CC BY
21
УДК 576.8.097.29 х^
DOI: 10.21668/health.risk/2019.4.15 онлайн пшщ
ОЦЕНКА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ CAMPYLOBACTER JEJUNI К АНТИМИКРОБНЫМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ ДЛЯ СНИЖЕНИЯ РИСКА КОНТАМИНАЦИИ ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯМИ КАМПИЛОБАКТЕРИОЗА
Н.Р. Ефимочкина, В.В. Стеценко, Ю.М. Маркова, Л.П. Минаева, И.Б. Быкова, Т.В. Пичугина, С.А. Шевелева
Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, 109240, Россия, г. Москва, Устьинский проезд, 2/14
Для оценки эффективности влияния на патогенную микрофлору различных антимикробных воздействий проведено сравнительное изучение чувствительности тест-штаммов Campylobacter jejuni к УФ-излучению и биоцидам на основе надуксусной кислоты (НУК). Биоциды на основе НУК подавляли значительное число кампи-лобактеров, однако заданные режимы обработки не обеспечивали полной инактивации тест-штаммов. Эффективность воздействия УФ-облучения на штаммы C. jejuni находилась в зависимости от продолжительности экспозиции: после 20 мин обработки планшетов с бульонными бактериальными суспензиями число жизнеспособных клеток снижалось на 1,5-2,0 логарифмических порядка, через 60 мин содержание C. jejuni снижалось и составляло менее 200 КОЕ/см3.
Антибиотические вещества полипептидной природы, продуцируемые молочнокислыми бактериями (бакте-риоцины, низин и др.), обладают комплексом полезных признаков, чем обусловлена возможность их использования для подавления вредной микрофлоры в производстве пищевых продуктов. Используя модель «ассоциативного роста», проведено изучение особенностей размножения C. jejuni в молоке, которое инокулировали одновременно с этим патогеном мезофильными молочнокислыми лактококками или термофильными лактобактериями - продуцентами бактериоцинов. В зависимости от количества внесенных молочнокислых бактерий Lactobacillus plan-tarum, Lactobacillus lactis и Lactococcus lactis размножение C. jejuni заметно ингибировалось. Установлена зависимость антибактериальной активности и характера ингибирующего действия от концентрации вышеназванных видов молочнокислых микроорганизмов, температуры и продолжительности культивирования смешанных культур, свойств используемых штаммов, которые в наибольшей степени проявлялись при внесении лактобакте-рий в дозе 108 КОЕ/см3.
Изучение способности C. jejuni выживать при неблагоприятных воздействиях внешней среды показало вариабельность физиологических свойств микробных популяций, высокую степень резистентности бактерий рода Campylobacter и связанные с ними трудности адекватного подбора эффективных средств и способов антимикробной обработки.
Ключевые слова: Campylobacter jejuni, модель in vitro, биоциды, антимикробные воздействия, УФ-облучение, контаминация, биопленки, молочнокислые бактерии.
© Ефимочкина Н.Р., Стеценко В.В., Маркова Ю.М., Минаева Л.П., Быкова И.Б., Пичугина Т.В., Шевелева С.А., 2019
Ефимочкина Наталья Рамазановна - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома (e-mail: karlikanova@ion.ru; тел.: 8 (495) 698-53-83; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-9071-0326).
Стеценко Валентина Валерьевна - младший научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома (e-mail: stetsenko_valentina1992@mail.ru; тел.: 8 (495) 698-53-83; ORCID: http://orcid.org/0000-0001-6470-171X).
Маркова Юлия Михайловна - научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома (e-mail: yulia.markova.ion@gmail.com; тел.: 8 (495) 698-53-83; ORCID: http: //orcid.org/0000-0002-2631-6412).
Минаева Людмила Павловна - кандидат технических наук, старший научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома (e-mail: liuminaeva-ion@mail.ru; тел.: 8 (495) 698-53-83; ORCID: http:// orcid.org/0000-0003-1853-5735).
Быкова Ирина Борисовна - научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома (e-mail: bikova@ion.ru; тел.: 8 (495) 698-53-83; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7288-312X).
Пичугина Татьяна Викторовна - кандидат технических наук, научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома (e-mail: bbtvp@ion.ru;ira.: 8 (495) 698-53-83; ORCID: https://orcid.org/ 0000-0002-4632-7119).
Шевелева Светлана Анатольевна - доктор медицинских наук, заведующий лабораторией биобезопасности и анализа нутримикробиома (e-mail: sheveleva@ion.ru; тел.: 8 (495) 698-53-83; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-5647-9709).
Высокая эпидемиологическая значимость бактерий рода Campylobacter обусловливает необходимость установления возможности выживания этих микроорганизмов в условиях современного производства пищевых продуктов под влиянием различных техногенных или биологических факторов. Изучение механизмов формирования стрессовой толерантности бактерий рода Campylobacter позволит интенсифицировать применение методологии оценки микробиологического риска и осуществлять эффективный мониторинг загрязненности пищевых продуктов возбудителями кампилобактериоза.
Бактерии рода Campylobacter широко распространены во внешней среде и обнаруживаются на поверхностях оборудования и инвентаря предприятий пищевой промышленности [1]. Поскольку частота контаминации живыми кампилобактерия-ми объектов производственной среды высока, возникает потенциальная опасность появления дополнительных источников их инфицирования за счет некультивируемых форм и биопленок. Формирование последних усиливается под воздействием технологических стрессовых факторов, таких как сублетальные дозы антибиотиков, кислот, дезинфектантов, биоцидов и др. [2-4]. Этот процесс рассматривается как один из механизмов адаптации микроорганизмов в природных и искусственных экосистемах [5-7]. Облучение, широко используемое с целью бактерицидной обработки объектов производственной среды и упаковочных материалов, также может вызывать у бактерий стрессовый ответ, которые индуцирует не только толерантность к этому воздействию, но и формирует устойчивость к другим видам обработки сырья и готовых продуктов [8, 9].
Влияние неблагоприятных воздействий внешней среды на жизненно важные функции бактериальной клетки происходит на различных регулятор-ных уровнях, что может сопровождаться появлением индуцированной толерантности микроорганизмов к воздействию тех или иных бактерицидных факторов. В природных условиях, а также при санитарной обработке воды и оборудования толерантность бактерий может формироваться под влиянием различных антибактериальных агентов, в том числе хлора, кислот, щелочей, консервантов, антиоксидантов, бактериофагов, колицинов, акрилатов, ионов металлов [10-12].
В качестве меры, снижающей обсемененность патогенными микроорганизмами в пищевой промышленности, в настоящее время достаточно широко применяют обработку хлорсодержащими средствами [8, 9, 13, 14]. Свободный хлор и выделяющие его соединения (гипохлорит натрия, кальция, магния, хлорная известь, хлорамин, диоксид хлора, ди-хлоризоцианураты натрия и калия) широко используются для целей дезинфекции в медицине и ветеринарии, обеззараживания питьевой воды и очистки сточных вод, а также в производстве пищевых про-
дуктов для обработки оборудования и даже для снижения микробной контаминации поверхности используемого сырья, поскольку обладают высокой антимикробной активностью против большинства болезнетворных микроорганизмов [15].
Обработка хлорсодержащими биоцидами обеспечивает предупреждение перекрестного обсеменения продукции возбудителями пищевых инфекций и токсикоинфекций, позволяет продлить сроки годности продукции. Однако применение хлора связано с рядом негативных эффектов, одним из которых является образование тригалометанов, обладающих токсическим и канцерогенным действием: хлороформа, дихлорбромметана, дибром-хлорметана и бромоформа [6, 13]. В целом соблюдение установленных максимально допустимых уровней остатков таких соединений позволяет избегать прямого риска для здоровья в виде токсических, аллергических и других реакций при употреблении пищевых продуктов и напитков с остатками таких веществ. Однако в настоящее время доказана потенциальная возможность появления как приобретенной пониженной чувствительности к биоцидам, так и корезистентности к лекарственным антимикробным средствам у микроорганизмов - конта-минантов пищи и напитков [10, 16]. С биоцидами сегодня связывают также такие негативные последствия, как ускорение эволюции бактериальных патогенов и появление новых инфекций, опасных для человека [11, 12].
Распространение этих явлений свидетельствует о недооценке отдаленных рисков применения антимикробных средств в технологических целях. Безопасность традиционных концентраций биоцидов, используемых в пищевой индустрии, формирование толерантности к ним у различных видов контами-нантов, изменение фенотипических признаков наиболее значимых групп микроорганизмов в настоящее время изучены недостаточно.
Для снижения риска негативных воздействий важной задачей является обоснованный подбор эффективных и безопасных средств деконтаминации сырья и санитарной обработки оборудования на предприятиях пищевой промышленности.
Материалы и методы. Оценку эффективности подавления патогенной микрофлоры различными антимикробными препаратами проводили путем сравнительного анализа чувствительности тест-штаммов кампилобактеров и сальмонелл (бактерий-индикаторов пищевых патогенов) к воздействию биоцидов на основе гипохлорита, технологических вспомогательных средств «ФудКлинПерокси» и «Криодез» на основе надуксусной кислоты (НУК). Чувствительность бактерий С. jejuni к неблагоприятным воздействиям определяли с использованием разработанной ранее лабораторной модели in vitro [17], проводя параллельное культивирование нескольких субпопуляций тестируемых штаммов при варьировании параметров газовой среды и режимов инкуба-
ции. Определение соотношения числа жизнеспособных колониеобразующих единиц (КОЕ) и общего количества клеток в популяции рассчитывали по содержанию геномной ДНК в пробах методом количественной ПЦР-РВ [18].
Эффективность антимикробного действия растворов активного хлора в отношении сальмонелл оценивали по наличию или отсутствию роста тест-штаммов в глюкозопептонной среде с индикатором бромтимоловым синим (ГПС) после внесения биоцида и 18-часового культивирования проб при температуре 37 °С. Для обеспечения возможности варьирования двух факторов - концентрации биоцида и плотности бактериальной суспензии - использовали 96-луночные стерильные иммунологические планшеты [19]. О наличии роста судили по помутнению среды и изменению ее цвета от сине-зеленого до желтого. Оптическую плотность сред измеряли с использованием автоматического планшетного спектрофотометра Sunrise.
Способность штаммов С. jejuni к образованию биопленок определяли с использованием разработанной ранее лабораторной модели in vitro [20]. Штаммы выращивали на полистироловых 96- и 24-луночных планшетах, используя в качестве сред культивирования бульон Мюллера - Хинтона с внесением 5 % дефибринированной крови, а также ростовых добавок фирм Merck и HiMedia, содержащих пируват натрия, метабисульфит натрия и сульфат железа. Интенсивность пленкообразования определяли хромогенным методом с использованием планшетного спектрофотометра.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью критерия Стьюдента и непараметрического рангового критерия Манна - Уитни. Различия признавали достоверными при уровне значимости p < 0,05. Для расчетов применяли программы EXCEL и SPSS 18.0.
Результаты и их обсуждение. Ингибирующее действие дезсредств оценивали по интенсивности роста тест-штаммов в зависимости от концентрации биоцида и плотности бактериальных популяций (табл. 1).
Оценка воздействия активного хлора на сальмонеллы в условиях хромогенной модели in vitro приведена на рис. 1.
В сравнении с «ФудКлин Перокси» воздействие средства «Криодез» в отношении кампилобакте-рий было слабее и приводило к снижению количества тест-штаммов только на 1-2 логарифмических порядка (с 1,0109 до 1,0107-8 КОЕ/см3). Результаты проведенных сравнительных исследований по оценке антимикробного действия биоцидов на основе НУК свидетельствуют о необходимости оптимизации режимов контактного охлаждения сырья на птицеперерабатывающих предприятиях и подбора концентраций рабочих растворов дез-средств.
После обработки хлором у штаммов S. enter-itidis и S. typhimurium регистрировали отсутствие пленкообразования, в то время как у C. jejuni наблюдали тенденцию усиления способности к образованию пленок (рис. 2).
Таблица 1
Воздействие биоцидов на C. jejuni и Salmonella spp.
Тест-штаммы Разведение исходных суспензий тест-культур*
10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 10-6 I 10-' I 10-8 I 10-9 I 10-10
Контроль (без биоцидов)
Salmonella enteritidis + + + + + + + + + +
Salmonella typhimurium + + + + + + + + + -
С. jejuni 13п + + + + + + + + + -
С. jejuni5n + + + + + + + + - -
Гипохлорит (концентрация активного хлора 50 мг/дм3, экспозиция 25 мин при температуре +2 С)
Salmonella enteritidis + + + + + - - - - -
Salmonella typhimurium + + - - - - - - - -
С. jejuni 13п + + + - - - - - - -
С. jejuni 5п + + - - - - - - - -
«Фуд Клин Перокси» (0,04%-ный раствор, экспозиция 25 мин при температуре +2 °С)
Salmonella enteritidis - - - - - - - - - -
Salmonella typhimurium - - - - - - - - - -
С. jejuni 13п + + + + - - - - - -
С. jejuni5n + + + - - - - - - -
«Криодез» (0,04%-ныйраствор, экспозиция 25мин при температуре +2 °С)
Salmonella enteritidis - - - - - - - - - -
Salmonella typhimurium - - - - - - - - - -
С. jejuni 13п + + + + + + + - - -
С. jejuni5n + + + + + + - - - -
П р и м е ч а н и е : +/- - отсутствие или наличие роста в соответствующих разведениях суспензий тест-штаммов после воздействия биоцида; * - содержание бактерий в исходной бульонной культуре не менее 1109 КОЕ/см3.
а б
Рис. 1. Рост коллекционных тест-штаммов сальмонелл в присутствии активного хлора в диапазоне концентраций 10-200 мг/дм3 в экспериментальной хромогенной модели: а - 8. еШегИ1й18; б - ТурЫтжтт
Таблица 2 Рост штаммов C. jejuni при различных антимикробных воздействиях
Рис. 2. Способность штаммов кампилобактерий и сальмонелл к формированию биопленок
Поскольку применение хлорсодержащих средств не обеспечивало в достаточной степени эффективной обработки зараженных кампилобак-териями субстратов, были испытаны другие виды антимикробных воздействий. С этой целью проведено изучение чувствительности тест-штаммов кампилобактеров к УФ-излучению в сравнении с воздействием биоцидов на основе НУК.
Ингибирующее действие бактерицидных средств оценивали по интенсивности роста тест-штаммов в зависимости от продолжительности УФ-обработки и концентрации НУК (табл. 2).
Биоциды на основе НУК с концентрацией рабочего раствора 0,04 % подавляли значительное число бактерий C. jejuni (от 106,58 до 102-3 КОЕ/см3), однако заданные режимы обработки не обеспечивали полной инактивации тест-штаммов. Эффективность воздействия УФ-облучения на штаммы кам-пилобактеров находилась в зависимости от продолжительности экспозиции: после 20 мин обработки планшетов с бульонными бактериальными суспензиями число жизнеспособных клеток снижалось на 1,5-2,0 логарифмических порядка от исходной
Определяемый показатель № штамма / число повторов Средние значения, М ± m (опыт)
NCTC 11168 (контроль), n = 3 17п, n = 3 23п, n = 3 5.2, n = 3
Культивирование тест-штаммов при +37 С вмикроаэро-фильныхусловиях (контроль)
Плотность бактериальной суспензии, lg КОЕ/см3 7,99 6,9 6,8 6,6 7,07±0,31
Результаты ПЦР / (Ct) + (14,5) + (14,8) + (17,5) + (16,3) (15,78 ± 0,7)
Обработка НУК (0,04%-ный раствор, экспозиция 25 мин при температуре +2 С)
Плотность бактериальной суспензии, ^ КОЕ/см3 3,6 2,6 2,1 3,3 2,90 ± 0,34
Результаты ПЦР / (С) + (21,6) + (17,3) + (23,1) + (21,0) (20,75 ± 1,2)
Ингибиция, ^ порядков от исходного 4,4 4,3 4,7 3,3 4,1
УФ-облучение в течение 20 мин
Плотность бактериальной суспензии, ^ КОЕ/см3 4,3 5,6 5,1 4,3 4,83 ± 0,32
Результаты ПЦР / (С) + (28,8) + (29,8) + (28,6) (32,7) (29,07±0,37)
Ингибиция, ^ порядков от исходного 3,7 2,3 1,7 2,3 2,1
УФ-облучение в течение 60 мин
Плотность бактериальной суспензии, ^ КОЕ/см3 1,9 2,1 1,1 <1,0 1,53 ± 0,28
Результаты ПЦР / (С) + (29,0) + (26,2) + (27,1) + (30,7) + (28,25 ± 1,0)
Ингибиция, ^ порядков от исходного 6,09 4,8 5,7 5,6 5,4
I I JL J[ Jfc
Рис. 3. Влияние бактерицидных воздействий на выживание С. jejuni
концентрации 107-108 КОЕ/см3, через 60 мин содержание C. jejuni снижалось и составляло менее 200 КОЕ/см3 (рис. 3).
Результаты проведенных сравнительных исследований по оценке антимикробных воздействий на бактерии рода Campylobacter свидетельствуют о необходимости подбора современных более эффективных средств деконтаминации производственной среды пищевых предприятий.
Имеющиеся данные о характере воздействия физико-химических и биологических факторов в отношении бактерий рода Campylobacter обусловили проведение исследований по изучению способности некоторых микроорганизмов проявлять симбиотиче-ские или антагонистические свойства в сложном биоценозе c пищевыми патогенами. Наибольшее значение в этом плане придается молочнокислым бактериям с выраженным антимикробным действием и выделенным из них субстанциям. Ведущее место в объяснении явления антагонизма молочнокислых бактерий отводится специфическим антибиотическим веществам полипептидной природы, обладающим определенным спектром антимикробного действия и различной химической структурой. Бактериостатики, продуцируемые молочнокислыми бактериями (бактерио-цины, низин и др.), обладают комплексом полезных признаков, чем обусловлена возможность их использования для подавления вредной микрофлоры в производстве пищевых продуктов.
Данные, касающиеся взаимодействий между кампилобактерами и молочнокислыми микроорганизмами, немногочисленны из-за трудности воспроизведения в экспериментальных условиях естественного микробного фона этого сложного биотехнологического процесса. С использованием модели «ассоциативного роста» проведено изучение особенностей размножения C. jejuni в молоке, которое инокулировали одновременно с этим патогеном мезофильными молочнокислыми лактококками или термофильными лактобактериями. В зависимости от количества внесенных молочнокислых бактерий и температуры инкубирования размножение кампилобактеров заметно ингибировалось (табл. 3).
Антибактериальное действие культур Lactoba-cillus plantarum, подобное бактериоцину, установле-
но в опытах in vitro, при этом гибели бактериальных клеток C. jejuni не наступало, то есть проявлялся лишь бактериостатический эффект. Подавление роста патогенных штаммов кампилобактеров наблюдали также при совместном культивировании в молоке с Lactobacillus lactis и молочнокислыми лактококками Lactococcus lactis. В течение 6-24 ч инкубирования в смешанных популяциях происходила инактивация C. jejuni - снижение первоначального уровня на 1-3 lg. Установлена зависимость антибактериальной активности и характера ингиби-рующего действия от концентрации вышеназванных видов молочнокислых микроорганизмов, температуры и продолжительности культивирования смешанных культур, свойств используемых штаммов, которые в наибольшей степени проявлялись при внесении лактобактерий в дозе 108 КОЕ/см3.
Таблица 3
Обнаружение С. jejuni в процессе сквашивания эксперментально контаминированного сырого молока
Молочнокислые микроорганизмы Концентрация молочнокислых микроорганизмов, клеток/см3 Концентрация С. jejuni, клеток/см3
102 103 104
6 ч 24 ч 6 ч 24 ч 6 ч 24 ч
Lactobacillus plantarum 104 + - + + + +
106 - - + + + +
108 - - - - + -
Lactobacillus lactis 104 - - + - + +
106 - - + - + +
108 - - - - + -
Lactococcus lactis 104 + - + + + +
106 - - + - + +
108
П р и м е ч а н и е : «+» - наличие роста С. jejuni, «-» - отсутствие роста С. jejuni
Изучение способности C. jejuni выживать при неблагоприятных воздействиях внешней среды показало вариабельность физиологических свойств микробных популяций, высокую степень резистентности бактерий рода Campylobacter и связанные с ними трудности адекватного подбора эффективных средств и способов антимикробной обработки. Поэтому дальнейшие исследования должны быть направлены на изучение механизмов трансфера-бельной резистентности бактерий рода Campylo-bacter, влияния стрессовых факторов производственной среды на их выживаемость и переход в не-культивируемые формы; изучение специфических механизмов фенотипической адаптации (толерантности) к сублетальным концентрациям антимикробных средств.
Выводы. Общие механизмы защитных свойств Campylobacter spp. могут реализоваться в различных вариантах взаимодействия бактерий с окружающей средой, способствуя формированию устойчивых вариантов микроорганизмов как in vitro, так и в произ-
водственных условиях под влиянием стрессовых техногенных или биологических факторов.
Наиболее выраженной тенденцией в изменении свойств C. jejuni является повышение их резистентности к бактерицидным воздействиям, которые обусловлены повсеместным применением антимикробных препаратов (АМП), в том числе антибиотиков и биоцидов.
С использованием модели «ассоциативного роста» показана зависимость антибактериальной активности и характера ингибирующего действия от концентрации молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum, Lactobacillus lactis и Lactococcus lactis, температуры и продолжительности культивирования смешанных культур, свойств используемых штаммов, которые в наибольшей степени проявлялись при внесении лактобактерий в дозе 108 КОЕ/см3.
Для оценки эффективности влияния на патогенную микрофлору различных антимикробных воздействий проведено сравнительное изучение чувствительности тест-штаммов кампилобактеров к УФ-из-лучению и биоцидам на основе надуксусной кислоты (НУК). Биоциды на основе НУК подавляли значительное число бактерий C. jejuni, однако заданные режимы обработки не обеспечивали полной инактивации тест-штаммов. Эффективность воздействия УФ-облучения на штаммы кампилобактеров находилась в зависимости от продолжительности экспозиции и условий антимикробного воздействия.
Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 15-16-00015).
Конфликт интересов. Авторы данной статьи сообщают об отсутствии конфликта интересов.
Список литературы
1. The change in prevalence of Campylobacter on chicken cascasses during processing: A systematic review / M.T. Guerin, C. Sir, J.M. Sargeant, L. Waddell, A.M. O'Connor, R.W. Wills, R.H. Bailey, J.A. Byrd // Poult. Sci. - 2010. - Vol. 89, № 5. -P. 1070-1084. DOI: 10.3382/ps.2009-00213
2. Yang H., Li Y., Johnson M.G. Survival and death of Salmonella typhimurium and Campylobacter jejuni in processing water and on chicken skin during poultry scalding and chilling // J. Food Prot. - 2001. - Vol. 64, № 6. - P. 770-776. DOI: 10.4315/0362-028x-64.6.770
3. Epidemiology and Control of Campylobacter in Modern Broiler Production / A.B. Vidal, R.H. Davies, J.D. Rodgers, A. Ridley, F. Clifton-Hadley // Campylobacter Ecology and Evolution. - Norfolk, UK: Caister Academic Press, 2014. -Vol. 1. - P. 287-231.
4. Teh A.H., Lee S.M., Dykes G.A. Does Campylobacter jejuni form biofilms in food-related environment? // Appl. Environ. Microbiol. - 2014. - Vol. 80, № 17. - P. 5154-5160. DOI: 10.1128/AEM.01493-14
5. An Evaluation of EPA's Proposed Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Using Chloroform and Dichloroacetate as Case Studies. Report of an Expert Panel [Электронный ресурс] // International Life Sciences Institute. - 1997. - URL: https: //hesiglobal.org/publication/an-evaluation-of-epas-proposed-guidelines-for-carcinogen-risk-assessment-using-chloroform-and-dichloroacetate-as-case-studies-workshop-report/ (дата обращения: 20.07.2019).
6. Oral (drinking water) two-generation reproductive toxicity study of bromodichloromethane (BDCM) in rats / M.S. Christian, R.G. York, A.M. Hoberman, L.C. Fisher, W.R. Brown // International Journal of Toxicology. - 2002. - Vol. 21, № 2. - P. 115-146. DOI: 10.1080/10915810252866097
7. Hicks S.J., Rowbury R.J. Resistance of attached Escherichia coli to acrylic acid and its significance for the survival of plasmid-bearing organisms in water // Ann. Inst. Pasteur. - 1987. - Vol. 138, № 3. - P. 359-369. DOI: 10.1016/0769-2609 (87) 90124-4
8. Scientific Opinion of the Panel on Biological Hazards on a request from DG SANCO on the assessment of the possible effect of the four antimicrobial treatment substances on the emergence of antimicrobial resistance // The EFSA Journal. -2008. - № 659. - P. 1-26.
9. Application of Acidified Sodium Chlorite in the Drinking Water to Control Salmonella serotype Typhimurium and Campylobacter jejuni in Commercial Broilers / P. Mohyla, S.F. Bilgili, O.A. Oyarzabal, C.C. Warf, G.K. Kemp // J. Appl. Poult Res. - 2007. - Vol. 16, № 1. - P. 45-51. DOI: 10.1093/japr/16.1.45
10. Nikaido H. Multidrug resistance in bacteria // Annu Rev. Biochem. - 2009. - № 78. - P. 119-146. DOI: 10.1146/annurev.biochem.78.082907.145923
11. European Food Safety Authority and European Centre for Disease Prevention and Control. The European Union summary report on antimicrobial resistance in zoonotic and indicator bacteria from humans, animals and food in 2014 // EFSA Journal. - 2016. - Vol. 14, № 2. - 270 p. DOI: 10.2903/j.efsa.2018.5182
12. Mavri A., Ribic U., Mozina S.S. The Biocide and Antibiotic Resistance in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli // Emerging and Traditional Technologies for Safe, Healthy and Quality Food. - 2015. - P. 269-283. DOI: 10.1007/978-3-319-24040-4_15
13. Biodisposition of dibromoacetic acid (DBA) and bromodichloromethane (BDCM) administered to rats and rabbits in drinking water during range-finding reproduction and developmental toxicity studies / M.S. Christian, R.G. York, A.M. Hoberman, R.M. Diener, L.C. Fisher, G.A. Gates // International Journal of Toxicology. - 2001. - Vol. 20, № 4. - P. 239-253.
14. Rao M.V. Acidified Sodium Chlorite (ASC). Chemical and Technical Assessment. Prepared for the 68th the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives [Электронный ресурс] // JECFA. - 2007. - 12 p. - URL: http: //www.fao.org/fileadmin/templates/agns/pdf/jecfa/cta/68/Acidified_Sodium_Chlorite.pdf (дата обращения: 20.07.2019).
15. Oyarzabal O.A. Reduction of Campylobacter spp. by commercial antimicrobials applied during the processing of broiler chickens: a review from the United States perspective // J. Food Prot. - 2005. - Vol. 68. - P. 1752-1760. DOI: 10.4315/0362-028x-68.8.1752
16. The global view of campylobacteriosis: report of an expert consultation, Utrecht, Netherlands, 9-11 July 2012 [Электронный ресурс] // World Health Organization. - 2013. - 69 p. - URL: https: //apps.who.int/iris/handle/10665/80751 (дата обращения: 20.07.2019).
17. Стеценко В.В., Ефимочкина Н.Р., Пичугина Т.В. Особенности роста и персистенции Campylobacter jejuni в пищевых продуктах // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2018. - Т. 166, № 12. - С. 723-730.
18. Особенности культивирования и хранения бактерий рода Campylobacter в условиях in vitro / Н.Р. Ефимочкина, В.В. Стеценко, И.Б. Быкова, А.С. Полянина, А.С. Алешкина, С.А. Шевелева // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2017. - Т. 164, № 7. - С. 81-88.
19. Изучение толерантности энтеробактерий к хлорсодержащим биоцидным средствам в экспериментальных моделях с использованием индикаторных тест-систем / Н.Р. Ефимочкина, И.Б. Быкова, Ю.В. Короткевич, Ю.М. Маркова, Л.П. Минаева, С.А. Шевелева // Анализ риска здоровью. - 2015. - № 3. - С. 73-82. DOI: 10.21668/ health.risk/2015.3.11
20. Формирование биопленок пищевыми патогенами и разработка на их основе лабораторной модели in vitro для исследования бактерий рода Campylobacter / Н.Р. Ефимочкина, И.Б. Быкова, Ю.М. Маркова, Ю.В. Короткевич, В.В. Стеценко, Л.П. Минаева, С.А. Шевелева // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2016. -Т. 162, № 10. - С. 470-475.
Оценка чувствительности Campylobacter jejuni к антимикробным воздействиям для снижения риска контаминации пищевой продукции возбудителями кампилобактериоза / Н.Р. Ефимочкина, В.В. Стеценко, Ю.М. Маркова, Л.П. Минаева. И.Б. Быкова, Т.В. Пичугина, С.А. Шевелева // Анализ риска здоровью. - 2019. - № 4. - С. 139-147. DOI: 10.21668/health.risk/2019.4.15
UDC 576.8.097.29
DOI: 10.21668/health.risk/2019.4.15.eng
ASSESSING SENSITIVITY OF CAMPYLOBACTER JEJUNI TO ANTI-MICROBE EFFECTS TO REDUCE RISKS OF FOOD PRODYCTS CONTAMINATION WITH CAMPYLOBACTERIOSIS AGENTS
N.R. Efimochkina, V.V. Stetsenko, Yu.M. Markova, L.P. Minaeva, I.B. Bykova, T.V. Pichugina, S.A. Sheveleva
Federal Research Center for Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 2/14 Ust'inskiy proezd, Moscow, 109240, Russian Federation
We aimed to assess efficiency of various anti-microbe effects on pathogenic microflora; to do that, we performed comparative study on how sensitive Campylobacter jejuni test strains were to ultraviolet radiation and biocides based on perace-tic acid (PAA). PAA-based biocides suppressed significant numbers of Campylobacter; however, preset treating modes didn't allow achieving complete inactivation of the test strains. Efficiency of effects produced by ultraviolet radiation on C jejuni strains depended on exposure duration: 20-minute treatment of plates with broth bacterial suspensions caused a decrease in a number of viable cells which was equal to 1.5-2,0 logarithmic orders; 60-minute treatment resulted in a decrease in C.jejuni contents that amounted to less than 200 CFU/cm3.
Polypeptide antibiotics produced by lactic-acid bacteria (bacteriocins, nisin, etc.) have some useful properties and it makes them applicable for suppressing adverse microflora in food products manufacture. We applied an 'associate growth " model to examine peculiarities related to C.jejuni growth in milk that, beside this pathogen, was simultaneously inoculated with mesophilic lactic-acid lactococci or thermophilic lactic-acid bacteria that were bacteriocins producers. Depending on quantity of introduced lactic-acid bacteria, such as Lactobacillusplantarum, Lactobacilluslactis and Lactococcuslactis, C.jejuni growth was substantially inhibited. We revealed a relationship between anti-bacterial activity and nature of inhibiting effects and concentrations of the above-mentioned lactic-acid microorganisms, temperature, an amount of time during mixed cultures were cultivated together, and properties of used strains which became the most apparent when lactobacteria were introduced in a dose equal to 108 CFU/cm3.
Read online
Our study on an ability of C.jejuni to survive under exposure to an adverse environment revealed that microbe populations had variable physiological properties, Campylobacter were greatly resistant, and it was difficult to make a relevant choice on efficient tools and procedures for anti-microbe treatment.
Key words: Campylobacter jejuni, in vitro model, biocides, anti-microbe effects, ultraviolet radiation, contamination, biofilms, lactic-acid bacteria.
References
1. Guerin M.T., Sir C., Sargeant J.M., Waddell L., O'Connor A.M., Wills R.W., Bailey R.H., Byrd J.A. The change in prevalence of Campylobacter on chicken cascasses during processing: A systematic review. Poult. Sci., 2010, vol. 89, no. 5, pp. 1070-1084. DOI: 10.3382/ps.2009-00213
2. Yang H., Li Y., Johnson M.G. Survival and death of Salmonella typhimurium and Campylobacter jejuni in processing water and on chicken skin during poultry scalding and chilling. J. Food Prot, 2001, vol. 64, no. 6, pp. 770-776. DOI: 10.4315/0362-028x-64.6.770
3. Vidal A.B., Davies R.H., Rodgers J.D., Ridley A., Clifton-Hadley F. Epidemiology and Control of Campylobacter in Modern Broiler Production. Campylobacter Ecology and Evolution. Norfolk, UK, Caister Academic Press Publ., 2014, vol. 1, pp. 287-231.
4. Teh A.H., Lee S.M., Dykes G.A. Does Campylobacter jejuni form biofilms in food-related environment? Appl. Environ. Microbiol, 2014, vol. 80, no. 17, pp. 5154-5160. DOI: 10.1128/AEM.01493-14
5. An Evaluation of EPA's Proposed Guidelines for Carcinogen Risk Assessment Using Chloroform and Dichloroacetate as Case Studies. Report of an Expert Panel. International Life Sciences Institute, 1997. Available at: https://hesiglo-bal.org/publication/an-evaluation-of-epas-proposed-guidelines-for-carcinogen-risk-assessment-using-chloroform-and-dichloro-acetate-as-case-studies-workshop-report/ (20.07.2019).
6. Christian M.S., York R.G., Hoberman A.M., Fisher L.C., Brown W.R. Oral (drinking water) two-generation reproductive toxicity study of bromodichloromethane (BDCM) in rats. International Journal of Toxicology, 2002, vol. 21, no. 2, pp. 115-146. DOI: 10.1080/10915810252866097
7. Hicks S.J., Rowbury R.J. Resistance of attached Escherichia coli to acrylic acid and its significance for the survival of plasmid-bearing organisms in water. Ann. Inst. Pasteur, 1987, vol. 138, no. 3, pp. 359-369. DOI: 10.1016/0769-2609(87)90124-4
8. Scientific Opinion of the Panel on Biological Hazards on a request from DG SANCO on the assessment of the possible effect of the four antimicrobial treatment substances on the emergence of antimicrobial resistance. The EFSA Journal, 2008, no. 659, pp. 1-26.
9. Mohyla P., Bilgili S.F., Oyarzabal O.A., Warf C.C., Kemp G.K. Application of Acidified Sodium Chlorite in the Drinking Water to Control Salmonella serotype Typhimurium and Campylobacter jejuni in Commercial Broilers. J. Appl. Poult Res, 2007, vol. 16, no. 1, pp. 45-51. DOI: 10.1093/japr/16.1.45
10. Nikaido H. Multidrug resistance in bacteria. Annu Rev. Biochem, 2009, no. 78, pp. 119-146. DOI: 10.1146/an-nurev.biochem.78.082907.145923
11. European Food Safety Authority and European Centre for Disease Prevention and Control. The European Union summary report on antimicrobial resistance in zoonotic and indicator bacteria from humans, animals and food in 2014. EFSA Journal, 2016, vol. 14, no. 2, 270 p. DOI: 10.2903/j.efsa.2018.5182
12. Mavri A., Ribic U., Mozina S.S. The Biocide and Antibiotic Resistance in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli. Emerging and Traditional Technologies for Safe, Healthy and Quality Food, 2015, pp. 269-283. DOI: 10.1007/978-3-319-24040-4_15
13. Christian M.S., York R.G., Hoberman A.M., Diener R.M., Fisher L.C., Gates G.A. Biodisposition of dibromoacetic acid (DBA) and bromodichloromethane (BDCM) administered to rats and rabbits in drinking water during range-finding reproduction and developmental toxicity studies. International Journal of Toxicology, 2001, vol. 20, no. 4, pp. 239-253.
© Efimochkina N.R., Stetsenko V.V., Markova Yu.M., Minaeva L.P., Bykova I.B., Pichugina T.V., Sheveleva S.A., 2019
Natalya R. Efimochkina - Doctor of Biological Sciences., Leading researcher at the Laboratory for Biosafety and Nutrim-icrobiome Analysis (e-mail: karlikanova@ion.ru; tel.: +7 (495) 698-53-83; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-9071-0326).
Valentina V. Stetsenko - Junior researcher at the Laboratory for Biosafety and Nutrimicrobiome Analysis (e-mail: stet-senko_valentina1992@mail.ru; tel. +7 (495) 698-53-83; ORCID: http://orcid.org/0000-0001-6470-171X).
Yulia M. Markova - Candidate of Biological Sciences, Researcher at the Laboratory for Biosafety and Nutrimicrobiome Analysis (e-mail: yulia.markova.ion@gmail.com; tel.: +7 (495) 698-53-83; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-2631-6412).
Liudmila P. Minaeva - Candidate of Technical Sciences, Senior researcher at the Laboratory for Biosafety and Nutrimicrobiome Analysis (e-mail: liuminaeva-ion@mail.ru; tel.: +7 (495) 698-53-83); ORCID: http://orcid.org/0000-0003-1853-5735).
Irina B. Bykova - Researcher at the Laboratory for Biosafety and Nutrimicrobiome Analysis (e-mail: bikova@ion.ru; tel.: +7 (495) 698-53-83; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7288-312X).
Tatiana V. Pichugina - Candidate of Technical Sciences, Researcher at the Laboratory for Biosafety and Nutrimicrobiome Analysis (e-mail: bbtvp@ion.ru; tel.: +7 (495) 698-53-83; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-4632-7119).
Svetlana A. Sheveleva - Doctor of Medical Sciences, Head of the Laboratory for Biosafety and Nutrimicrobiome Analysis (e-mail: sheveleva@ion.ru; tel.: +7 (495) 698-53-83; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-5647-9709).
14. Rao M.V. Acidified Sodium Chlorite (ASC). Chemical and Technical Assessment. Prepared for the 68th the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. JECFA, 2007, 12 p. Available at: http://www.fao.org/fileadmin/temp-lates/agns/pdf/jecfa/cta/68/Acidified_Sodium_Chlorite.pdf (20.07.2019).
15. Oyarzabal O.A. Reduction of Campylobacter spp. by commercial antimicrobials applied during the processing of broiler chickens: a review from the United States perspective. J. Food Prot, 2005, vol. 68, pp. 1752-1760. DOI: 10.4315/0362-028x-68.8.1752
16. The global view of campylobacteriosis: report of an expert consultation, Utrecht, Netherlands, 9-11 July 2012. World Health Organization, 2013, 69 p. Available at: https://apps.who.int/iris/handle/10665/80751 (20.07.2019).
17. Stetsenko V.V., Efimochkina N.R., Pichugina T.V. Osobennosti rosta i persistentsii Campylobacter jejuni v pishchevykh produktakh [Peculiarities of Campylobacter jejuni growth and persistence in food products]. Byulleten ' eksperimen-tal'noi biologii i meditsiny, 2018, vol. 166, no. 12, pp. 723-730 (in Russian).
18. Efimochkina N.R., Stetsenko V.V., Bykova I.B., Polyanina A.S., Aleshkina A.S., Sheveleva S.A. Osobennosti kul'tiviro-vaniya i khraneniya bakterii roda Campylobacter v usloviyakh in vitro [Peculiarities of cultivating and storing Campylobacter bacteria in in vitro conditions]. Byulleten'eksperimental'noi biologii i meditsiny, 2017, vol. 164, no. 7, pp. 81-88 (in Russian).
19. Efimochkina N.R., Bykova I.B., Korotkevich Yu.V., Markova Yu.M., Minaeva L.P., Sheveleva S.A. Study of tolerance of enterobacteria to chlorine-based biocides in experimental models using chromogenic indicator tests. Health Risk Analysis, 2015, no. 3, pp. 73-82 (in Russian). DOI: 10.21668/health.risk/2015.3.11.eng
20. Efimochkina N.R., Bykova I.B., Markova Yu.M., Korotkevich Yu.V., Stetsenko V.V., Minaeva L.P., Sheveleva S.A. Formirovanie bioplenok pishchevymi patogenami i razrabotka na ikh osnove laboratornoi modeli in vitro dlya issledovaniya bakterii roda Campylobacter [Food pathogens forming biofilms and an in vitro laboratory model based on such films and applied to examine bacteria from Campylobacter family]. Byulleten' eksperimental'noi biologii i meditsiny, 2016, vol. 162, no. 10, pp. 470-475 (in Russian).
Efimochkina N.R., Stetsenko V. V., Markova Yu.M., Minaeva L.P., Bykova I.B., Pichugina T. V., Sheveleva S.A. Assessing sensitivity of Campylobacter jejuni to anti-microbe effects to reduce risks offood prodycts contamination with campylobacteriosis agents. Health Risk Analysis, 2019, no. 4, pp. 139-147. DOI: 10.21668/health.risk/2019.4.15.eng
Получена: 25.07.2019
Принята: 13.12.2019
Опубликована: 30.12.2019
