopchinsky A.G., Kubicek C.P. The first 100 Trichoderma species characterized by molecular data // Mycoscience. - 2006. - Vol.47 (2). - pp.55-64.
2. Archer, D. B. & Peberdy, J. F. The molecular biology of secreted enzyme production by fungi // Crit Rev Biotechnol. - 1997. - Vol.17. - pp.273-306.
3. Samuels G.J. Trichoderma: a review of biology and systematics of the genus. // Mycol. Res. - 1996. - Vol.100 (8). - pp.923-935.
4. Ghisalberti, E.L. and Sivasithamparam, K. Antifungal antibiotics produced by Trichoderma spp. // Soil Biol Biochem. - 1991. - Vol.23. - pp.1011-1020.
5. Esposito, E., & da Silva, M. Systematics and environmental application of the genus Trichoderma // Critical Reviews on Microbiology. - 1998. - Vol.24. -pp.89-98.
6. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации // Москва: Министерство сельского хозяйства РФ, 2017.
7. Д.Д. Зиганшин, М.А. Лукьянцев, А.А. Егоршина, А.С. Сироткин Оценка способности консорциума микроорганизмов к утилизации стерни. / Вестник Казанского технологического университета. 2016, т. 19, в.16, с.103-107.
8. Molla A.H., Haque Md. M., Haque Md. A., Ilias G. N. M. Effect of nitrogen fertilizers and Trichoderma harzianum on Sclerotium rolfsii. // Agronomie. - 2004. - Vol.24. -pp.281-288.
9. Serrano V. Cellulase production by Trichoderma reesei // Europ. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1983. - Vol. 18.-pp. 29-37.
10. Danielson R. M. and Davey C. B. Carbon and nitrogen nutrition of Trichoderma // SeSoil Bid. Biochem. - 1973. -Vol. 5, pp. 505-515.
11. Mehta J., and etc. Impact of Carbon & Nitrogen Sources on the Trichoderma viride (Biofungicide) and Beauveria bassiana (entomopathogenic fungi) // European Journal of Experimental Biology. - 2012. - Vol.2 (6). - pp.2061-2067.
12. Danielson R. M. and Davey C. B. Non nutritional factors affecting the growth of Trichoderma in culture // Soil Biology and Biochemistry. -1973. - Vol. 5(5). - pp. 495504.
13. Singh A. and etc. Optimal Physical Parameters for Growth of Trichoderma Species at Varying pH, Temperature and Agitation // Virology and Mycology. Volume 3, 2014.
14. Влияние различных источников углерода на конидиеобразование микромицета Trichoderma asperellum OPF-19 в условиях глубинного культивирования. / Зиганшин Д.Д., и др. // Материалы международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» 20-22 февраля 2017 г. (2017), 2, 115-117.
15. Krystofova S., Varecka Е. and Betina V. The 45Ca 2+ Uptake by Trichoderma viride Mycelium. Correlation with Growth and Conidiation // Gen. Physiol. Biophys. - 1995. -Vol.14. - pp.323-337.
16. Schmoll M., Esquivel-Naranjo E. U., and Herrera-Estrellab A. Trichoderma in the light of day - Physiology and development // Fungal Genet Biol. - 2010. - Vol.47(11-2). - pp.909-916.
17. Steyaert J. M. and etc. Reproduction without sex: conidiation in the filamentous fungus Trichoderma // Microbiology. - 2010. - Vol.156. - pp.2887-2900.
18. Gressel J., Bar-lev S., & Galun E.. Blue light-induced response in absence of free oxygen // Plant and Cell Physiology. - 1975. - Vol.16. - pp.367- 370.
19. Aube, C. & Gagnon, C. Effect of carbon and nitrogen nutrition on growth and sporulation of Trichoderma viride Pers Ex Fries. Can J // Microbiol. - 1969. - Vol.15. -pp.703-706.
20. Jackson, A. M., Whipps, J. M. & Lynch, J. M. Nutritional studies of four fungi with disease biocontrol potential // Enzyme Microb Technol. 1991. - Vol.13. - pp.456-461.
21. Gao, L., Sun, M. H., Liu, X. Z. & Che, Y. S. Effects of carbon concentration and carbon to nitrogen ratio on the growth and sporulation of several biocontrol fungi // Mycol Res. -2007. - Vol.111. - pp.87-92.
22. Casas-Flores, S. and etc. Cross talk between a fungal blue-light perception system and the cyclic AMP signaling pathway// Eukaryot Cell. - 2006. - Vol.5. - pp.499-506.
23. Steyaert, J. M., Weld, R. J. & Stewart, A. Isolate-specific conidiation in Trichoderma in response to different nitrogen sources // Fungal Biol. - 2010. - Vol.114. - pp. 179-188.
24. Войтка Д.В. Повышение активности биопрепаратов на основе грибов-антагонистов Trichoderma spp // Современная микология в России. Том 2. Тезисы докладов Второго съезда микологов России. Национальная академия микологии, 2008. - 528с.
25. И.М. Давлетбаев Биологические препараты для растениеводства // XV Международная конференция молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (г. Казань, 13-14 апреля 2016 г.). Сборник материалов конференции. - Казань: Издательство «БРИГ», 2016. - 476 с.
26. Harman G. E. and etc. Production of Conidial Biomass of Trichoderma harzianum for Biological Control // Biological control. - 1991. - Vol.1. - pp.23-28.
27. Lewis J.A., Papavizas G.C. Production of chlamydospores and conidia by Trichoderma spp in liquid and solid growth media // Soil Biology and Biochemistry. - 1983. - Vol.15. -pp.351-357.
28. Проблемы применения растительных отходов для получения биологических препаратов защиты растений Ю.А. Литовка и др. // Химия растительного сырья. 2011. №3. С. 167-172
29. Рязанова Т.В., Чупрова Н.А., Лунева Т.А. Воздействие гриба рода Trichoderma на лигнин коры хвойных пород / Катализ в промышленности. 2014. № 6. С. 64-70.
30. Пикозина М.А., Чупрова Н.А., Рязанова Т.В. Культивирование грибов рода Trichoderma на вегетативной части топинамбура // Химия растительного сырья. 2013. №1.
31. Rosane S. Cavalcante and etc. Effect of Moisture on Trichoderma Conidia Production on Corn and Wheat Bran by Solid State Fermentation // Food Bioprocess Technol. -2008. - Vol.1. - pp.100-104.
32. S. de los Santos-Villalobos Production of Trichoderma asperellum T8a spores by a "home-made" solid-state fermentation of mango industrial wastes // BioResources. -2012. - №7(4).
33. Naivy Y. Nava-Cruz Agave atrovirens fibers as substrate and support for solid-state fermentation for cellulase production by Trichoderma asperellum // Biotech. -2016. -pp.6-115.
34. Садыкова В. С. Грибы рода Trichoderma Средней Сибири: видовой состав и использование в биотехнологии / В. С. Садыкова, А. В. Кураков, А. Н. Лихачев // Биоразнообразие и экология грибов и грибоподобных организмов Северной Евразии: материалы Всероссийской конференции с международным участием, Екатеринбург, 20-24 апреля 2015 г. — Екатеринбург : Издательство Уральского университета, 2015 — С. 217-219.
35. Бондарь П.Н. Штаммы грибов рода Trichoderma Pers (Fr.) как основа для создания препаратов защиты растений и получения кормовых добавок: Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М., 2011.
© Д. Д. Зиганшин, аспирант, кафедра промышленной биотехнологии, Казанский национальный исследовательский технологический университет, ziganshind@gmail.com; А. С. Сироткин, доктор технических наук, профессор, зав. каф. промышленной биотехнологии КНИТУ, asirotkin66@gmail.com.
© D. D. Ziganshin, graduate student, department of industrial biotechnology, Kazan National Research Technological University, ziganshind@gmail.com; A. S. Sirotkin, doctor of technical sciences, professor, head of department of industrial biotechnology of KNRTU, asirotkin66@gmail.com.
Все статьи номера поступили в редакцию журнала в период с 25.04.17. по 25.05.17.
