CC BY
18
Исследование цитостатических и цитотоксических s
свойств модифицированных пептидных ингибиторов CDK4 / 6, Г" функциональных аналогов p16INK4a (90-97)
us
В.К. Боженко, Т.М. Кулинич, Е.А. Кудинова, А.В. Иванов, А.М. Шишкин, В.А. Солодкий Ц
ФГБУ«Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России; Россия, 117997Москва, ул. Профсоюзная, 86
в!
Контакты: Владимир Константинович Боженко vbojenko@mail.ru
и
ш
Введение. Использование методов математического моделирования для поиска биологически активных молекул — перспективное в
направление современной науки. Применение численных алгоритмов для оптимизации пептидных последовательностей и методов ® молекулярной динамики позволило получить модифицированные пептидные последовательности, являющиеся функциональными аналогами последовательности естественного ингибитора циклиновой киназы 4/6 — p16INK4a.
Цель исследования — определение биологических свойств пептидных последовательностей, ингибиторов CDK4/6, полученных с помощью методов математического моделирования. g Материалы и методы. Исследования проведены в условиях in vitro на линиях опухолевых клеток (MCF-7, А549, SKOV-3, НСТ116). в Методом проточной цитофлуориметрии были определены уровень апоптоза, распределение клеток по фазам клеточного цикла, изменение экспрессии белка Bcl-2, изменение уровня фосфорилированного pRb при воздействии на клетки исследуемых пептидных _ последовательностей. С помощью биосенсорной технологии RTCA iCELLIgence проведена оценка динамики пролиферации клеточ- ав ных популяций. в Результаты. Пептидные последовательности, полученные с помощью методов математического моделирования, при воздейст- е вии на активно пролиферирующие клетки вызывают снижение уровня фосфорилированного pRb, снижение экспрессии Bcl-2, ко- as торые являются молекулярными «мишенями» комплекса циклинзависимая киназа 4/6—циклин D, и изменение уровней pRb и Bcl-2 в может свидетельствовать об ингибировании образования комплекса. Как следствие, наблюдались снижение пролиферативной о активности и увеличение уровня апоптоза в клетках. Эффективность пептидных последовательностей зависела от молекуляр- п. ной структуры, типа клеточной линии, на которую происходит воздействие. Показано, что 2 исследованные модифицированные Е пептидные последовательности оказывают на опухолевые клетки антипролиферативный и проапоптотический эффекты в большей степени, чем исходная последовательность p16INK4a (90-97). ¡Й Заключение. Использование методов математического моделирования для поиска и разработки функционально активных моле- е кул позволило создать пептидные последовательности, обладающие более выраженными свойствами ингибиторов циклиновых ® киназ, чем естественный ингибитор CDK4/6 — p16INK4a. х
Ключевые слова: ингибитор циклиновых киназ, интернализуемые пептиды, циклин, метод математического моделирования
Для цитирования: Боженко В.К., Кулинич Т.М., Кудинова Е.А. и др. Исследование цитостатических и цитотоксических свойств модифицированных пептидных ингибиторов CDK4/6, функциональных аналогов р16ШК4а (90-97). Успехи молекулярной онкологии 2020;7(4):37-45.
и ш u
u
DOI: 10.17650/2313-805X-2020-7-4-37-45 (ф
Study of cytostatic and cytotoxic characteristics of modified peptide CDK4/6 inhibitors — functional analogs of p16INK4a (90-97)
V.K. Bozhenko, T.M. Kulinich, E.A. Kudinova, A. V. Ivanov, A.M. Shishkin, V.A. Solodkiy
Russian Scientific Center of Roentgenoradiology, Ministry of Health of Russia; 86Profsouznaya St., Moscow 117997, Russia
Background. Application of mathematical modeling for search for biologically active molecules is currently a promising scientific approach. Application of numerical algorithms for optimization of peptide sequences and molecular dynamics allowed to obtain modified peptide sequences that are functional analogs of the sequence of natural inhibitor of cyclin-dependent kinase 4/6 p16INK4a. The study objective is to establish biological characteristics of peptide sequences of CDK 4/6 inhibitors obtained using mathematical modeling. Materials and methods. The studies were performed in vitro using tumor cell lines (MCF-7, A549, SKOV-3, HCT116). Apoptosis level, cell distribution per cell cycle stages, changes in Bcl-2 expression, changes in the level of phosphorylated pRb under the effect of the studied molecules were investigated using flow cytometry. Proliferation dynamics of cell populations were studied using RTCA iCELLIgence biosensor technology.
Results. Peptide sequences obtained using mathematical modeling decrease the level of phosphorylated pRb, Bcl-2 expression when applied to actively proliferating cells. These proteins serve as molecular targets for the cyclin-dependent kinase 4/6—cyclin D complex, and changes in pRb and Bcl-2 levels might indicate inhibition of complex formation. Consequently, decreased proliferative activity and increased apoptosis were observed. Effectiveness of the peptide sequences depended on their molecular structure and type of the used cell line. Two (2) of the studied modified peptide sequences have higher antiproliferative and proapoptotic effect on tumor cells than native p16INK4a (90-97) sequence.
CV а CV
us
Conclusion. Application of mathematical modeling for search and development of functionally active molecules allowed to create peptide sequences with stronger cyclin-dependent kinase inhibitor effect than p16INK4a, the native inhibitor CDK4/6.
Key words: cyclin dependent kinase inhibitor, internalized peptides (cell-penetrating peptides, CPP), cyclin, mathematical modeling method
For citation: Bozhenko V.K., Kulinich T.M., Kudinova E.A. et al. Study of cytostatic and cytotoxic characteristics of modified peptide CDK4/6 inhibitors — functional analogs of p16INK4a (90-97). Uspekhi molekulyarnoy onkologii = Advances in Molecular Oncology 2020;7(4):37—45. (In Russ.).
и
Ш
u
X ш
и
Введение
Циклинзависимые киназы (cyclin-dependent kinases, CDKs) образуют семейство гетеродимерных киназ, играющих центральную роль в регуляции клеточного цикла, транскрипции и других важных биологических процессах, включая ангиогенез, протеолиз, гемопоэз, сперматогенез, репарацию повреждений ДНК, сплайсинг, регуляцию транскрипции и т. д. [1]. Первые описания CDKs характеризовали их как направленные регуляторы роста и деления клеток, контролеры прохождения клеточного цикла через последовательное фосфорилирование субстратов [2, 3]. Однако CDKs экспрессируются и обнаруживаются на всем протяжении клеточного цикла, они неактивны в мономерной форме, но, связываясь с белками семейства циклинов, образовывают функционально активные гетеродимер-ные комплексы [4, 5]. В то же время циклины, «партнеры» CDKs, имеют разный концентрационный уровень в различных фазах клеточного цикла, т. е. пространственно-временные профили активности комплексов CDK—циклин, регулируются именно цикли-нами [6]. Изменение уровней экспрессии и деградации циклинов, а также их структурные и молекулярные особенности обеспечивают способность и своевременное взаимодействие с CDKs и тем самым определяют упорядоченное формирование различных последовательных комплексов CDK—циклин на протяжении клеточного цикла.
Важную функцию регуляторов процессов пролиферации несут ингибиторы циклиновых киназ (CKIs). В настоящее время описано большое количество так называемых структурных CKIs. Наиболее изученными CKIs являются белки 2 семейств — INK4 и CIP/KIP, при взаимодействии CKIs с CDKs происходят кон-формационные трансформации последних, что препятствует образованию комплексов CDK—циклин [7]. Дисрегуляция циклиновых комплексов отмечается при многих типах онкологических заболеваний, что приводит к нарушению координации клеточного цикла и процессов пролиферации, способствует бесконтрольному клеточному росту [8]. Фактически вместе с мутациями в протоонкогенах мутации, приводящие к гиперактивации CDKs, наиболее часто обнаруживаются в геноме опухолей. Такие мутации обеспечивают клеткам преимущество в росте, а мутации генов-су-прессоров опухоли или генов, ответственных за прохождение контрольных точек (checkpoint), приводят к отсутствию контроля пролиферации [2, 9].
Структура и молекулярные механизмы регуляции CDKs достаточно хорошо изучены и описаны в настоящее время, являются научной основой для поиска и разработки лекарственных препаратов — ингибиторов CDKs. Однако большинство CDKs представляют собой трудно уязвимую терапевтическую мишень в силу своих структурных особенностей [10, 11]. Ранее нами была разработана стратегия, объединяющая методы компьютерного моделирования, белкового докинга и молекулярной динамики, направленная на поиск биологически активных пептидных конструкций, в частности ингибиторов CDK4/6 [12, 13].
С помощью методов математического моделирования нам удалось минимизировать исходную функциональную последовательность из ингибитора комплекса CDK4/6—циклин D—p16INK4a. Поисковый анализ оптимальной пептидной последовательности выполняли с помощью программной реализации модели полноатомной молекулярной динамики в неявном и явном растворителях, интеграции разработанных моделей в единую гетерогенную вычислительную систему, проведение численных расчетов — с использованием разработанной гетерогенной вычислительной системы для оптимизации пептидных последовательностей на основе белка р16ШК4а. Далее с помощью метода нормальных мод был проведен анализ комплекса р16INK4a—CDK6—циклин D, что позволило найти его собственные частоты и, используя эти значения при анализе комплексмодифициро-ванной последовательности CDK6—циклин D, рассчитать свободную энергию связи (док-баллы) для каждой из анализируемых последовательностей (всего проанализировано 40 вариантов). На основании проведенных расчетов выбраны 4 пептидные последовательности с наиболее высокими значениями энергии взаимодействия с CDK6. Данные последовательности были синтезированы, и результаты экспериментов по изучению их эффектов представлены в настоящей статье.
Цель исследования — определение биологических свойств пептидных последовательностей, ингибиторов CDK4/6, полученных с помощью методов математического моделирования.
Материалы и методы
Объектом исследования явились 4 пептидных последовательности ^26К-1, F26K-2, W26K-1, W26K-2),
потенциальные ингибиторы образования комплекса CDK4/6—циклин D, полученные с помощью методов математического моделирования. Сравнение биологических свойств проведено с пептидом, функциональным фрагментом p16INK4a (90-97) [14, 15]. Для обеспечения внутриклеточного транспорта все исследуемые последовательности включали CPP (cell-penetrating peptide) — Antennapedia (Antp).
Исследование проводили in vitro на культивируемых клетках линий опухолей человека: MCF-7 (рак молочной железы), А549 (аденокарцинома легкого), SKOV-3 (рак яичника) и НСТ116 (аденокарцинома толстой кишки). Клетки культивировали в стандарт-ныхусловиях: 37 °С, 5 % СО2, среда DMEM (ПанЭко), содержащая 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (ПанЭко), 50 мкг/мл гентамицина и 2 мМ L-глутамина. Пересев клеток осуществляли таким образом, чтобы на момент добавления к среде исследуемых пептидных последовательностей конфлюэнт-ность составляла 40—50 %.
Анализ выполняли на проточном цитофлуориме-тре Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США). Для определения уровня апоптоза и некроза использовали набор AnnexinV-FITC Kit — Apoptosis Detection Kit (Beckman Coulter, Inc, Франция). В качестве методов оценки эффективности модифицированных последовательностей с помощью моноклональных антител было проведено определение уровня белка Bcl-2 (Anti Human Bcl-2) (Caltag Laboratories, США) и уровня ги-пофосфорилированного pRb (Mouse anti-Rb (pS780); Becton, Dickinson and Company, США). Фиксацию и окраску образцов проводили в соответствии с указаниями инструкций к антителам.
Для анализа фаз клеточного цикла выполняли предварительную синхронизацию культур методом обедненной культуральной среды (24 ч 1 % ЭТС) [16], в образцах оценивали процентное распределение клеток в фазах клеточного цикла по содержанию ДНК, окраске фиксированных образцов раствором пропи-дия йодида. Анализ ДНК-гистограмм проводили с помощью программы ModFit 3.0.
Динамику пролиферации клеточных популяций оценивали с помощью биосенсорной технологии RTCA iCELLIgence (ACEA Biosciences) по изменению показателя «клеточный индекс». Принцип метода основан на измерении клеточного сопротивления электродами, располагающимися на дне лунки планшета. В присутствии клеток они присоединяются к сенсорной поверхности электрода и действуют как изолятор, что приводит к изменению локального ионного окружения на границе раствора/электрода и увеличению сопротивления. Таким образом, чем больше клеток располагается на электроде, тем сильнее меняется сопротивление этого электрода. Основным показателем, который оценивали методом RTCA iCELLIgence, является клеточный индекс (КИ), рассчитываемый по формуле:
КИ =
(импеданс в определенный момент времени п) — (импеданс в отсутствие клеток)
(номинальное значение импеданса)
Значения импеданса зависят от количества адге-зированных клеток, их размера и формы, а также от силы адгезии к субстрату.
Анализ и статистическую обработку результатов проводили с помощью функций пакетов анализа Microsoft Excel 2016 и Statistic 10. Результаты считали достоверными прир <0,05.
Результаты
Исследование проапоптотической активности. Показано, что пептидные последовательности p16INK4a-Antp, F26K-1, F26K-2, W26K-1, W26K-2 увеличивают уровень апоптоза в культурах пролиферирующих клеток. При внесении контрольной последовательности p16INK4a-Antp в концентрации 10 мкМ и инкубации в течение 24 ч увеличение уровня апоптоза наблюдалось в пределах 5 ± 1,6 %, при концентрации 40 мкМ уровень апоптоза возрастал до 34 ± 7,4 %. Исследуемые пептидные последовательности в концентрациях 10 и 40 мкМ вызывали увеличение уровня апоптоза в культурах опухолевых клеток, однако уровень апоп-тоза зависел как от структуры пептидной последовательности, так и от типа клеточной линии. На рис. 1 представлены диаграммы изменения уровня апоптоза в культурах НСТ116 и MCF-7 относительно контрольного значения — апоптоза, индуцированного внесением последовательности p16INK4a-Antp. Наибольший проапоптотический эффект на исследуемые клетки оказывали последовательности F26K-1 и F26K-2. Так, при инкубации клеток линии НСТ116 с последовательностью F26K-2 (10 мкМ) уровень апоптоза более чем в 4 раза выше, чем при инкубации с исходной последовательностью p16INK4a-Antp (10 мкМ) (см. рис. 1а).
При исследовании уровня апоптоза клеток линии MCF-7 (см. рис. 1б) показана большая их чувствительность к воздействию естественного ингибитора CDK4/6 (p16INK4a-Antp), уровень апоптоза при инкубации в течение 24 ч с p16INK4a-Antp в концентрации 10 мкМ составил 24 ± 2,9 %, что статистически значимо выше, чем при воздействии p16INK4a-Antp в той же дозе на клетки НСТ116 (5 ± 1,6 %). Искусственные ингибиторы CDK4 / 6 (F26K-1, F26K-2, W26K-1, W26K-2) в концентрации 10 мкМ оказывали меньший проапоптотический эффект, чем p16INK4a-Antp. Более высокий уровень апоптоза наблюдался только при воздействии последовательностей F26K-1 и F26K-2 в концентрации 40 мкМ. Апоптоз, индуцируемый последовательностями W26K-1, W26K-2, в обеих исследуемых концентрациях был ниже, чем при воздействии последовательности естественного ингибитора CDK4/6.
Таким образом, для культур НСТ116 и MCF-7 было получено, что пептидная последовательность
CV а CV
ев
и ш u
х ш
и
CV а CV
us
НСТ116
MCF-7
И
ш u
X ш
и
о и
m -О
ь I
<и S т S
60 50 40 30 20 10 0
p16INK4a-Antp F26K-1 F26K-2 W26K-1 W26K-2
60
50
А549
40
А
* Q.
30
а 20
m -о 10
щ э т S
гтгг
p16INK4a-Antp F26K-1 F26K-2 W26K-1 W26K-2
10 мкМ / 10 vM
0
70 60 50 40 30 20
10
0
p16INK4a-Antp F26K-1 F26K-2 W26K-1 W26K-2
60
50
40
30
20
10
0
SKOV-3
p16INK4a-Antp F26K-1 F26K-2 W26K-1 W26K-2 40 мкМ / 40 vM
Рис. 1. Сравнение уровней апоптоза в культурах клеток НСТ116 (а), MCF-7 (б), А549 (в) и SKOV-3 (г) при инкубации с естественным ингибитором CDK4/6 (p16INK4a-Antp) и пептидными последовательностями, полученными с помощью методов математического моделирования (F26K-1, F26K-2, W26K-1, W26K-2), искусственными ингибиторами CDK4/6, в концентрациях 10 и 40 мкМ. Время инкубации 24 ч Fig. 1. Comparison of apoptosis levels in cultures of НСТ116 (а), MCF-7 (б), А549 (в) and SKOV-3 (г) cells incubated with native CDK4/6 inhibitor CDK4/6 (p16INK4a-Antp) and artificial CDK 4/6 inhibitors — peptide sequences obtained using mathematical modeling (F26K-1, F26K-2, W26K-1, W26K-2); concentrations were 10 and 40 pM. Duration of incubation was 24 hours
F26K-2 (H-Phe-Leu-Asp-Ala-Ile-Leu-Leu-Ile-Ahx) обладает наиболее выраженным проапоптотическим действием по сравнению с естественным ингибитором CDK4/6—циклин D (p16INK4a-Antp) и другими исследованными последовательностями.
При исследовании проапоптотического эффекта пептидных последовательностей на культуры А549 и SKOV-3 показано, что в отношении данных культур наибольшую эффективность оказывают последовательности F26K-1 и W26K-1 (см. рис. 1в, г). Так, для культуры А549 при концентрации последовательностей 40 мкМ и времени инкубации 24 ч уровень апоптоза имел значения 43,5 ± 4,8 и 52,1 ± 5,7 % соответственно для последовательностей F26K-1 и W26K-1 ; при воздействии на клетки p 16INK4a-Antp уровень апоптоза составил 33,8 ± 8,4 %. Уровень апоптоза клеток линии SKOV-3 повышался до 41,8 ± 6,2 % при 24-часовой инкубации с F26K-1 (40 мкМ) и до 45,2 ± 8,9 % при воздействии W26K-1 (40 мкМ); количество апоптотических частиц в образцах, инкубированных в течение 24 ч с контрольной последовательностью p16INK4a-Antp (40 мкМ), составило 37,6 ± 5 %.
Исследование цитостатического эффекта. Анализ цитостатической активности исследуемых ингибиторов CDK4/6 проводили на предварительно синхронизованных в G0-фазе клетках, исследуемые пептиды вносили в культуральную среду одновременно со снятием блока синхронизации. Изменения пролифера-тивной активности клеток оценивали методом проточной цитометрии и с помощью системы RTCA iCELLIgence. Оценка ДНК-гистограмм распределения клеток по фазам клеточного цикла, полученных с помощью метода проточной цитофлуориметрии, показала, что исследуемые последовательности, ингибиторы CDK4/ 6, способны снижать пролиферативную активность делящихся клеток (см. таблицу, рис. 2а, б).
Данный эффект выражается в снижении количества клеток в фазах клеточного цикла S и G2/M, причем наибольшие различия обнаружены между значениями S-фазы опытных образцов и контрольных образцов после 6 ч снятия блока синхронизации и инкубации опытных образцов с исследуемыми последовательностями. В образцах негативного контроля (без воздействия исследуемых последовательностей)
б
а
в
г
100
-о Е
80
60
40
а 20
с
о
g2/m
40 80 120 160 200
Содержание ДНК (PI/FI3) / DNA level (PI/FI3)
160
S 120
80
40
.................
200 400 600 800 100 Содержание ДНК (PI/FI3) / DNA level (PI/FI3)
cv a cv
CS
и ш u
% з
e
тз
<U
р
о Н
2,08
7,08
17,08
22,08 27,08 Время, ч / Time, h
32,08
37,08
42,08
47,08
Рис. 2. Изменение пролиферативной активности клеток культур MCF-7 и А549 при воздействии исследуемых пептидных ингибиторов CDK4/6: а — гистограмма распределения клеток по фазам клеточного цикла в контрольных образцах линии MCF-7 через 6 ч после снятия блока синхронизации (Gg/G1—10,52 %; G2/M — 10,84 %; S-фаза — 78,63 %); б — гистограмма распределения клеток по фазам клеточного цикла в образцах линии MCF-7 при воздействии пептидной последовательности F26K-2 в концентрации 40 мкМ через 6 ч после снятия блока синхронизации (G0/G— 71,97 %; G/M — 8,76 %; S-фаза — 19,27 %); в — изменение нормированного клеточного индекса, определяемого с помощью биосенсорной технологии RTCA iCELLIgence. По оси ординат — показатель «клеточный индекс», определяемый на основе непрерывного измерения импеданса в ячейке с клеточной культурой A549. Красная кривая соответствует интактной культуре (негативный контроль), зеленая — культуре с добавлением CPP (cell-penetratingpeptide) — Antennapedia — интернализуемого вектора (10мкМ), синяя — последовательность F26K-2 (10мкМ), сиреневая — W26K-2 (10 мкМ)
Fig. 2. Changes in proliferative activity of MCF-7 and А549 cell cultures under the effect of the studied peptide CDK 4/6 inhibitors: а — histogram of cell distribution per cell cycle stages in the control samples of MCF-7 line 6 hours after synchronization block removal (Gg/G1—10.52 %; G2 /M — 10.84 %; S-phase — 78.63 %); б — histogram of cell distribution per cell cycle stages in the MCF-7 cell line under the effect of 40 ^M of F26K-26 hours after synchronization block removal (G0/G1—71.97 %; G2/M — 8.76 %; S-phase — 19.27 %); в — changes in normalized cell index determined using RTCA iCELLIgence biosensor technology. Y-axis — cell index determined using continuous impedance measurement in a well with A549 cell culture. Red line shows intact culture (negative control), green — culture with CPP (cell-penetratingpeptide) — Antennapedia — internalization vector (10 ^M), blue — F26K-2 sequence (10 цШ), purple — W26K-2 (10 цШ)
X ш
и
а
S
S
g2/m
0
0
0
0
в
в интервале от 0 до 6 ч после снятия блока синхронизации был отмечен рост количества клеток в S-фазе от 4,6 ± 3 % в нулевой точке до 71,3 ± 6,5 % через 6 ч, после чего наступало снижение уровня S-фазы (см. таблицу).
При добавлении исследуемых пептидных последовательностей в концентрации 40 мкМ средний уровень S-фазы после 6 ч инкубации составил 19,2 ± 4 %, причем достоверных различий между значениями для разных последовательностей и исследуемых
клеточных культур не отмечено. При исследовании воздействия концентрации 10 мкМ с помощью метода проточной цитометрии значимых различий между негативным контролем и опытными образцами не получено.
Анализ распределения популяций по фазам клеточного цикла показал, что внесение в культуральную среду исследуемых последовательностей приводит к задержке «входа» клеток в S-фазу. Если в образцах негативного контроля (не подвергшихся воздействию
CV а CV
us
Средние значения количества клеток в S-фазе клеточного цикла в зависимости от времени инкубации в культурахHCT116, MCF-7, A549, SKOV-3 при воздействии пептидных последовательностей, ингибиторов CDK6, в концентрации 40мкМ, %
Mean cell numbers in the S-phase depending on incubation time in HCT116, MCF-7, A549, SKOV-3 cell lines under the effect of 40 pM of peptide sequences — CDK6 inhibitors, %
Клеточная культура Пептидная последовательность, концентрация, мкМ Время инкубации, ч Incubation time, h
Cel1 Une Peptide sequence concentration, дМ 0 2 4 6 8 10 12
Негативный контроль Negative control 5,2 17,8 36,1 62,8 42,1 38,1 29,4
p16INK4a, 40 2,6 3,2 10,6 21,5 39,5 33,1 16,05
НСТ116 F26K-1, 40 4,8 4,2 8,4 19,7 34,2 26,2 14,05
F26K-2, 40 5,3 2,8 9,1 24,7 43,5 31,6 16,9
W26K-1, 40 1,9 5,6 10,5 25 40,2 31,6 17,75
W26K-2, 40 3,1 3,1 11,2 22,4 42,6 35,9 16,8
Негативный контроль Negative control 5,6 16,2 42,1 78,6 54,1 28,1 40,3
p16INK4a, 40 3,7 6,5 12,6 17,5 32,4 32,5 12,05
MCF-7 F26K-1, 40 4,2 4,8 15,8 16 21,6 28,4 15,9
F26K-2, 40 6,9 5,6 12,3 19,3 30,2 32,2 15,8
W26K-1, 40 3,3 3,9 11,4 18,3 26,4 27,4 12,35
W26K-2, 40 4,8 6,1 12,2 16,4 32,8 26,4 14,3
Негативный контроль Negative control 2,4 9,7 32,9 71,2 43,2 25,7 32,5
p16INK4a, 40 3,7 6,1 13,8 21,5 32,6 33,6 17,65
А549 F26K-1, 40 6,1 7,2 10,6 16,3 21,6 28,9 13,45
F26K-2, 40 4,2 5,3 14,3 19,4 29,5 29 16,85
W26K-1, 40 6,4 6,6 13,5 21,3 31,4 35,1 17,4
W26K-2, 40 3,1 5,7 14,6 23,2 29,7 31,5 18,9
Негативный контроль Negative control 4,3 14,2 32,5 72,5 45,1 35,6 35,4
p16INK4a, 40 4,6 3,9 13,6 19,5 32,7 36,1 16,55
SKOV-3 F26K-1, 40 7,2 3,6 12,1 18,3 33,4 35 15,2
F26K-2, 40 5,4 5,1 12,9 16,2 41,5 38,4 14,55
W26K-1, 40 6,6 3,8 10,4 21,2 42,2 41,9 15,8
W26K-2, 40 5,3 4,3 13,7 16,9 39,4 32,1 15,3
И Ш
u
X ш
и
исследуемых последовательностей) доля клеток в S-фaзе начинает возрастать сразу после снятия блока синхронизации и увеличивается с 4,4 ± 1,4 % в нулевой точке до 14,5 ± 3,5 % через 2 ч, то в опытных образцах с пептидными ингибиторами CDK6 доля популяции клеток в S-фaзе возрастает только через 8 ч после исключения синхронизирующего фактора. Таким образом, определена задержка на уровне первой рестрикционной точки, переход G1—S. В исследова-
ниях изменений распределения клеток по фазам клеточного цикла, проведенных методом проточной ци-тометрии, не выявлено значимых различий между воздействием пептидных последовательностей.
С помощью биосенсорной технологии RTCA iCELLIgence было показано достоверное различие в пролиферативной активности клеток, подвергшихся воздействию исследуемых ингибиторов CDK6. На рис. 2в представлен пример графика изменения
нормированного клеточного индекса, определяемого с помощью биосенсорной технологии RTCA iCELLIgence. Показано, что последовательности F26K-2, W26K-2 в концентрации 10 мкМ способны вызывать угнетение пролиферации, выражающееся в отсутствии роста показателя клеточного индекса, данный эффект был
1,2 1,1
о Q.
<ч "о
со о
-о Е з с
£
- p16INK4a-Antp
- F26K-1
F26K-2
-W26K-1
-W26K-2
0,9 0,8 0,7
I £ 0,6 -О \
5 g
£ £ 0,5
и £ § §
П 0,4
° 0 10 40
Концентрация последовательностей, мкМ / Peptide concentration, jM
Рис. 3. Изменение относительного уровня экспрессии белка Bcl-2 в клетках линии НСТ116 при инкубации с последовательностямиp16INK4a-Antp, F26K-1, F26K-2, W26K-1, W26K-2. За «1» принято значение уровня Bcl-2 в образцах негативного контроля, не подвергшихся воздействию исследуемых пептидных последовательностей — ингибиторов CDK4/6. Время инкубации 24 ч
Fig. 3. Changes in relative expression level of Bcl-2 in НСТ116 cell line after incubation with p16INK4a-Antp, F26K-1, F26K-2, W26K-1, W26K-2 sequences. Level of Bcl-2 in negative control samples without treatment with the studied peptide sequences — CDK4/6 inhibitors are denoted as 1. Incubation time was 24 h
продемонстрирован для всех исследуемых клеточных культур. Последовательности F26K-1 и W26K-1 также оказывали цитостатический эффект, выражающийся в снижении клеточного индекса, однако при концентрации 10 мкМ эффект был слабее и происходило незначительное увеличение клеточного индекса (от 1,5 до 1,8). При концентрации 40 мкМ последовательности F26K-1 и W26K-1 оказывали стойкий цитостати-ческий эффект.
Оценка специфической эффективности пептидных ингибиторов CDK6. Исследование специфической эффективности пептидных ингибиторов CDK6 включало определение уровня белка Вс1-2 и уровня фосфо-рилированного pRb в клетках НСТ116. Культура НСТ116 была выбрана на основании ранее проведенных собственных исследований и данных литературы, показывающих, что пролиферация клеток НСТ116 эффективно блокируется ингибиторами CDKs, в том числе р16ШК4а [17, 18]. Методом проточной ци-тофлуориметрии была проведена оценка изменения уровня белка Вс1-2 в клетках линии НСТ116. Показано, что последовательности F26K-1, F26K-2, W26K-2 способны ингибировать экспрессию белка Вс1-2, достоверно снижая уровень Вс1-2 более чем на 20 % (рис. 3). Для последовательностей р16ШК4а-АМр и W26K-1 в концентрациях 10 и 40 мкМ не получено достоверных различий в уровне Вс1-2 по сравнению с негативным контролем.
Результаты проведенного исследования изменения уровня фосфорилированного pRb при воздействии на клетки НСТ116 пептидных ингибиторов CDK4/6 показали, что все исследуемые последовательности
CV а CV
ев
и ш u
х ш
и
Контроль / Control
p16INK4a-Antp
F26K-1
F26K-2
W26K-1
W26K-2
0 4 6 8
Время инкубации, ч / Incubation time, h
Рис. 4. Оценка изменений уровня фосфорилированного pRb в клетках линии НСТ116 при воздействии пептидных последовательностей p16INK4a-Antp, F26K-1, F26K-2, W26K-1, W26K-2 в концентрациях 40мкМ. Анализ проведен через 4, 6 и 8 ч после снятия блока синхронизации Fig. 4. Evaluation of the changes in phosphorylatedpRb levels in НСТ116 cell line under the effect of 40^M of p16INK4a-Antp, F26K-1, F26K-2, W26K-1, W26K-2peptides. Analysis was performed 4, 6 and 8 h after synchronization block removal
CV а CV
us
и ш u
(р16ШК4а-ЛПр, Б26К-1, F26K-2, W26K-1, W26K-2) ингибируют процессы фосфорилирования pRb. Уровень фосфорилированного pRb в клетках негативного контроля достоверно возрастал после снятия блока синхронизации и увеличивался с 21,5 ± 4,2 % в нулевой точке до 48,5 ± 7,2 % после 8 ч инкубации. В образцах с пептидными последовательностями показано отсутствие достоверных изменений уровня pRb в течение 8 ч инкубации, уровень фосфорилированного pRb в опытных образцах составил 20,6 ± 2,6 % (рис. 4).
Результаты изменений экспрессии Вс1-2 и pRb, увеличение уровня апоптоза и замедление процессов пролиферации, индуцируемые внесением в культу-ральную среду исследуемых пептидных последовательностей — ингибиторов образования комплекса CDK4/6—циклин D, могут свидетельствовать о их направленном воздействии на активность CDKs.
Обсуждение
Таким образом, в ходе проведенных исследований показано, что исследованные пептидные последовательности ^26К-1, F26K-2, W26K-1, W26K-2), полученные с помощью методов математического моделирования, ингибируют мишень комплекса CDK4/6— циклин D—pRb и, как следствие, оказывают цитоста-тический эффект на пролиферирующие клетки. Полученные результаты позволяют утверждать, что дан-
ные последовательности обладают специфическими свойствами исходной биологической последовательности — функционального фрагмента р16ШК4а — и являются эффективными ингибиторами CDK4 /6 [19, 20]. Полученные результаты также показали, что эффективность искусственных ингибиторов CDKs во многом зависит от структуры пептидной последовательности, а также от типа исследуемой клеточной линии и имеет четкую концентрационную зависимость. При сравнении проапоптотических и цитоста-тических свойств установлено, что W26K-1 является наиболее слабой последовательностью, остальные пептиды ^26К-1, F26K-2, W26K-2) по эффективности превосходят естественный ингибитор CDK4/6 — функциональный фрагмент р16ШК4а.
Заключение
Показана перспективность использования методов математического моделирования для поиска и разработки функционально активных пептидных молекул. Полученные модифицированные пептидные последовательности (8 аминокислот) не только обладают свойствами СКЬ, но и превосходят по эффективности естественный ингибитор р16ШК4а, что позволяет рассматривать их как потенциальные кандидаты при разработке таргетных противоопухолевых препаратов.
литература/references
X ш
и
1. Ding L., Cao J., Lin W. et al. The roles of cyclin-dependent kinases in cell-cycle progression and therapeutic strategies in human breast cancer. Int J Mol Sci 2020;21(6):1960.
DOI: 10.3390/ijms21061960.
2. Ермак А.В., Ефременко Е.С. Циклины и циклинзависимые киназы. Роль
в развитии опухолевых заболеваний. Новое слово в науке и практике: гипотезы и апробация результатов исследований. Сборник материалов XXX Международной научно-практической конференции. Под общ. ред. С.С. Чернова. 2017. [Ermak A.V., Efremenko E.S. Cyclins and cyclin-dependent kinases. Role in development of tumors. Advances in science and practical applications: hypotheses and approbation of research results. Proceedings of the XXX international scientific and practical conference. General ed. S.S. Chernov, 2017. (In Russ.)].
3. Asghar U., Witkiewicz A.K., Turner N.C., Knudsen E.S. The history and future
of targeting cyclin-dependent kinases in cancer therapy. Nat Rev Drug Discov 2015;14(2):130-46. DOI: 10.1038/nrd4504.
4. Chung M., Liu C., Yang H.W. et al. Transient hysteresis in CDK4/6 activity underlies passage of the restriction point in G1. Mol Cell 2019;76(4):562-73.e4. DOI: 10.1016/j.molcel.2019.08.020.
5. Kernan J., Bonacci T., Emanuele M.J. Who guards the guardian? Mechanisms that restrain APC/C during the cell cycle. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res 2018;1865(12):1924-33.
DOI: 10.1016/j.bbamcr.2018.09.011.
6. Palou R., Malik A., Palou G. et al. G1 cyclin driven DNA replication. Cell Cycle 2015;14(24):3842-50.
DOI: 10.1080/15384101.2015.1070995.
7. Cuomo M.E., Platt G.M., Pearl L.H., Mittnacht S. Cyclin-cyclin-dependent kinase regulatory response is linked
to substrate recognition. J Biol Chem
2011;286(11):9713-25.
DOI: 10.1074/jbc.M110.173872.
8. Galbraith M.D., Bender H., Espinosa J.M. Therapeutic targeting of transcriptional cyclin-dependent kinases. Transcription 2019;10(2):118-36. DOI: 10.1080/21541264.2018.1539615.
9. Goel S., DeCristo M.J., Watt A.C. et al. CDK4/6 inhibition triggers anti-tumour immunity. Nature 2017;548(7668):471-5. DOI: 10.1038/nature23465.
10. Martin M.P., Endicott J.A., Noble M.E.M. Structure-based discovery of cyclin-dependent protein kinase inhibitors. Essays Biochem 2017;61(5):439-52.
DOI: 10.1042/EBC20170040.
11. Li Z., Ivanov A.A., Su R. et al.
The OncoPPi network of cancer-focused protein-protein interactions to inform biological insights and therapeutic strategies. Nat Commun 2017;8:14356. DOI: 10.1038/ncomms14356.
12. Kazennov A., Alekseenko A., Bozhenko V. et al. Evaluation of CDK6 and p16/ INK4a-derived peptides interaction. Wiley Interdisciplinary Reviews. Computat Mol Sci 2013;3:53.
13. Bozhenko V.K., Kulinich T.M., Kudinova E.A. New targeted anti CDK4. J Clin Oncol 2013;31:e13545.
14. Кулинич Т.М., Боженко В.К. Исследование особенности активации апоптоза пептидом — ингибитором циклиновых киназ MM-D37K в клетках линии аденокарциномы толстой кишки НТ29. Вестник Российского научного центра рентгенорадиологии 2015;15(3):3. [Kulinich T.M., Bozhenko V.K. Investigation of apoptosis activation by MM-D37K cyclin kinase inhibitor peptide in colon adenocarcinoma HT29 cells.
Vestnik Rossiyskogo nauchnogo tsentra rentgenoradiologii = Bulletin of the Russian Scientific Center of Roentgeno-radiology 2015;15(3):3. (In Russ.)].
15. Кулинич Т.М., Харченко В.П., Филясова Е.И. и др. Цитостатические и цитотоксические свойства химерных пептидов, содержащих циклинингиби-рующие фрагменты. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2008;145(1):43-7. [Kulinich T.M., Kharchenko V.P., Filyasova E.I. et al. Cytostatic and cytotoxic properties
of chimeric peptides containing cyclin-inhibiting fragments. Byulleten' eksperimental'nojy biologii i meditsiny = Bulletin of Experimental Biology and Medicine 2008;145(1):43-7. (In Russ.)].
16. Боженко В.К., Шрамова Е.И., Кулинич Т.М. и др. Синхронизация клеточных культур (лекция). Вестник Российского научного центра рентге-норадиологии 2018;18(2):4. [Bozhenko V.K., Shramova E.I., Kulinich T.M. et al.
Synchronization of cell cultures (lecture). Vestnik Rossiyskogo nauchnogo tsentra rentgenoradiologii = Bulletin of the Russian Scientific Center of Roentgenoradiology 2018;18(2):4. (In Russ.)].
17. Le Franjois B.G., Maroun J.A., Birnboim H.C. Expression of thymidylate synthase in human cells is an early G1 event regulated by CDK4 and p16INK4a but not E2F. Br J Cancer 2007;97(9): 1242-50. DOI: 10.1038/sj.bjc.6604020.
18. Кулинич Т.М. Исследование антипро-лиферативной активности интернали-зуемых пептидов, содержащих фрагменты ингибиторов циклиновых киназ р16INК4А и р2laР/КIР. Дис. ... канд. мед. наук. ГУ «Российский онкологический научный центр РАМН». М., 2006. [Kulinich T.M. Study of the anti-proliferative activity of internalized peptides containing fragments
of cyclin kinase inhibitors р16ГЫК4а and p21CIP/KIP. Diss. ... candidate of medical
sciences. Russian cancer research center of the Russian Academy of Medical Sciences. Moscow, 2006. (In Russ.)].
19. Ohtani N., Yamakoshi K., Takahashi A., Hara E. The p16INK4a-RB pathway: molecular link between cellular senescence and tumor suppression. J Med Invest 2004;51(3-4):146-53.
DOI: 10.2152/jmi.51.146.
20. Кулинич Т.М., Шишкин А.М., Иванов А.В. и др. Исследование противоопухолевых свойств пептидных последовательностей, ингибиторов взаимодействия циклина D1 и циклин-зависимых киназ 4/6. Российский биотерапевтический журнал 2018;17(S): 38-40. [Kulinich T.M., Shishkin A.M., Ivanov A.B. et al. Investigation
of antitumor properties of peptide sequences, inhibitors of interaction between cyclin D1 and cyclin-dependent kinases 4/6. Rossiyskiy bioterapevticheskiy zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2018;17(S):38-40. (In Russ.)].
cv a cv
es
и ш u
Вклад авторов
В.К. Боженко: разработка дизайна исследования, анализ результатов;
Т.М. Кулинич: проведение экспериментальных исследований, обработка полученных результатов, написание текста рукописи; Е.А. Кудинова: анализ научной литературы по теме статьи, редактирование текста рукописи;
A.В. Иванов, А.М. Шишкин: проведение экспериментальных исследований, обработка полученных результатов;
B.А. Солодкий: разработка дизайна исследования, анализ результатов, редактирование текста рукописи. Authors' contributions
V.K. Bozhenko: developing the research design, analysis of results;
T.M. Kulinich: experimental research, processing the results, article writing;
E.A. Kudinova: analysis of scientific literature on the topic of the article, article editing;
A.V. Ivanov, A.M. Shishkin: experimental research, processing the results; V.A. Solodkiy: developing the research design, analysis of results, article editing.
ORCID авторов / ORCID of authors
B.К. Боженко / V.K. Bozhenko: https://orcid.org/0000-0001-8351-8152 Т.М. Кулинич / T.M. Kulinich: https://orcid.org/0000-0003-2331-5753 Е.А. Кудинова / E.A. Kudinova: https://orcid.org/0000-0002-5530-0591
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Исследование выполнено при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 20-015-00068/20). Financing. The study was performed with the support of the Russian Foundation for Basic Research (project No. 20-015-00068/20).
Соблюдение прав пациентов и правил биоэтики
Протокол исследования одобрен комитетом по биомедицинской этике ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России. Протокол № 2 от 28.02.2020. Compliance with patient rights and principles of bioethics
The study protocol was approved by the biomedical ethics committee of Russian Scientific Center of Roentgenoradiology, Ministry of Health of Russia. Protocol No. 2 dated 28.02.2020.
X ш
и
Статья поступила: 09.10.2020. Принята к публикации: 14.12.2020. Article submitted: 09.10.2020. Accepted for publication: 14.12.2020.
