CC BY
36
лабораторные и экспериментальные исследования
УДК: 577.1:576.36:546.26
идентификация чувствительных к воздействию монооксида углерода молекулярных мишеней, ответственных за регуляцию G1 фазы клеточного цикла
Е.Г. Старикова, л.А. Таширева, Е.В. Бельдягина, В.В. новицкий, н.В. рязанцева
ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ, г. Томск 634050, г. Томск, Московский тракт, 2, e-mail: to-elen@yandex.ru
Проанализировано влияние СО-высвобождающего соединения CORM-2 на ключевые молекулы-регуляторы G1 фазы клеточного цикла (циклин D1, белок ретинобластомы, протеин-ингибитор р21) клеток линии Jurkat. Показано, что донор СО вызывает задержку клеток в G1 фазе клеточного цикла на фоне увеличения содержания циклина D1 и фосфорилированной формы Rb. Анти-пролиферативное действие монооксида углерода не было опосредовано повышением содержания белка р21.
Ключевые слова: монооксид углерода, G1 фаза, циклин D1, pRB, p21.
IDENTIFICATION OF SENSITIVE TO THE INFLUENCE OF CARBON MONOXIDE MOLECULAR TARGETS RESPONSIBLE
FOR G1 PHASE CONTROL OF CELLULAR CYCLE E.G. Starikova, L.A. Tashireva, E.V Beldyagina, V. V. Novitskii, N.V Ryazantseva Siberian State Medical University, Tomsk 2, Moskovsky Tract Street, 634050-Tomsk, Russia, e-mail: to-elen@yandex.ru
The influence of CO-releasing compound CORM-2 on the key molecules - regulatirs of the cellular cycle G1 phase (cyclin D1, retinoblastoma protein, protein-inhibitor р21) of Jurkat line has been analyzed in the given paper. It is shown that CO donor causes the delay of cells in G1 of the cellular cycle against the background of increasing the content of cyclin D1 and phosphorylated form Rb. Antiproliferative effect of carbon monoxide was not mediated by increasing the content of protein р21.
Key words: carbon monoxide, G1 phase, cyclin D1, pRb, p21.
Опухолевые клетки характеризуются коротким и неконтролируемым периодом пролиферации. Он-когенные события ведут к дизрегуляции клеточных процессов, ответственных за контроль клеточного цикла. Последний можно разделить на несколько стадий: G0, характеризующаяся ростом клетки до взрослого состояния; G1 - самая продолжительная стадия, в которой клетки не делятся и функционируют как субъединица ткани, к которой они принадлежат; S - стадия, необходимая для дупликации ДНК, и М фаза представляет собой митотитическое деление клеток [4].
G1 фаза является критическим периодом клеточного цикла, когда позитивные и негативные сигналы могут вмешиваться в его регуляцию. На
молекулярном уровне циклин^-зависимые киназы являются интеграторами внеклеточных сигналов. Переход из G1 в S фазу происходит под влиянием циклинов, экспрессия которых увеличивается в ответ на митогенный сигнал. Циклины D1, D2 и D3 связываются с циклин-зависимыми киназами Cdk4, Cdk6 и Cdk2 в течение G1 фазы, что приводит к фосфорилированию белка ретинобластомы Rb. Данное событие является критическим в прогрессии клеточного цикла, так как приводит к инициации транскрипции ряда генов, ответственных за прогрессию S фазы. Активность циклин-зависимых киназ может быть инактивирована протеинами, названными С<1к-ингибиторами (СК1), которые связываются с Сdk или с комплексами
циклин-cdk. К данным белкам относится протеин р21 (Waf1, Cip1), способный ингибировать комплекс Cdk-циклин G1 фазы, а также синтез ДНК за счет связывания и инактивации ядерного антигена (PCNA) пролиферирующих клеток [11].
В настоящее время активно исследуется роль монооксида углерода, признанного газовым посредником вслед за оксидом азота, в регуляции различных аспектов жизнедеятельности клетки. Монооксид углерода вовлечен в регуляцию тонуса сосудов и ангиогенеза, передачу импульсов в мозге, а также метаболизм ксенобиотиков в печеночной ткани. СО ингибирует провоспали-тельные сигнальные пути и способствует индукции антиинфламаторных и антипролиферативных механизмов. Показано, что СО ингибирует пролиферативную активность клеток поджелудочной железы, Т-лимфоцитов, гладкомышечных клеток [6, 10, 13]. Молекулярные механизмы антипро-лиферативного действия монооксида углерода не изучены. Поскольку ключевое событие прогрессии Glфазы - фосфорилирование Rb - может быть инактивировано как за счет снижения содержания циклинов, так и за счет ингибирующего влияния на комплексы Cdk-циклин белков семейства Cip/Kip, в данной работе было проанализировано влияние СО на уровень фосфорилированного Rb и содержание белков циклина D1 и р21.
Материал и методы
В настоящем исследовании было изучено влияние донора монооксида углерода на клетки линии Jurkat (T-лимфобластная лейкемия). Клетки инкубировали при температуре 37°С и 5 % СО2 в полной питательной среде, содержащей 90 % RPMI-1640 («Вектор-Бест», Новосибирск), 10 % эмбриональную телячью сыворотку («Биолот», Санкт-Петербург), инактивированную при 56°С в течение 30 мин, 0,3 мг/мл L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина. Донор монооксида углерода CORM-2 (СО - высвобождающая молекула) добавляли в среду инкубации клеток в конечной концентрации 50 мкМ, время экспозиции - 24 ч.
Для оценки распределения клеток по фазам клеточного цикла клетки подвергали пермеабили-зации и окрашиванию с использованием набора CycleTestKit («BD Bioscience», США). Далее образцы анализировали с использованием программного пакета ModFit7 для проточной лазерной цитометрии (Fax Canto2 («Beckton Dickenson»,
США)). Содержание белков циклина D1, pRb, р21 определяли методом вестерн-блот. Равное количество цельноклеточных лизатов подвергали электрофорезу в 10 % SDS полиакриламидном геле, затем осуществляли перенос белков на нитроцеллюлоз-ную мембрану. Далее мембрану блокировали 1 % желатином, трижды промывали TTBS (20 мМ/л Tris HCl, pH 7,6, 137 мМ/л NaCl, и 0,05 % Tween 20). Затем мембрану инкубировали с первичными антителами (anti-cycline D1(«Sigma», США), anti-pRb («Biosource», США), anti-p21 («Biosource», США)) в течение часа. Трижды промывали TTBS и добавляли вторичные антитела с пероксидазной меткой («Biosource», США). Для визуализации результатов исследования использовали хемилюминесцентный метод («NOVEX ECL Chemiluminescent Substrate Reagent kit», Invitrogen, США). Количественное содержание белков определяли путем подсчета интенсивности бенда на рентгеновской пленке, используя программу TotalLab v.2.01. В качестве стандарта и внутреннего контроля использовали белок глицеро-3-фосфат-дегидрогеназу («Chemicon», США), выражая содержание исследуемых протеинов как отношение сигнала определяемого белка к сигналу белка глицеро-3-фосфат-дегидрогеназы в исследуемых образцах.
Проверку нормальности распределения количественных показателей проводили с использованием критерия Колмогорова - Смирнова. Достоверность различий (р<0,05) оценивали с помощью непараметрических критериев Манна - Уитни (для независимых выборок) и Вилкоксона (для зависимых выборок). Данные представлены в виде медианы (Ме), верхнего и нижнего квартилей (Q1-Q3).
Результаты и обсуждение
Данные литературы свидетельствуют о том, что выбор клеткой между дифференцировкой, пролиферацией и апоптозом определяется в течение G1 фазы клеточного цикла [1, 5]. В проведенном нами исследовании было показано, что монооксид углерода в концентрации 50 мкМ вызывает задержку клеток линии Jurkat в G1 фазе клеточного цикла (таблица).
Прогрессия клеточного цикла эукариотических клеток регулируется за счет циклин-зависимых киназ (Cdks). Активация G1-специфических циклин-зависимых киназ (Cdk4/Cdk6 и Cdk2) приводит к запуску S фазы клеточного цикла. Регуляторными единицами Cdks являются циклины
Рис. 1. Содержание белков-регуляторов G1 фазы клеточного цикла после воздействия на клетки 50 мкМ CORM-2
D-типа ф1, D2 D3) и циклин Е, соответственно. ЦиклинD/Cdk4-Cdk6 активируются в середине 01 фазы и предшествуют активации Cdk2/циклин Е. В условиях, благоприятствующих пролиферации, фосфорилирование ЯЬ за счет Cdk в течение 01 фазы приводит к высвобождению E2F и других ЯЬ-связанных транскрипционных факторов, которые активируют транскрипцию генов S-фазы. Уровень циклинов изменяется в различные фазы клеточного цикла, а их присутствие контролирует активность циклин-зависимых киназ и клеточную пролиферацию [7].
В проведенном нами исследовании было установлено, что при воздействии на клетки донора монооксида углерода происходит достоверное увеличение уровня циклина D1 относительно такового в интактных клетках (р<0,05) (рис. 1). Остановка прогрессии 01 фазы клеточного цикла при увеличении содержания СО может быть достигнута за счет ингибирующего влияния белков семейства ^р/Юр на активный комплекс Сdk-циклин. Нами было проанализировано содержание белка р21 в клетках после воздействия на них 50 мкМ CORM-2. Было показано, что уровень данного протеина не изменяется относительно контрольных значений (р>0,05) (рис. 1). Экспрессия р21 находится под транскрипционным контролем опухолевого
супрессора р53. Промотер гена р21 содержит р53-связывающий сайт, который позволяет р53 транс-крипционно активировать р21 ген [8]. Отсутствие повышения уровня р21 может быть результатом нарушения функционирования р53 в опухолевых клетках линии Jurkat.
Для оценки эффективности действия комплекса Cdk4/6-циклин D1 нами было проанализировано содержание в клетках фосфорилированной формы протеина продукта гена супрессора опухолей ЯЬ. Данный белок представляет собой ядерный фосфопротеин, который репрессирует транскрипцию генов, ответственных за переход 01-Б фаз. и индуцирует арест клеток в 01 фазе [3]. Арест осуществляется за счет взаимодействия ЯЬ белка с протеинами, мишенями семейства E2F транкрип-ционных факторов [12]. Фосфорилированный ЯЬ присутствует в клетках на протяжении всего цикла деления клеток, нефосфорилированный и незначительно фосфорилированный белок представлен в клетках только в течение 01фазы. Дефосфорили-рование представляет собой поэтапный процесс аккумуляции частично дефосфорилированных форм ЯЬ в клетках после завершения митоза [9]. Нами было показано, что инкубация клеток линии Jurkat с донором монооксида углерода приводит к возрастанию содержания фосфорилированного ЯЬ по сравнению со значениями данного показателя в интактной культуре (р<0,05) (рис.1).
Таким образом, в нашем исследовании было продемонстрировано, что СО вызывает задержку клеток в 01 фазе клеточного цикла на фоне увеличения содержания циклина D1 и фосфори-лированной формы ЯЬ. В настоящее время опубликованы работы, свидетельствующие о том, что остановка прогрессии клеточного цикла возможна после отмены репрессорного влияния ЯЬ на транскрипционные факторы E2F. Показано, что белок ретинобластомы является транскрипционным
Таблица
распределение клеток линии Jurkat по фазам клеточного цикла под воздействием
монооксида углерода
Группы клеток Количество клеток в 01 фазе клеточного цикла, % Количество клеток в Б фазе клеточного цикла, % Количество клеток в 02 фазе клеточного цикла, %
Интактные клетки, 24 ч 55,53 (55,35-55,78) 31,97 (31,57-32,19) 14,41 (13,76-15,72)
Воздействие ТОЯМ^, 24 ч 62,33 (61,65-63,29)* 21,75 (21,22-23,35)* 15,49 (15,00-15,92)*
Примечание: * - различия статистически значимые, по сравнению с контролем после 24 ч инкубации (рх>0,05).
СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2012. № 4 (52)
репрессором экспрессии генов, транскрибируемых РНК полимеразой I и III. Так, ингибирование POLR1A гена, кодирующего каталитическую субъединицу ДНК полимеразы I, вызывало остановку прогрессии G1 фазы клеточного цикла при высоком уровне фосфорилированного Rb [2]. Полученные нами результаты свидетельствуют, что монооксид углерода может иметь прямое ингибирующее влияние на гены, участвующие в синтезе ДНК.
Работа выполнена в рамках Федеральных целевых программ «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (ГК№ 16.512.11.2087) и «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» (ГК № П1311 и ГК 14.740.11.0932).
ЛИТЕРАТУРА
1. Becker K.A., Stein J.L., Lian J.B. et al. Establishment of histone gene regulation and cell cycle checkpoint control in human embryonic stem cells // J. Cell Physiol. 2007. Vol. 210. P. 517-526.
2. Donati G., Brighenti E., ViciM. et al. Selective inhibition of rRNA transcription downregulates E2F-1: a new p53-independent mechanism
linking cell growth to cell proliferation // J. Cell Sci. 2011. Vol. 124. P. 3017-3028.
3. Giacinti C., Giordano A. RB and cell cycle progression // Oncogene. 2006. Vol. 25. P. 5220-5227.
4. Kasten M., Bartek J. Cell cycle checkpoints and cancer // Nature. 2004. Vol. 432. P. 316-323.
5. Mantel C., Guo Y., Lee M.R. et al. Checkpoint - apoptosis uncoupling in human and mouse embryonic stem cells: a source of karyotipic instability // Blood. 2007. Vol. 109. P. 4518-4527.
6. Pae H.O., Oh G.S., Choi B.M. et al. Carbon monoxide produced by heme oxygenase-1 suppresses T cell proliferation via inhibition of IL-2 production // J. Immunol. 2004. Vol. 172. P. 4744^751.
7. Poznic M. Retinoblastoma protein: a central processing unit // J. Biosci. 2009. Vol. 34. P.305-312.
8. Qin H., Yu T., Qing T. et al. Regulation of apoptosis and differentiation by p53 in human embryonic stem cells // J. Biol. Chem. 2007. Vol. 282. P. 5842-5852.
9. Rubin E., Mittnach S., Villa-Moruzzi E., Ludlow J.W. Site-specifi c and temporally regulated retinoblastoma protein dephosphorylation by protein phosphatase type I // Oncogene. 2001. Vol. 20. P. 3776-3785.
10. Schwer C.I.,Mutschler M., Stoll P. et al. Carbon monoxide releasing molecule-2 inhibits pancreatic stellate cell proliferation by activating p38 mitogen-activated protein kinase/heme oxygenase-1 signaling // Mol. Pharmacol. 2010. Vol. 77. P. 660-669.
11. Sherr CM., Roberts JM. Living with or without cyclins and cyclin-dependent kinases // Genes. Dev. 2004. Vol. 18. P. 2699-2711.
12. Wong S., Weber J.D. Deacetylation of the retinoblastoma tumour suppressor protein by SIRT1 // Biochem. J. 2007. Vol. 407. P. 451-460.
13. Zhen G., Xue Z., Zhang Z., Xu Y Carbon monoxide inhibits proliferation of pulmonary smooth muscle cells under hypoxia // Chin. Med. J. 2003. Vol. 116. P. 1804-1809.
Поступила 15.02.12
