ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ФОТОСТИМУЛЯЦИИ НА ПРОДУКТИВНОСТЬ КУЛЬТУРЫ LACTOBACILLUS LACTIS И АКТИВНОСТЬ ПОЛУЧЕННОГО НИЗИНА

Тихонов С.Л.; Тихонова Н.В.; Пестова И.Г.; Тихонова М.С.

УДК 577.182.44

DOI 10.29141/2500-1922-2022-7-1-8

Исследование влияния фотостимуляции на продуктивность культуры Lactobacillus lactis и активность полученного низина

С.Л. Тихонов1 н, Н.В. Тихонова1, И.Г. Пестова1, М.С. Тихонова2

1Уральский государственный экономический университет, г. Екатеринбург, Российская Федерация 2Уральский государственный медицинский университет, г. Екатеринбург, Российская Федерация

Реферат

Изложены результаты исследования влияния фотостимуляции инокулята Lactobacillus lactis на рост культуры и активность полученного низина. Для продуцирования низина в эксперименте использован замороженный инокулят Lactobacillus lactis. Культуру активировали в 5,0 мл стерильной пробирке MRS, выдержанной в инкубаторе при 37 °C в течение 48 ч. Перед инкубацией культуру Lactobacillus lactis обрабатывали светом синего спектра с длиной волны 430-470 нм и интенсивностью светового потока 35 мкВт/см2 в течение 1 ч (опытная группа). Образцы бактерий контрольной группы светом не обрабатывали. Для ферментации использовали среду MRS. Для определения титра культуры проводили посев на MRS среду. Влияние окислительного стресса на устойчивость Lactobacillus lactis определяли путем культивирования на агаризованной среде с помощью 5 мМоль пероксида водорода. Для определения титра и устойчивости к окислительному стрессу перед посевом культуры обрабатывали синим светом с указанными характеристиками и временем обработки. Это позволяет увеличить активность низина после 24 ч культивирования бактерии в сравнении с контрольной группой на 19,3 %, или на 558 МЕ/мл. Доказано, что титр культуры Lactobacillus lactis на фоне предварительного облучения светом синего спектра перед культивированием выше на 56,3 %, чем образцов контрольной группы. Обработка культуры Lactobacillus lactis светом синего спектра повышает ее жизнеспособность при окислительном стрессе на 75 %.

Для цитирования: Тихонов С.Л., Тихонова Н.В., Пестова И.Г., Тихонова М.С. Исследование влияния фотостимуляции на продуктивность культуры Lactobacillus lactis и активность полученного низина // Индустрия питания|Food Industry. 2022. Т. 7, № 1. С. 63-69. DOI: 10.29141/2500-1922-2022-7-1-8

Дата поступления статьи: 18 февраля 2022 г.

Research of the Photostimulation Effect on the Lactobacillus Lactis Culture Productivity and Resulting Nisin Activity

Sergey L. Tikhonov1 Natalia V. Tikhonova1, Inga G. Pestova1, Maria S. Tikhonova2

Ural State University of Economics, Ekaterinburg, Russian Federation 2Ural State Medical University, Ekaterinburg, Russian Federation H tihonov75@bk.ru

Keywords:

nisin;

Lactobacillus lactis;

Н tihonov75@bk.ru

Ключевые слова:

низин;

Lactobadllus 1асЬ^; фотостимуляция; активность; окислительный стресс клеток

Abstract

The article concerns the study results of the photostimulation influence of the Lactobacillus lactis inoculum on the cultural effervescence and obtained nisin activity. The researchers used frozen Lactobacillus lactis inoculum to produce nisin. They activated the culture in

photostimulation; activity;

oxidative cells stress

a 5.0 ml sterile MRS tube kept in an incubator at 37 °C For 48 hours. Before incubation, Lactobacillus lactis culture was treated with blue spectrum light with a wavelength of 430-470 nm and a luminous flux intensity of 35 MW/cm2 For 1 hour (experimental group). Bacterial samples of the control group were not treated with light. A man used the MRS medium For Fermentation. To determine the culture titer, the authors run sowing on the MRS medium. The researchers defined an oxidative stress influence on the Lactobacillus lactis stability by cultivation on an agar medium using 5 mmol of hydrogen peroxide. To identify the titer and resistance to oxidative stress before sowing, the cultures were treated with blue light with the specified characteristics and processing time. It enables to increase the nisin activity after 24 hours of bacterial cultivation compared to the control group by 19.3%, or by 558 lU/ml. The researchers proved that the titer of Lactobacillus lactis culture against the background of preliminary irradiation with blue spectrum light before cultivation is 56.3% higher than the samples of the control group. Treatment of Lactobacillus lactis culture with blue spectrum light increases its viability under oxidative stress by 75%.

For citation: Sergey L. Tikhonov, Natalia V. Tikhonova, Inga G. Pestova, Maria S. Tikhonova. Research of the Photostimulation Effect on the Lactobacillus Lactis Culture Productivity and Resulting Nisin Activity. Индустрия питания|Food Industry. 2022. Vol. 7, No. 1. Pp. 63-69. DOI: 10.29141/2500-1922-2022-7-1-8

Paper submitted: February 18, 2022

Актуальность

Загрязнение пищевых продуктов микроорганизмами из различных источников вызывает серьезную озабоченность, поскольку это не только снижает качество продуктов питания, но и приводит к их порче, а следовательно, может вызвать ряд заболеваний. Для предотвращения микробиологической порчи некоторые пищевые продукты обрабатывают ионизирующим излучением [1]. Особое внимание привлекают бак-териоцины, имеющие ряд преимуществ перед физическими и химическими способами (применение синтетических консервантов) увеличения срока хранения пищевой продукции: вызывают гибель микроорганизмов, являются безопасными природными биоконсервантами, усваиваются человеческим организмом [2; 3].

Как описано в [4], из продуктов питания были выделены бактерии Lactobacillus lactis, продуцирующие бактериоцин, имеющий лейкоци-новую природу. Полученный лейкоцин проявлял антимикробную активность в отношении Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas putida, Klebsiella и Serratia spp. Авторами доказана не только бактериостатиче-ская, но и бактерицидная природа белка, что позволило рекомендовать использование лейко-цина для консервирования пищевых продуктов.

Исследованиями [5] установлен синергетиче-ский антибактериальный эффект взаимодействия низина и карвакрола в отношении S. aureus. Комбинация может полностью инактивировать S. aureus в течение 8 ч, ускорить разрушение клеточной мембраны и подавить образование биопленки. При вмешательстве низина большее количество карвакрола может проникать в

бактериальную клетку. Доказано, что введение низина и карвакрола в пастеризованное молоко задерживает размножение микроорганизмов при 25 °C и 4 °C.

Результаты другого исследования [6], посвященного ингибированию роста сальмонелл путем использования комбинации низина с другими бактериоцинами, расширяют подходы к обеспечению безопасности пищевых продуктов. Комбинация низина и стрептомицина показала синергетический эффект.

Перспективы использования бактериоцинов в составе противомикробной упаковки для пищевой продукции отмечены в работе [7].

Важным направлением научных исследований является совершенствование технологии продуцирования низина. Учеными [8] доказана перспективность получения низина и молочной кислоты из крахмала сладкого картофеля с одновременным осахариванием и ферментацией (SSF) Lactococcus lactis; определены факторы, влияющие на выработку низина и молочной кислоты, включая концентрацию крахмала, глю-козидазы, CaCO3. Количество низина было максимальным - 2516,41 МЕ/мл - при концентрации крахмала 40 г/л, 100 ЕД глюкозидазы/г крахмала, 2,5% CaCO3 и 1 мл/л Твин-80.

Проведены исследования [9] по культивированию Lactococcus lactis CECT 539 - продуцентов низина. Увеличенные показатели биомассы бактерии (5,12 г/л; 2,18 х 1010 КОЕ/мл) и концентрации низина (235,23 БУ/мл) были получены в питательной среде с концентрированной молочной сывороткой и концентрированными отходами переработки мидий, дополненной глюкозой до

концентрации 400 г/л, по сравнению с аналогичными ферментациями в среде DW (разбавленная сывороточная среда). Авторы предполагают, что, учитывая значительную доступность молочной сыворотки, ее использование в качестве питательной среды может открыть привлекательную альтернативу для недорогого производства пробиотической биомассы и низина в больших масштабах.

Как известно, высокий титр низина приводит к уменьшению его продуцирования за счет связывания с клеточной стенкой бактерии.

На основании вышеизложенного можно предположить, что штаммы бактерий, устойчивые к катионному хлоргексидину, способны снижать связывание низина.

В работе [10] выделены варианты Lactococcus lactis с высокой толерантностью к хлоргексиди-ну. Культивирование таких штаммов в колбах с использованием ферментационного субстрата на основе патоки и побочного продукта производства гидролизата сывороточного белка позволило получить высокий титр низина, равный 13181 МЕ/мл.

В биотехнологии особое внимание уделяется изучению влияния различных физических факторов на биообъекты. Так, установлено [11], что культуры Lactococcus lactis и Lactobacillus plantarum, подвергнутые ультрафиолетовому, тепловому, световому мутагенезу, показали высокую продуктивность, выраженную в увеличении числа колоний.

Вместе с тем исследования влияния света различного спектра на активность, метаболизм и другие биологические функции нефотосин-тезирующих организмов и биологически активных веществ практически отсутствуют, хотя некоторые из указанных веществ могут иметь или имеют фоторецепторную систему, что подтверждается рядом работ [12; 13], авторы которых установили достоверное увеличение массы дрожжей на фоне их экспозиции светом синего и красного спектров. Так, в опытной группе (облучение дрожжей синим светом) прирост биомассы увеличился на 10 % по сравнению с контролем (отсутствие света); в другой опытной группе (облучение красным светом) прирост биомассы увеличился на 5 % по сравнению с образцами дрожжей контрольной группы. Полученные биоэффекты объясняются возможностью поглощения энергии света синего спектра митохондриями и, соответственно, увеличением биосинтеза макроэргов, а также прямым поглощением квантов синего света элементами митохондриальной энергетической системы, что вызывает повышенный синтез макроэргов. Содержащийся в дрожжевой клетке аналог фо-

торецептора - хромопротеид под действием энергии света локально нагревается, передает тепло мембране и всей клетке, а это приводит к усилению метаболизма и росту дрожжей.

Цель работы - изучение влияния фотостимуляции на рост продуктивности культуры Lactobacillus lactis и на активность полученного низина.

Объекты и методы исследования

Для продуцирования низина в эксперименте использован замороженный инокулят культуры Lactobacillus lactis, которую хранили в пробирке с агаром при температуре -5 °C. Культуру активировали в стерильной пробирке 5,0 мл с питательной средой MRS (DeMan-Rogosa-Sharpe), включающей дрожжевой экстракт, мясной экстракт, гидролизат казеина, глюкозу, цитрат аммония, Твин-80 и др. компоненты, выдержанной в инкубаторе при 37°C в течение 48 ч. Затем культуру переносили в стерильную пробирку с 10,0 мл MRS, которую выдерживали в инкубаторе при 37 °C еще 48 ч. Затем 5,0 мл этого количества инокулята переносили в 45,0 мл бульона MRS в стерильную колбу Эрленмейера объемом 125,0 мл и снова инкубировали при 37 °C в течение 48 ч. Впоследствии этот объем был перенесен в 450,0 мл бульона MRS, в результате чего получилось 500,0 мл в колбе Эрленмейера объемом 1,0 л. Его выдерживали в шейкере при 37 °C с вращением 150 об/мин в течение 30 ч для активации штамма перед ферментацией в биореакторе.

Перед инкубацией культуру Lactobacillus lactis обрабатывали светом синего спектра с длиной волны 430-470 нм и интенсивностью светового потока 35 мкВт/см2 в течение 1 ч (опытная группа). Образцы бактерий контрольной группы светом не обрабатывали.

Для ферментации использовали среду MRS. Ферментацию проводили с помощью лабораторного ферментера Minipro-Lab (производитель - компания «БИОТЕХНО») в течение 24 ч при температуре (43 ± 2) °C, перемешивании 200 об/мин и рН 6,5, которою поддерживали 5 М раствором NaOH с помощью насоса. Ферментацию проводили в анаэробных условиях.

Содержание низина определяли по задержке роста тест-культуры Bacilus coagulans по ГОСТ Р 57646-2017 «Продукция микробиологическая. Добавка пищевая низин. Технические условия».

Для оценки активности готовили стандартный раствор низина 5; 10; 15; 20 и 40 МЕ/мл. Стандартом служил раствор очищенного коммерческого препарата Nisaptin (Aplin&Barret Ltd, Великобритания). В лунки с культурой Bacilus coagulans

вносили 0,1 мл стандартного раствора и полученного низина, помещали в термостат на 16 ч при температуре 55 °С и измеряли диаметр зоны задержки роста Bacilus coagulans.

Для определения титра культуры Lactobacillus lactis проводили посев на MRS среду.

Изучено влияние окислительного стресса на устойчивость Lactobacillus lactis путем культивирования на агаризованной среде с использованием 5 мМоль пероксида водорода. Термоста-тирование проводили при температуре 36 °С в течение 48 ч в чашке Петри и с инкубацией при температуре 30-32 °С. По числу выросших колоний определяли устойчивость культуры к окислительному стрессу.

Для определения титра и устойчивости к окислительному стрессу перед посевом культуру обрабатывали синим светом с указанными выше характеристиками и временем обработки.

Результаты исследования и их обсуждение

Проведено исследование активности низина в процессе культивирования Lactobacillus lactis. Результаты представлены на рис. 1.

На фоне предварительной обработки культуры Lactobacillus lactis активность низина была выше. При увеличении продолжительности инкубирования бактерии повышается активность низина как в контрольной, так и в опытной группе образцов. Следует отметить, что в опытной группе содержание (активность) низина через 6; 12; 18 и 24 ч культивирования составляет 897; 1 372; 2 378; 3 235 и 3 451 МЕ/мл, в контрольной группе - 746; 1 153; 1 894; 2 866 и 2 893 МЕ/мл. Из приведенных данных следует, что полученный низин соответствует требованием ГОСТ Р 57646-2017 по показателю активности (не менее 1 000 МЕ/мл) в образцах как контрольной, так и опытной группы.

На рисунке 2 приведены данные о динамике титра культуры Lactobacillus lactis.

Титр культуры из опытной группы после 1; 4; 8; 16 и 24 ч культивирования составил 2; 7; 12; 19 и 25 х 109 КОЕ/мл, в то время как при инкубировании контрольных образцов Lactobacillus lactis - 1; 4; 7; 12 и 16 х 109 КОЕ/мл соответственно. Полученные данные свидетельствуют о положительном влиянии света синего спектра

о ю

го о. ю

0

о; 2

01 о. ш

24 18 12 6 3 О

= 2 893 3

2 378 2 866

1372 53 1894

0 0 7 897 46

с; 2 llT

О ^

а

о

X

о.

I-

,5

3 451 235

Опытная группа Контрольная группа

О 500 1 000 1 500 2 000 2 500 3 000 3 500 4 000

Активность, МЕ/мл

Рис. 1. Активность низина в процессе культивирования Lactobacillus lactis Fig. 1. Nisin Activity during Lactobacillus Lactis Cultivation

Опытная группа Контрольная группа

4 8

Время обработки, ч

Рис. 2. Титр культуры Lactobacillus lactis Fig. 2. Titer of Lactobacillus Lactis Culture

с; 2 ш

S

Опытная группа Контрольная группа

4 8

Время обработки, ч

Рис. 3. Влияние среды с пероксидом водорода на рост культуры Lactobacillus lactis Fig. 3. Hydrogen Peroxide Medium Influence on the Growth of Lactobacillus Lactis Culture

на процесс продуцирования низина культурой Lactobacillus lactis.

На рисунке 3 графически представлены данные о влиянии среды с пероксидом водорода на рост культуры Lactobacillus lactis.

Как видно на рисунке, пероксид водорода в большей мере влияет на рост культуры Lactobacillus lactis, чем среда, представленная на рис. 2. Следует отметить, что предварительное облучение культуры светом синего спектра ослабляет влияние окислительного стресса. Так, титр культуры опытной группы образцов после 4; 8; 16 и 24 ч культивирования составил 4; 7; 10 и 14 х 109 КОЕ/мл, в то время как при инкубировании контрольных образцов Lactobacillus lactis - 1; 3; 5 и 8 х 109 КОЕ/мл соответственно.

Судя по результатам исследования, предварительная обработка светом синего спектра культуры Lactobacillus lactis положительно влияет на жизнеспособность клеток, рост и метаболизм, что выражается в увеличении продуцирования низина и его активности.

Возможно, действие синего света на Lactobacillus lactis связано с переходом диссипирующей энергии света в химическую. Так, согласно закону Ламберта - Бера абсолютное количество поглощенной энергии прямо пропорционально мощности светового потока. Следовательно, свет с разной длиной волн поглощается одним и тем же веществом неодинаково; поглощение зависит от способности вещества иметь определенный спектр поглощения.

При рассмотрении природы поглощения света выделяют квантовую и волновую его природу. Согласно квантовой теории энергия света поглощается полностью, и сразу - молекулой, что является непрерывным процессом. Волновая теория заключается в том, что поглощение света происходит в результате взаимодействия электронного облака молекулы с электриче-

ским вектором волны. Возможно, полученные результаты связаны с фотохимическими и фотобиологическими эффектами поглощения света синего спектра; энергия света модифицируется в химическую, используемую для усиления синтеза ацетил-коэнзима А, что ускоряет цикл три-карбоновых кислот (ЦТК);как следствие, энергии вырабатывается больше, и бактериальные штаммы Lactobacillus lactis растут быстрее.

Наконец, в процессе исследования возникло предположение о наличии иного механизма активации бактерий. Полученные нами данные согласуются с результатами исследований [12], авторам которых удалось установить, что ультрафиолетовый и видимый свет приводит к мутагенезу бактерий с увеличением числа колоний.

Выводы

На основании проведенных исследований сделан следующий вывод: обработка культуры Lactobacillus lactis светом синего спектра с длиной волны 430-470 нм и интенсивностью светового потока 35 мкВт/см2 позволяет увеличить активность низина после 24 ч культивирования бактерии на 19,3 %; полученный низин по показателю активности соответствует требованием ГОСТ Р 57646-2017.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Доказано, что титр культуры Lactobacillus lactis на фоне предварительного облучения светом перед культивированием был выше на 56,3 % по сравнению с образцами контрольной группы. При этом обработка повышает жизнеспособность культуры Lactobacillus lactis при окислительном стрессе на 75 % после 24 ч культивирования. Вместе с тем механизм положительного действия света на Lactobacillus lactis следует изучать дополнительно, что позволит определить перспективы применения фотоактивации бактериальных клеток-продуцентов биологически активных веществ.

Библиографический список

1. Тимакова Р.Т., Тихонов С.Л., Тихонова Н.В. Количественная идентификация мяса косули, обработанного ионизирующим излучением, и оценка его безопасности // Индустрия питания^ Industry. 2021. Т. 6, № 3. С. 15-25. DOI: https://doi. org/10.29141/2500-1922-2021-6-3-2.

2. Kirtonia, K.; Salauddin, M.; Bharadwaj, K.K.; Pati, S.; Dey, A.; Shar-iati, M.A.; Tilak, V.K.; Kuznetsova, E.; Sarkar, T. Bacteriocin: A New Strategic Antibiofilm Agent in Food Industries. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. 2021. Vol. 36. Article Number: 102141. DOI: https://doi.org/10.1016/jj.bcab.2021.102141.

3. Daba, G.M.; Elnahas, M.O.;Elkhateeb, W.A. Beyond Biopreserva-tives, Bacteriocins Biotechnological Applications: History, Current Status, and Promising Potentials. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. 2022. Vol. 39. Article Number: 102248. DOI: https:// doi. org/10.1016/j.bcab.2021.102248.

4. Lahiri, D.; Chakraborti, S.; Jasu, A.; Nag, M.; Dutta, B.; Dash, S.; Ray, R.R. Production and Purification of Bacteriocin from Leuco-nostoc Lactis SM 2 Strain. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. 2020. Vol. 30. Article Number: 101845. DOI: https://doi. org/10.1016/j.bcab.2020.101845.

5. Li, Q.; Yu, S.; Han, J.; Wu, J.; You, L.; Shi, X.; Wang, S. Synergistic Antibacterial Activity and Mechanism of Action of Nisin /Carvacrol Combination against Staphylococcus Aureus and Their Application in the Infecting Pasteurized Milk. Food Chemistry. 2022. Vol. 380. Article Number: 132009. DOI: https://doi.org/10.1016/jj.foodchem. 2021.132009.

6. Özdemir, F.N.; Buzrul, S.; Özdemir, C.; Akgelik, N.; Akgelik, M. Determination of an Effective Agent Combination Using Nisin against Salmonella Biofilm. Archives of Microbiology. 2022. Vol. 204. Article Number: 167. DOI: https://doi.org/10.1007/s00203-022-02766-4.

7. Daba, G.M.; Elkhateeb, W.A. Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria as Biotechnological Tools in Food and Pharmaceuticals: Current Applications and Future Prospects. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. 2020. Vol. 28. Article Number: 101750. DOI: https: //doi.org/10.1016/j.bcab.2020.101750.

8. Cheng, Q.; Tao, J.; Li, Y.; Li, W.; Li, D.; Liu, Y.; Shi, X.; Liu, X.; Zhang, X.; Tong, Y.; Ren, X. Production of Nisin and Lactic Acid from the Starch of Sweet Potato by Simultaneous Saccharification and Fermentation with Two Stage pH Adjustment. 3 Biotech. 2021. Vol. 11. Article Number: 320. DOI: https://doi.org/10.1007/s13205-021-02778-9.

9. Malvido, C.M.; González, A.E.; Outeiriño, D.; Guerra, N.P. Production of a Highly Concentrated Probiotic Culture of Lactococcus Lactis CECT 539 Containing High Amounts of Nisin. 3 Biotech. 2018. Vol. 8. Article Number: 292. DOI: https://doi.org/10.1007/s13205-018-1318-8.

10. Zhao, G.; Kempen, P.J.; Shetty, R.; Gu, L.; Zhao, S.; Jensen, P.R.; Solem, C. Harnessing Cross-Resistance - Sustainable Nisin Production from Low-Value Food Side Streams Using a Lactococcus Lactis Mutant with Higher Nisin-Resistance Obtained after Prolonged Chlorhexidine Exposure. Bioresource Technology. 2022. Vol. 348. Article Number: 126776. DOI: https://doi.org/10.1016/jj.biortech.2022.126776.

11. Ramyasree, S.; Dutta, J.R. The Effect of Process Parameters in Enhancement of Lipase Production by Co-Culture of Lactic Acid Bacteria and Their Mutagenesis Study. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. 2013. Vol. 2. Iss. 4. Pp. 393-398. DOI: https://doi. org/10.1016/j.bcab.2013.08.002.

Bibliography

1. Timakova, R.T.; Tikhonov, S.L.; Tikhonova, N.V. Kolichestvennaya Identifikaciya Myasa Kosuli, Obrabotannogo loniziruyushhim Izlucheniem, i Ocenka Ego Bezopasnosti [Quantitative Identification of Roe Deer Meat Treated with Ionizing Radiation and Assessment of Its Safety]. Industriya Pitaniya|Food Industry. 2021. Vol. 6. No. 3. Pp. 15-25. DOI: https://doi.org/10.29141/2500-1922-2021-6-3-2.

2. Kirtonia, K.; Salauddin, M.; Bharadwaj, K.K.; Pati, S.; Dey, A.; Shar-iati, M.A.; Tilak, V.K.; Kuznetsova, E.; Sarkar, T. Bacteriocin: A New Strategic Antibiofilm Agent in Food Industries. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. 2021. Vol. 36. Article Number: 102141. DOI: https://doi.org/10.1016/jj.bcab.2021.102141.

3. Daba, G.M.; Elnahas, M.O.; Elkhateeb, W.A. Beyond Biopreserva-tives, Bacteriocins Biotechnological Applications: History, Current Status, and Promising Potentials. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology. 2022. Vol. 39. Article Number: 102248. DOI: https:// doi. org/10.1016/j.bcab.2021.102248.